CN117025669A - 根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法。本发明以龙葵无菌叶片为材料，通过MS培养基以及NAA、6‑BA等激素建立再生体系；通过合适的农杆菌菌液浓度和侵染时间，建立高效的转化体系；通过潮霉素抗性筛选获得转基因植株。本发明利用同一配方，同一激素浓度对不同龙葵单株进行选择，无需繁琐的不同浓度生长素的继代培养，龙葵再生培养体系是固定的，只对不同龙葵单株进行选择，能够更快速的构建遗传转化体系，龙葵利用根癌农杆菌侵染，以叶片为外植体更为迅速，侵染效率高，可有效缩短龙葵转基因植株获得的时间，可快速获得遗传转化体系，同时也节约了实验成本。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法。
背景技术
龙葵(Solanum nigrum)茄科茄属，一种兼具观赏和药用价值的一年生野生草本植物，全草高30-120cm，茎直立，多分枝，卵形或心型叶子互生，近全缘，花小白色，4－10朵成聚伞花序，球形浆果成熟时为紫黑色，具有独特的观赏价值，龙葵全株均可入药，可散瘀消肿，清热解毒，亦具有较高的药用价值。
龙葵多为多倍体，并且遗传转化体系构建困难，龙葵具有生长速度快、结实量大等特点，与遗传育种模式植物烟草属同科。但是，到目前为止并没有完善的龙葵遗传转化体系建立。因此，构建龙葵的遗传转化体系对于龙葵的基础研究和转基因育种具有重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，目的在于以龙葵叶片为实验材料，建立完善的根癌农杆菌介导的龙葵叶片遗传转化体系。
本发明提供的根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，具体技术方案如下：
包括龙葵再生体系的建立和龙葵遗传转化体系的建立，
所述龙葵再生体系的建立具体如下：
S1，获得龙葵无菌苗；
S2，对步骤S1中的龙葵无菌苗进行再生筛选和诱导；
S3，对步骤S2中获得的再生能力较强的龙葵再生苗进行生根培养；
龙葵遗传转化体系的建立具体如下：
A，对步骤S3中继代获得的龙葵组培苗的部分组织作为外植体采用含根癌农杆菌侵染液进行侵染；
B，对步骤A获得的外植体进行共培养；
C，对步骤B获得的外植体进行潮霉素筛选和分化诱导；
D，对步骤C获得的不定芽进行抗性生根诱导。
在某些实施方式中，步骤S1包括如下步骤：
S11，将龙葵种子用无菌水浸泡并冲洗，酒精浸泡并用无菌水冲洗，以及氯酸钠浸泡并用无菌水冲洗，获得消毒种子；
S12，将步骤S11中的消毒种子接种于萌发培养基中，4-6天后种子开始萌发，15天后出现2-4对真叶。
进一步，步骤S12中，萌发培养基：1/2MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，ph5.8-6.0。
在某些实施方式中，步骤S2中，以生长15天以上的龙葵叶片为外植体，所述再生筛选和诱导的培养基：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，ph5.8-6.0。
在某些实施方式中，步骤S3中，所述生根培养基：1/2MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，ph5.8-6.0。
在某些实施方式中，步骤A中，所述浸染液为采用重悬液重悬根癌农杆菌GV3101，所述重悬液为含200μmol/LAS+10mmol/L MES+10mmol/L MgCl2(PH＝5.6)的无菌水，根癌农杆菌在重悬液中的浓度为OD600＝0.2。
在某些实施方式中，步骤B中,共培养培养基为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；共培养条件为25℃暗培养2天。
在某些实施方式中，步骤C具体过程如下：所述潮霉素筛选培养基包括基础培养基和不同浓度的潮霉素；所述基础培养基：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+200mg/L特美汀，潮霉素的浓度梯度为15、18、20、22、25mg/L。
在某些实施方式中，步骤D中，抗性生根诱导培养基为：1/2MS+200mg/L特美汀。
本发明具有以下有益效果：本发明以龙葵无菌叶片为材料，通过MS培养基以及NAA、6-BA等激素建立再生体系；通过合适的农杆菌菌液浓度和侵染时间，建立高效的转化体系；通过潮霉素抗性筛选获得转基因植株。本本发明利用同一配方，同一激素浓度对不同龙葵单株进行选择，无需繁琐的不同浓度生长素的继代培养，龙葵再生培养体系是固定的，只对不同龙葵单株进行选择，能够更快速的构建遗传转化体系，龙葵利用根癌农杆菌侵染，以叶片为外植体更为迅速，侵染效率高，可有效缩短龙葵转基因植株获得的时间，可快速获得遗传转化体系，同时也节约了实验成本。本发明为今后龙葵的基因工程技术提供重要的技术保障，对龙葵的新品种培育具有重要意义，并首次建立了以龙葵叶片为外植体的遗传转化体系，获得了龙葵再生体系、龙葵高效转化体系和抗性筛选浓度，为龙葵的转基因研究奠定技术基础。
附图说明
图1是本发明实施例1中再生体系建立的结果示意图；
图2是本发明实施例2中抗生素敏感性试验结果示意图；
图3是本发明实施例2中抗生素与植株转化率关系图；
图4本发明实施例2中转基因苗中GFP转化的PCR检测结果图；
图5是本发明实施例2中转基因苗中GFP转化的荧光检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
实施例1再生体系建立
龙葵再生体系的建立具体如下：
1)获得龙葵无菌苗：采收的种子洗净晾干，置于4℃冰箱储存。播种时用无菌水浸泡并冲洗2次，置于75％酒精消毒10s，后用无菌水冲洗3次，然后置于2％次氯酸钠浸泡10min，最后用无菌水冲洗3次。将消毒的种子播种于1/2MS培养基(1/2MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，ph5.8-6.0)中，4-6天后种子开始萌发，15天后出现2-4对真叶。
2)再生体系：
a)以生长15天以上的龙葵叶片为材料，将叶片切成0.5cm*0.5cm的外植体进行再生试验。
b)愈伤组织的诱导及分化培养基：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，ph5.8-6.0；
c)生根培养基：1/2MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，ph5.8-6.0。
3)继代培养：从23株龙葵单株中选出再生能力较强的株系作为后期试验材料，剪取约2cm茎段(含节)不断进行继代。继代培养基：1/2MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，ph5.8-6.0。
本实施例通过对23株龙葵实生无菌苗进行再生试验，筛选出7个株系(分别为1、7、8、10、14、17、18)在培养基MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA中具有极高的再生效率。如图1所示，再生率100％，再生系数超过5。根再生培养基为1/2MS培养基，再生率为100％。
实施例2龙葵遗传转化体系建立
遗传转化体系构建过程：
1)龙葵外植体的获得
以实施例1中的继代得到的龙葵组培苗为材料，取龙葵叶片将其切成0.5cm*0.5cm(无叶脉)作为外植体。
2)根癌农杆菌介导的遗传转化
冻融法转化农杆菌感受态：冰上融化根癌农杆菌GV3101感受态细胞50μL，冰水混合状态时加入5μL质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；然后加入700μL无抗生素的LB培养基，28℃，200rpm，振荡培养2小时；6000rpm离心一分钟收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含50mg·L 1卡那霉素、50mg·L 1利福平和50mg·L 1庆大霉素的固体LB培养基上，倒置于28℃下培养2天，长出单克隆后，用PCR鉴定潮霉素B抗性基因。
对阳性根癌农杆菌进行活化：挑菌至5ml含50mg·L 1卡那霉素、50mg·L 1利福平和50mg·L 1庆大霉素的液体LB培养基中摇2天，取2ml菌液至20ml以上配方的液体LB培养基中摇12小时，用紫外分光光度计测定OD600的值，之后用重悬液(所用重悬液为含200μmol/L AS+10mmol/L MES+10mmol/L MgCl2(PH＝5.6)的无菌水)配置农杆菌菌液浓度为OD600＝0.2，作为转化龙葵外植体组织的侵染液。
3)龙葵转化
以生长15天以上的龙葵叶片为材料，将叶片切成0.5cm*0.5cm的外植体用上述侵染液进行侵染，侵染时间为10min，将侵染后的龙葵外植体叶片置于共培养培养基上，共培养条件为25℃暗培养2天，共培养培养基为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。
4)龙葵分化潮霉素筛选压力实验
设置潮霉素浓度梯度为15、18、20、22、25mg/L，将共培养后的龙葵叶片接种于添加不同浓度潮霉素B(Hygromycin B)的培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+200mg/L特美汀)上进行培养，定期观察叶片的生长状态，每3周更换到新的培养基上，如图2所示；由转化率结果确定外植体再分化的潮霉素抗性筛选最适浓度为18mg/L，如图3所示，即最适抗性筛选培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+200mg/L特美汀+18mg/L潮霉素。
5)抗性苗植株的获得
待抗性筛选的龙葵叶片长出1cm左右的不定芽时，将不定芽转移到生根培养基上诱导生根，得到抗性苗植株，抗性根筛选培养基：1/2MS+200mg/L特美汀。
6)PCR、琼脂糖凝胶电泳检测及荧光检测是否成功转入，并计算转化率。
以1300GFP空载体按照上述方法进行遗传转化试验，利用PCR、琼脂糖凝胶电泳对24个龙葵转基因株系检测统计转化率，并对部分材料进行荧光检测，如图4-5所示，可看出其细胞膜、细胞核均发荧光，证明了1300GFP成功转入。
上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括龙葵再生体系的建立和龙葵遗传转化体系的建立，
所述龙葵再生体系的建立具体如下：
S1，获得龙葵无菌苗；
S2，对步骤S1中的龙葵无菌苗进行再生筛选和诱导；
S3，对步骤S2中获得的再生能力较强的龙葵再生苗进行生根培养；
龙葵遗传转化体系的建立具体如下：
A，对步骤S3中继代获得的龙葵组培苗的部分组织作为外植体采用含根癌农杆菌侵染液进行侵染；
B，对步骤A获得的外植体进行共培养；
C，对步骤B获得的外植体进行潮霉素筛选和分化诱导；
D，对步骤C获得的不定芽进行抗性生根诱导。
2.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，其特征在于，步骤S1包括如下步骤：
S11，将龙葵种子用无菌水浸泡并冲洗，酒精浸泡并用无菌水冲洗，以及氯酸钠浸泡并用无菌水冲洗，获得消毒种子；
S12，将步骤S11中的消毒种子接种于萌发培养基中，4-6天后种子开始萌发，15天后出现2-4对真叶。
3.根据权利要求2所述的根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，其特征在于，步骤S12中，萌发培养基：1/2MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，ph5.8-6.0。
4.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，其特征在于，步骤S2中，以生长15天以上的龙葵叶片为外植体，所述再生筛选和诱导的培养基：MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，ph5.8-6.0。
5.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述生根培养基：1/2MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，ph5.8-6.0。
6.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，其特征在于，步骤A中，所述浸染液为采用重悬液重悬根癌农杆菌GV3101，所述重悬液为含200μmol/LAS+10mmol/L MES+10mmol/L MgCl2(PH＝5.6)的无菌水，根癌农杆菌在重悬液中的浓度为OD600＝0.2。
7.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，其特征在于，步骤B中,共培养培养基为：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；共培养条件为25℃暗培养2天。
8.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，其特征在于，步骤C具体过程如下：所述潮霉素筛选培养基包括基础培养基和不同浓度的潮霉素；所述基础培养基：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+200mg/L特美汀，潮霉素的浓度梯度为15、18、20、22、25mg/L。
9.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的龙葵遗传转化体系的构建方法，其特征在于，步骤D中，抗性生根诱导培养基为：1/2MS+200mg/L特美汀。
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| CN107099547A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-08-29 | 北京交通大学 | 转gshB基因提高龙葵毛状根Cd富集的方法 |
| KR20190116631A (ko) * | 2018-04-05 | 2019-10-15 | 원광대학교산학협력단 | 까마중의 형질전환방법 및 형질전환된 까마중 |
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| 蒋兴 等: "致瘤农杆菌对龙葵的致瘤作用及其T-DNA的转移", 《遗传学报》, vol. 10, no. 4, pages 283 - 290 * |
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