CN118207224A - 用于调控桃树枝条表型的方法和应用 - Google Patents

用于调控桃树枝条表型的方法和应用 Download PDF

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CN118207224A CN202410385295.2A CN202410385295A CN118207224A CN 118207224 A CN118207224 A CN 118207224A CN 202410385295 A CN202410385295 A CN 202410385295A CN 118207224 A CN118207224 A CN 118207224A
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程钧
郑先波
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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及TRV诱导的基因沉默方法在桃树型研究上的应用，特别是指用于调控桃树枝条表型的方法和应用。本申请研究发现两个与桃树树型相关的基因，一个是与分枝数量相关的基因，另一个是与垂枝调控相关的基因，通过分别沉默这两个基因获得分枝数多或垂枝的桃树表型，利用这两个基因可以实现对桃分枝数多少或垂枝/直立表型的调控，对获得优异果树表型提供了理论依据。

Description

用于调控桃树枝条表型的方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及TRV诱导的基因沉默方法在桃树型研究上的应用，特别是指用于调控桃树枝条表型的方法和应用。
背景技术
病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是一种通过转录后siRNAs(small interferingRNAs)介导基因沉默来研究基因功能的技术。其技术原理是将携带目的基因片段的重组病毒载体转入宿主细胞后，在RNA聚合酶(RDRP)的作用下合成dsRNA，Dicer-like protein4识别病毒产生的dsRNA，并进一步切割产生21-25nt的siRNA，siRNA的反义链再通过与RNA诱导的沉默复合体(RISC)相结合而得到激活，并与目标基因的单链mRNA特异性结合最终导致目标基因mRNA的降解，从而导致基因沉默的发生。
烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)是一类应用比较广泛，效率高且持久性好的病毒载体，能够介导基因沉默的同时不会带来病毒诱导的症状。专利CN 106755066A和专利CN 106520828 A公开了一种通过TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法可实现在小麦和玉米整个植株中沉默目的基因。
桃树型是影响果实产量和品质形成、栽培管理措施确定的基础，对桃树型调控的研究具有重要意义。树型性状由株高、分枝角度、侧枝数量等因素构成。目前，已有多个决定桃树型性状的关键基因被成功挖掘。然而，桃缺乏有效的遗传转化技术，且现有的瞬时表达方法应用范围狭窄，桃树型调控基因的功能只能在其它物种中通过异源表达的方式进行验证，这极大地限制了桃树株型调控基因的功能分析。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种用于调控桃树枝条表型的方法和应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
用于调控桃树枝条表型的方法，所述桃树树枝表型包括桃分枝表型和/或桃垂枝表型。
上述方法是通过调控基因PpMAX4和/或基因PpWEEP的表达量实现的。
上述基因PpMAX4的编码区核苷酸序列如SEQ ID No.1所示、基因PpWEEP的编码区核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
上述方法包括过表达方法和基因沉默方法。
上述方法为TRV诱导基因沉默的方法。
上述的用于调控桃树枝条表型的方法，步骤为：
（1）将种子从桃核中取出，于水中浸泡，去除种子胚根一端的种皮，然后于湿润条件下遮光萌发；
（2）分别扩增与桃树树枝表型相关的基因，获得目的片段与pTRV2质粒连接后获得重组载体；
（3）步骤（2）的重组载体经农杆菌转化后得农杆菌菌液，经真空侵染获得目标植株。
进一步的，上述步骤（1）中水中浸泡的时间为24 h；种皮为种子胚根一端1/3的种皮；遮光萌发的温度为25-29℃，时间为5-7天。
进一步的，上述步骤（2）中与桃树树枝表型相关的基因为基因PpMAX4和/或基因PpWEEP。
上述方法，具体的，在培育分枝数多的桃树中的应用，步骤为：
a. 将种子从桃核中取出，于水中浸泡24 h，然后去除种子胚根一端1/3的种皮，置于湿润环境中在25-29℃条件进行遮光萌发5-7天；
b. 以桃树叶cDNA为模板，以扩增基因PpMAX4的引物进行PCR扩增，获得目的片段与pTRV2质粒连接后获得重组载体；
c. 步骤b的重组载体经农杆菌转化后得农杆菌菌液，经真空侵染获得分枝数多的桃树植株。
在培育垂枝型桃树中的应用，步骤为：
a. 将种子从桃核中取出，于水中浸泡24 h，然后去除种子胚根一端1/3的种皮，置于湿润环境中在25-29℃条件进行遮光萌发5-7天；
b. 以桃树叶cDNA为模板，以扩增基因PpWEEP的引物进行PCR扩增，获得目的片段与pTRV2质粒连接后获得重组载体；
c. 步骤b的重组载体经农杆菌转化后得农杆菌菌液，经真空侵染获得垂枝型的桃树植株。
本发明针对多年生核果类植物株型调控基因无法快速验证功能的问题，将TRV基因沉默技术与桃种子侵染方法相结合，发明了一种能够快速的在整个桃苗植株中沉默目的基因的方法，可用于研究桃树及其它核果类果树株型调控基因的功能研究。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
与现有的桃瞬时转化技术相比，本技术产生的转化效果持续时间长，最长可达25天以上。本技术还可以验证桃树株型调控基因的功能。沉默PpMAX4基因的植株侧枝数量明显增多，平均每节的侧枝数显著高于对照。定量结果也表明在不同转化天数后转入TRV-PpMAX4植株中PpMAX4的表达量显著低于对照，说明达到了PpMAX4基因沉默的效果且沉默持续时间在25天以上。沉默PpWEEP基因的植株茎出现明显的弯曲，弯曲角度显著高于对照。定量结果也表明在不同转化天数后转入TRV-PpWEEP植株中PpWEEP的表达量显著低于对照，沉默持续时间在25天以上。类似的，本技术应用与其它核果类果树株型调控基因的功能研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为TRV诱导的PpPDS基因沉默后桃苗白化表型的观察。
图2为TRV诱导的PpMAX4基因沉默后桃苗分枝表型的观察。
图3为TRV诱导的PpWEEP基因沉默后桃苗垂枝表型的观察。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种可用于桃树型研究的TRV诱导基因沉默的方法，步骤如下：
（1）准备材料：采集自然成熟的毛桃，去除外果皮、中果皮留取桃核，并于4 ℃冷藏备用。去除外部坚硬的内果皮取出种子。挑选大小匀称且饱满的种子，室温下清水浸泡1天（24 h）。去除种子胚根一端1/3的种皮，并置于湿润纱布、温度27±2℃的条件下进行种子萌发。从置于纱布上开始计算第6 d有90%以上的种子萌发，取胚根长度在0.8-1.2 cm的种子（胚芽呈现微绿色）进行侵染实验。
（2）构建重组载体：扩增桃八氢番茄红素脱氢酶（PpPDS）基因的片段，连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到重组载体：
①cDNA合成：按照RNA提取试剂盒（诺唯赞）操作说明提取桃叶片的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照cDNA合成试剂盒（诺唯赞）操作说明合成cDNA的第一链备用。
②目的片段的扩增：设计引物，扩增PpPDS基因编码区序列如SEQ ID No.3所示（167 bp），以上述合成的cDNA为模板进行PCR扩增；
引物序列为：
PpPDS-F（SEQ ID No.4）：
5’-ATTCTGTGAGTAAGGTTACCGAATTCATGTCTCAGTGGGCTTGTGTCT-3’
PpPDS-R（SEQ ID No.5）：
5’-TCTTCGGGACATGCCCGGGCCTCGAGCTTCCATAAATAGTTTGTGGGCTT-3’
扩增程序为95℃预变性3min；30个循环的98℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；
PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；
③TRV2-PpPDS重组载体的构建：
纯化后的PCR基因片段，经KpnI-BamHI双酶切后，与经KpnI-BamHI双酶切的TRV2质粒用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50mg/LKan抗生素的LB平板培养基，37℃倒置过夜培养，长出单克隆，挑取单克隆至含有50mg/LKan抗生素的液体LB培养基中，37℃，250转每分钟震荡培养12小时，提取质粒，验证正确后备用；
（3）农杆菌转化及培养：
使用冻融法将TRV2-PpPDS、TRV2和TRV1质粒分别转入根癌农杆菌菌株 GV3101中并涂布于LB培养基（含50 mg·L-1壮观霉素、25 mg·L-1利福平（Rif））上。将此LB培养基置于28 ℃下培养2-3 d。挑取单菌落在含相同抗生素的 LB 液体培养基中 28 ℃，180 r·min-1振荡过夜（14 h），转移至50 mL离心管中25 ℃、5 000 r·min-1离心 5 min 后收获菌体，将其重悬于MES缓冲液（10 mM MES-KOH、10 mM MgCl2、100 μM的乙酰丁香酮混合溶液，pH = 5.5）中再次25 ℃、5 000 r·min-1离心5 min清洗菌体。将收集到的菌体重悬于MES缓冲液中，TRV1与TRV2以1：1混合(空载，起对照作用)，TRV1与TRV2-PpPDS以1:1混合，并将菌体浓度调至OD600 = 0.6。调配好的菌液置于室温下避光放置 3 h，在侵染前加入0.02%的SILWETL-77。
（4）桃种子侵染：步骤（1）中处理后的种子用水轻轻清洗后，去除剩余种皮。在不伤害胚芽的情况下轻轻去除一片子叶（创造伤口），并立即将种子浸入事先制备好的农杆菌菌液中，在真空压力压强0.09 Mpa下保持25 min。取出种子用滤纸吸干表面的菌液，放入装有浸湿脱脂棉的15cm×15cm的方型培养皿中 28 ℃ 恒温遮光培养。
（5）桃苗白化表型的观察
侵染后的种子在浸湿脱脂棉上28 ℃ 恒温遮光培养3天后，移栽入营养土中置正常条件下培养，于侵染15天拍照并观察白化表型，并分别取不同白化程度的叶片提取RNA，进行表达量的检测。
结果如图1所示，与对照相比，沉默PpPDS基因的桃苗叶片出现明显的白化现象。定量结果也表明白化叶片中PpPDS基因的表达量明显低于对照，且其白化效果与PpPDS基因的表达量相关。
实施例2
本实施例提供了一种培育分枝数多的桃树的方法，步骤如下：
（1）准备材料：采集自然成熟的毛桃，去除外果皮、中果皮留取桃核，并于4 ℃冷藏备用。去除外部坚硬的内果皮取出种子。挑选大小匀称且饱满的种子，室温下清水浸泡1天（24 h）。去除种子胚根一端1/3的种皮，并置于湿润纱布、温度27±2℃的条件下进行种子萌发。从置于纱布上开始计算第6 d有90%以上的种子萌发，取胚根长度在0.8-1.2 cm的种子（胚芽呈现微绿色）进行侵染实验。
（2）构建重组载体：扩增桃分枝调控基因（PpMAX4）基因的片段，连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到重组载体：
①cDNA合成：按照RNA提取试剂盒（诺唯赞）操作说明提取桃叶片的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照cDNA合成试剂盒（诺唯赞）操作说明合成cDNA的第一链备用。
②目的片段的扩增：设计引物，扩增PpMAX4基因编码区1236-1500 b.p，以上述合成的cDNA为模板进行PCR扩增；
引物序列为：
PpMAX4-F（SEQ ID No.6）：
5’- ATTCTGTGAGTAAGGTTACCGAATTCCTACAACTTCCGCCACCTCT -3’
PpMAX4-R（SEQ ID No.7）：
5’- TCTTCGGGACATGCCCGGGCCTCGAGCCATCTGCGAGCATAACCA -3’
扩增程序为95℃预变性3min；30个循环的98℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；
PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；
③TRV2-PpMAX4重组载体的构建：
纯化后的PCR基因片段，经KpnI-BamHI双酶切后，与经KpnI-BamHI双酶切的TRV2质粒用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50mg/LKan抗生素的LB平板培养基，37℃倒置过夜培养，长出单克隆，挑取单克隆至含有50mg/LKan抗生素的液体LB培养基中，37℃，250转每分钟震荡培养12小时，提取质粒，验证正确后备用；
（3）农杆菌转化与培养
使用冻融法将TRV2-PpMAX4、TRV2和TRV1质粒分别转入根癌农杆菌菌株 GV3101中并涂布于LB培养基（含50 mg·L-1壮观霉素、25 mg·L-1利福平（Rif））上。将此LB培养基置于28 ℃下培养2-3 d。挑取单菌落在含相同抗生素的 LB 液体培养基中 28 ℃，180 r·min-1振荡过夜（14 h），转移至50 mL离心管中25 ℃、5 000 r·min-1离心 5 min 后收获菌体，将其重悬于MES缓冲液（10 mM MES-KOH、10 mM MgCl2、100 μM的乙酰丁香酮混合溶液，pH = 5.5）中再次25 ℃、5 000 r·min-1离心5 min清洗菌体。将收集到的菌体重悬于MES缓冲液中，TRV1与TRV2以1：1混合(空载，起对照作用)，TRV1与TRV2-PpMAX4以1:1混合，并将菌体浓度调至OD600 = 0.6。调配好的菌液置于室温下避光放置 3 h，在侵染前加入0.02%的SILWETL-77。
（4）桃种子侵染：步骤（1）中处理后的种子用水轻轻清洗后，去除剩余种皮。在不伤害胚芽的情况下轻轻去除一片子叶（创造伤口），并立即将种子浸入事先制备好的农杆菌菌液中，在真空压力压强0.09 Mpa下保持25 min。取出种子用滤纸吸干表面的菌液，放入装有浸湿脱脂棉的15cm×15cm的方型培养皿中 28 ℃ 恒温遮光培养。
（5）桃苗分枝表型的观察
侵染后的种子在浸湿脱脂棉上28 ℃ 恒温遮光培养3天后，移栽入营养土中置正常条件下培养，于侵染28天拍照并统计桃苗分枝数量，并分别在转化10、15、 20 和25 天时取桃苗茎尖部位提取RNA，进行表达量的检测。
结果如图2所示，与WT和空载对照相比，沉默PpMAX4基因的植株侧枝数量明显增多，平均每节的侧枝数显著高于对照。定量结果也表明在不同转化天数后转入TRV-PpMAX4植株中PpMAX4的表达量显著低于对照，说明达到了PpMAX4基因沉默的效果且沉默持续时间在25天以上。
实施例3
本实施例提供了一种培育垂枝的桃树的方法，步骤如下：
（1）准备材料：采集自然成熟的毛桃，去除外果皮、中果皮留取桃核，并于4 ℃冷藏备用。去除外部坚硬的内果皮取出种子。挑选大小匀称且饱满的种子，室温下清水浸泡1天（24 h）。去除种子胚根一端1/3的种皮，并置于湿润纱布、温度27±2℃的条件下进行种子萌发。从置于纱布上开始计算第6 d有90%以上的种子萌发，取胚根长度在0.8-1.2 cm的种子（胚芽呈现微绿色）进行侵染实验。
（2）构建重组载体：扩增桃垂枝调控基因PpWEEP的片段，连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到重组载体：
①cDNA合成：按照RNA提取试剂盒（诺唯赞）操作说明提取桃叶片的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照cDNA合成试剂盒（诺唯赞）操作说明合成cDNA的第一链备用。
②目的片段的扩增：设计引物，扩增PpWEEP基因编码区185-387 bp，以上述合成的cDNA为模板进行PCR扩增；
PpWEEP-F（SEQ ID No.8）：
5’-TGTGAGTAAGGTTACCGAATTCTCGGTTTATAAGACGGTGCC-3’
PpWEEP-R（SEQ ID No.9）：
5’-TCTTCGGGACATGCCCGGGCCTCGAGTGGTTCCAGCTTCAAGGAAA-3’
扩增程序为95℃预变性3min；30个循环的98℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；
PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；
③TRV2-PpWEEP重组载体的构建：
纯化后的PCR基因片段，经KpnI-BamHI双酶切后，与经KpnI-BamHI双酶切的TRV2质粒用T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有50mg/LKan抗生素的LB平板培养基，37℃倒置过夜培养，长出单克隆，挑取单克隆至含有50mg/LKan抗生素的液体LB培养基中，37℃，250转每分钟震荡培养12小时，提取质粒，验证正确后备用；
（3）农杆菌转化与培养
使用冻融法将TRV2-PpWEEP、TRV2和TRV1质粒分别转入根癌农杆菌菌株 GV3101中并涂布于LB培养基（含50 mg·L-1壮观霉素、25 mg·L-1利福平（Rif））上。将此LB培养基置于28 ℃下培养2-3 d。挑取单菌落在含相同抗生素的 LB 液体培养基中 28 ℃，180 r·min-1振荡过夜（14 h），转移至50 mL离心管中25 ℃、5 000 r·min-1离心 5 min 后收获菌体，将其重悬于MES缓冲液（10 mM MES-KOH、10 mM MgCl2、100 μM的乙酰丁香酮混合溶液，pH = 5.5）中再次25 ℃、5 000 r·min-1离心5 min清洗菌体。将收集到的菌体重悬于MES缓冲液中，TRV1与TRV2以1：1混合(空载，起对照作用)，TRV1与TRV2-PpWEEP以1:1混合，并将菌体浓度调至OD600 = 0.6。调配好的菌液置于室温下避光放置 3 h，在侵染前加入0.02%的SILWETL-77。
（4）桃种子侵染：步骤（1）中处理后的种子用水轻轻清洗后，去除剩余种皮。在不伤害胚芽的情况下轻轻去除一片子叶（创造伤口），并立即将种子浸入事先制备好的农杆菌菌液中，在真空压力压强0.09 Mpa下保持25 min。取出种子用滤纸吸干表面的菌液，放入装有浸湿脱脂棉的15cm×15cm的方型培养皿中 28 ℃ 恒温遮光培养。
（5）桃苗垂枝表型的观察
侵染后的种子在浸湿脱脂棉上28 ℃ 恒温遮光培养3天后，移栽入营养土中暗条件下培养，于侵染28天拍照并测量桃苗弯曲角度，并分别在转化10、15、 20 和25 天时取桃苗茎尖部位提取RNA，进行表达量的检测。
结果如图3所示，与WT和空载对照相比，沉默PpWEEP基因的植株茎出现明显的弯曲，弯曲角度显著高于对照。定量结果也表明在不同转化天数后转入TRV-PpWEEP植株中PpWEEP的表达量显著低于对照；定量结果也表明在不同转化天数后转入TRV-PpWEEP植株中PpWEEP的表达量显著低于对照，说明达到了PpMAX4基因沉默的效果且沉默持续时间在25天以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于调控桃树枝条表型的方法，其特征在于：所述桃树枝条表型包括桃分枝表型和/或桃垂枝表型。
2.根据权利要求1所述的用于调控桃树枝条表型的方法，其特征在于：所述方法是通过调控基因PpMAX4和/或基因PpWEEP的表达量实现的。
3. 根据权利要求2所述的用于调控桃树枝条表型的方法，其特征在于：所述基因PpMAX4的编码区核苷酸序列如SEQ ID No.1所示、基因PpWEEP的编码区核苷酸序列如SEQID No.2所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用于调控桃树枝条表型的方法，其特征在于：所述方法包括过表达方法和基因沉默方法。
5.根据权利要求4所述的用于调控桃树枝条表型的方法，其特征在于：所述方法为TRV诱导基因沉默的方法。
6.根据权利要求5所述的用于调控桃树枝条表型的方法，其特征在于，步骤为：
（1）将种子从桃核中取出，于水中浸泡，去除种子胚根一端的种皮，然后于湿润条件下遮光萌发；
（2）分别扩增与桃树树枝表型相关的基因，获得目的片段与pTRV2质粒连接后获得重组载体；
（3）步骤（2）的重组载体经农杆菌转化后得农杆菌菌液，经真空侵染获得目标植株。
7.根据权利要求6所述的用于调控桃树枝条表型的方法，其特征在于：所述步骤（1）中水中浸泡的时间为24h；种皮为种子胚根一端1/3的种皮；遮光萌发的温度为25-29℃，时间为5-7天。
8.根据权利要求6所述的用于调控桃树枝条表型的方法，其特征在于：所述步骤（2）中与桃树树枝表型相关的基因为基因PpMAX4和/或基因PpWEEP。
9.权利要求8所述的方法在培育分枝数多的桃树中的应用，其特征在于，步骤为：
a. 将种子从桃核中取出，于水中浸泡24 h，然后去除种子胚根一端1/3的种皮，置于湿润环境中在25-29℃条件进行遮光萌发5-7天；
b. 以桃树叶cDNA为模板，以扩增基因PpMAX4的引物进行PCR扩增，获得目的片段与pTRV2质粒连接后获得重组载体；
c. 步骤b的重组载体经农杆菌转化后得农杆菌菌液，经真空侵染获得分枝数多的桃树植株。
10.权利要求8所述的方法在培育垂枝型桃树中的应用，其特征在于，步骤为：
a. 将种子从桃核中取出，于水中浸泡24 h，然后去除种子胚根一端1/3的种皮，置于湿润环境中在25-29℃条件进行遮光萌发5-7天；
b. 以桃树叶cDNA为模板，以扩增基因PpWEEP的引物进行PCR扩增，获得目的片段与pTRV2质粒连接后获得重组载体；
c. 步骤b的重组载体经农杆菌转化后得农杆菌菌液，经真空侵染获得垂枝型的桃树植株。
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