CN117844849A - 一种蒙古冰草的遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蒙古冰草的遗传转化方法，包括如下步骤：步骤一、对蒙古冰草的外植体进行诱导形成愈伤组织，将愈伤组织进行继代和分化培养，获得转化受体；步骤二、对步骤一获得的转化受体用农杆菌侵染液进行一次侵染；步骤三、对步骤二侵染后的转化受体进行暗培养筛选，筛选后采用农杆菌侵染液进行二次侵染；步骤四、对完成侵染的转化受体进行共培养，确定侵染效果。本申请设计并成功建立了蒙古冰草的遗传转化体系，将易侵染基因型蒙古冰草的侵染效率由不足5％提高到80％以上，并且在暗培养筛选2个月后，转入的目的基因仍能稳定的在蒙古冰草愈伤组织中表达，为蒙古冰草的分子育种研发提供了新方法。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种蒙古冰草的遗传转化方法。
背景技术
蒙古冰草(Agropyron mongolicum)属于禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)冰草属(Agropyron)植物，具有抗寒、抗旱、耐盐、耐风沙等特性，营养价值和生态价值较高，是改良天然草场及建立人工草地的适宜草种。
目前，由于缺少蒙古冰草遗传转化体系，有关蒙古冰草的研究主要集中在外植体的再生诱导、将基因克隆出来后在其他植物中进行异源表达等方面，在分子育种方面的研究比较滞后，因此，如何建立蒙古冰草高效且稳定的遗传转化体系显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在提供一种蒙古冰草的遗传转化方法，包括如下步骤：
步骤一、对蒙古冰草的外植体进行诱导形成愈伤组织，将所述愈伤组织进行继代和分化培养，获得转化受体；
步骤二、对步骤一获得的转化受体用农杆菌侵染液进行一次侵染；
步骤三、对步骤二侵染后的转化受体进行暗培养筛选，筛选后采用农杆菌侵染液进行二次侵染；
步骤四、对完成侵染的转化受体进行共培养，确定侵染效果。
其中，本申请在针对蒙古冰草设计建立遗传转化方法时发现，即便是侵染效果较好的基因型，其仍存在侵染能力退化非常快的问题，在进行目的基因转化时侵染效率大大降低。而本申请采用进行暗培养一段时候后再进行二次侵染的方法，使其在重复侵染后侵染效率得到了显著提升，并且目的基因能够在愈伤组织中稳定表达，成功建立了蒙古冰草的遗传转化体系。
在一个实施方式中，所述步骤一中，愈伤组织的诱导培养在诱导培养基中进行，所述诱导培养基包括：MS基础培养基，5mg·L-1 2,4-D，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，pH5.8；诱导培养的条件为：温度25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
在一个实施方式中，所述步骤一中，愈伤组织的继代培养在继代培养基中进行，所述继代培养基包括：MS基础培养基，5mg·L-1 2,4-D，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂；继代培养的条件为：温度25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
在一个实施方式中，所述步骤一中，蒙古冰草的外植体选自种子、根、茎、叶、花中的一种或多种，优选种子。
在一个实施方式中，所述步骤二中一次侵染，和/或所述步骤三中二次侵染方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.05～0.5MPa条件下抽真空5～20min，20kHz～30kHz条件下超声振荡3～10min，再于0.05～0.5MPa条件下抽真空5～20min。
在优选的实施方式中，一次侵染和/或二次侵染的参数条件为：于0.1MPa条件下抽真空10min，20kHz下超声振荡5min，再于0.1MPa条件下抽真空10min。
在优选的实施方式中，一次侵染和二次侵染采用完全相同的步骤参数。
在一个实施方式中，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌，优选为根癌农杆菌。
在一个实施方式中，所述农杆菌中含有能够表达目的基因的重组载体。
可选的，所述目的基因为筛选标记基因，例如荧光标记基因。
在一个实施方式中，所述农杆菌侵染液的OD600值为0.2～0.5，优选为0.3。
在一个实施方式中，所述步骤三中暗培养的条件为：将一次侵染后的转化受体置于筛选培养基上，于22℃～26℃、黑暗环境下培养20～70天，且每2周继代一次。
优选的，暗培养条件为：于25℃、黑暗环境下培养30～60天。
在一个实施方式中，所述筛选培养基为含有30g·L-1蔗糖、7.8g·L-1琼脂、2mg·L-1 2,4-D、300mg·L-1特美汀、30mg·L-1潮霉素的MS培养基。
在一个实施方式中，所述步骤四中共培养的方法包括：取出转化受体并除去过多的农杆菌，于22℃～26℃，黑暗条件下培养3～4天。
在一个实施方式中，可将转化受体从菌液中捞出后置于滤纸上吹干以除去过多的附着菌，并在滤纸上进行共培养。
在一个实施方式中，共培养的条件为：于25℃，黑暗条件下培养4天。
在一个实施方式中，所述方法还包括对侵染成功的转化受体进行分化筛选培养和生根培养的步骤。
在一个实施方式中，所述分化筛选培养在分化筛选培养基中进行，所述分化筛选培养基包括：MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，0.5mg·L-16-BA，2mg·L-1KT，300mg·L-1特美汀，2mg·L-1潮霉素。培养条件为：光照强度2000lx，光周期为8小时光照，16小时黑暗，15-25天继代一次；经过4-6周筛选培养之后，未转化材料死亡，转化材料能够继续生长；2-3月后，阳性愈伤组织进行分化。
在一个实施方式中，所述生根培养在生根培养基中进行，所述生根培养基包括：1/2MS基本培养基，15g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，300mg·L-1特美汀。培养条件为：待分化苗在培养皿中长至4-6cm时继代在生根培养基上，在27℃下，光周期为8小时光照/16小时黑暗，培养10-20天生根。
另一方面，本申请提供了所述的方法在制备提高侵染效率和/或提高目的基因表达稳定性的蒙古冰草中的应用。
在一个实施方式中，所述目的基因包括GUS基因。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本申请以蒙古冰草的种子为外植体，对其诱导生成的愈伤组织进行遗传转化实验，设计并成功建立了蒙古冰草的遗传转化体系，为蒙古冰草的分子育种研发提供了新方法。进一步，本申请提供的方法采用在一次侵染后暗培养筛选一段时间后再进行二次侵染的方式，将易侵染基因型蒙古冰草的侵染效率由不足5％提高到80％以上，并且在暗培养筛选2个月后，转入的目的基因仍能稳定的在蒙古冰草愈伤组织中表达，有效改善了蒙古冰草愈伤组织的侵染能力退化以及目的基因转入易失败进而难以稳定表达的问题。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：
图1为实施例1步骤(5)的结果图；
图2为实施例1步骤(6)的结果图，从左到右依次为共培养4天后、暗培养30天后、暗培养60天后的愈伤组织照片图，以及共培养4天后、暗培养30天后、暗培养60天后的愈伤组织染色结果图；
图3为实施例1步骤(7)的结果图，其中右图是左图的放大图，放大倍数为5倍；
图4为实施例1步骤(8)的结果图，其中右图是左图的放大图，放大倍数为5倍。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请提供的下述实施例中，所涉及的质粒载体选用购自杭州宝赛生物科技有限公司的空白pANIC6B载体；所涉及的农杆菌选用购自北京全式金生物技术股份有限公司的EHA105。所涉及的将目的基因导入至质粒载体中获得重组质粒，再将重组质粒导入农杆菌中获得重组农杆菌的方法均采用本领域常规或已知的实验方法实现。
本申请实施例中所涉及的蒙古冰草及种子由内蒙古农业大学提供，该种子的获得或生产方法公开于申请号为CN201610155958.7的中国发明专利中。
实施例1
本实施例对蒙古冰草进行遗传转化方法的建立，具体步骤如下：
(1)获得蒙古冰草组培无菌愈伤组织：以蒙古冰草的种子为外植体，在诱导培养基上进行愈伤组织的诱导，外植体长出愈伤组织后，将愈伤组织在无菌的环境中转移到含相应植物激素组合的新鲜的继代培养基上，继代一次，继代培养的环境条件：温度为25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
其中，愈伤组织的诱导培养在诱导培养基中进行，诱导培养基包括：MS基础培养基，5mg·L-1 2,4-D，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，pH5.8；诱导培养的条件为：温度25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。愈伤组织的继代培养在继代培养基中进行，所述继代培养基包括：MS基础培养基，5mg·L-1 2,4-D，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂；继代培养的条件为：温度25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
(2)将胚性愈伤组织继代到分化培养基上，选择分化较好的愈伤组织块进行遗传转化。
其中，分化培养基包括：MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，0.5mg·L-16-BA，2mg·L-1KT。
(3)农杆菌侵染液的制备，包括：
将含有35S启动子驱动的GFP报告基因的重组质粒导入根癌农杆菌EHA105，获得重组农杆菌；
冻融法转化农杆菌感受态：冰上融化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，然后加入3μL的潮霉素(HYG)质粒DNA，冰上静置30分钟，液氮中冷冻1分钟；然后37℃水浴3min加入950μL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养3小时；离心浓缩菌液，用100μL YEP培养基回溶菌体，将回溶后的菌体涂于加50mg·L-1卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃下培养，长出单克隆后，用PCR鉴定潮霉素B抗性基因，保存阳性根癌农杆菌落；
活化根癌农杆菌：将上述阳性根癌农杆菌在培养基中培养至OD600值等于0.3，作为转化蒙古冰草愈伤组织的侵染液。
(4)侵染蒙古冰草愈伤组织并共培养：选择步骤(2)分化培养基上生长状况良好、致密有颗粒感的愈伤组织，作为根癌农杆菌侵染的外植体；把愈伤组织放到步骤(3)的根癌农杆菌侵染液中，于0.1MPa条件下抽真空10min，20kHz下超声振荡5min，再于0.1MPa条件下抽真空10min；
倒去上层菌液，将侵染后的愈伤组织捞出放滤纸上吹干以除去过多的附着根癌农杆菌，期间需不断翻愈伤组织至干燥；然后将侵染后的愈伤组织在滤纸上共培养4天。
(5)植物转化材料的筛选培养：经步骤(4)侵染的植物组织材料与根癌农杆菌共培养4天之后，进行GUS染色鉴定，并重复3次，所得结果如图1所示；
由图1可知，以蒙古冰草的种子为外植体时，采用一次侵染后，其侵染能力的退化非常快，进而在进行目的基因转化时侵染效率大大降低，侵染效果并不理想。
(6)取出愈伤组织在无菌条件下转到筛选培养基上，于25℃、黑暗环境下进行暗培养筛选30～60天，每2周继代一次以保持抗生素筛选压力的稳定；将该筛选后的愈伤组织使用同一个载体的菌液进行二次侵染，以提高其侵染效率；其中，筛选培养基为含有30g·L-1蔗糖、7.8g·L-1琼脂、2mg·L-1 2,4-D、300mg·L-1特美汀、30mg·L-1潮霉素的MS培养基。
将侵染后的愈伤组织经4天共培养，染GUS计算侵染效率评价侵染效果。其中，侵染效率的计算方法包括：用100块大小均一的愈伤组织侵染，侵染后共培养4天染GUS，统计染上GUS的愈伤组织数目除以总数目(100)，重复三次转化求平均值。所得结果如表1和图2所示。
表1
| 侵染参数 | 侵染效率 |
| 一次侵染 | 4.6％ |
| 暗培养30天二次侵染 | 30.5％ |
| 暗培养60天二次侵染 | 84.3％ |
由表1以及图2中的结果可知，与第一次侵染相比，在暗培养一段时间后再次进行二次侵染，侵染效率得到了显著提高，尤其是在暗培养约60天左右时再进行二次侵染，其侵染效率由原来的不足5％能够提高到80％以上，说明此时一次侵染后的蒙古冰草愈伤组织被培养至适合进行二次侵染的状态。并在，在暗培养筛选2个月后，该GUS基因仍能稳定的在蒙古冰草愈伤组织中表达。
与此同时，本实施例还采用了其他常规认为能够提高侵染效率的方式进行改进，结果改善效果不佳，例如：
方法一：在暗培养3天后进行二次侵染。然而，在方法下导致多数蒙古冰草愈伤组织死亡，无法再进行分化培养，进而导致实验失败。
方法二：将超声时间延长至10min。然而，该方法下导致农杆菌大量死亡，侵染效率不增反降，导致实验失败。
(7)将步骤(6)暗培养筛选后的愈伤组织转移到分化筛选培养基上，分化筛选培养基包括：MS基础培养基，30g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，0.5mg·L-16-BA，2mg·L-1KT，300mg·L-1特美汀，2mg·L-1潮霉素。培养条件为：光照强度2000lx，光周期为8小时光照，16小时黑暗，15-25天继代一次；经过4-6周筛选培养之后，未转化材料死亡，转化材料能够继续生长；2-3月后，阳性愈伤组织进行分化，如图3所示。
在潮霉素的筛选压力下，阳性的愈伤组织可以进行分化，形成再生芽，非阳性的愈伤组织在潮霉素的筛选压力下无法形成再生芽，而形成再生芽是获得转基因植株的前提。由图3中的结果可知，采用上述方法处理的愈伤组织分化形成有再生芽，即采用本方法进行遗传转化能够获得阳性的转基因植株。
(8)将步骤(7)待分化苗在培养皿中长至4-6cm时，将分化苗继代在生根培养基上，生根培养基包括：1/2MS基本培养基，15g·L-1蔗糖，7.8g·L-1琼脂，300mg·L-1特美汀。培养条件为：待分化苗在培养皿中长至4-6cm时继代在生根，如图4所示。
由图4可知，蒙古冰草在转化后可进行生根，GUS染色结果表明获得了阳性的转基因生根苗。
综合上述可知，本申请成功建立了以农杆菌介导的蒙古冰草的遗传转化方法，并且上述实施例构建的遗传转化方法，具有显著提高的侵染效率、更高的目的基因转入成功率和稳定的表达效果，能够获得阳性转基因植株及阳性生根苗，为蒙古冰草的分子育种研发提供了方法保障。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.一种蒙古冰草的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、对蒙古冰草的外植体进行诱导形成愈伤组织，将所述愈伤组织进行继代和分化培养，获得转化受体；
步骤二、对步骤一获得的转化受体用农杆菌侵染液进行一次侵染；
步骤三、对步骤二侵染后的转化受体进行暗培养筛选，筛选后采用农杆菌侵染液进行二次侵染；
步骤四、对完成侵染的转化受体进行共培养，确定侵染效果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，蒙古冰草的外植体选自种子、根、茎、叶、花中的一种或多种，优选种子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中一次侵染，和/或所述步骤三中二次侵染的方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.05～0.5MPa条件下抽真空5～20min，20kHz～30kHz条件下超声振荡3～10min，再于0.05～0.5MPa条件下抽真空5～20min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌；
和/或，所述农杆菌中含有能够表达目的基因的重组载体；
和/或，所述农杆菌侵染液的OD600值为0.2～0.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中暗培养的条件为：将一次侵染后的转化受体置于筛选培养基上，于22℃～26℃、黑暗环境下培养20～70天，且每2周继代一次。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述筛选培养基为含有30g·L-1蔗糖、7.8g·L-1琼脂、2mg·L-1 2,4-D、300mg·L-1特美汀、30mg·L-1潮霉素的MS培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中共培养的方法包括：取出转化受体并除去过多的农杆菌，于22℃～26℃，黑暗条件下培养3～4天。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对侵染成功的转化受体进行分化筛选培养和生根培养的步骤。
9.如权利要求1-8所述的方法在制备提高侵染效率和/或提高目的基因表达稳定性的蒙古冰草中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述目的基因包括GUS基因。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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