CN103276013B - 棉花子叶瞬时表达外源基因的方法 - Google Patents
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Abstract
一种棉花子叶瞬时表达外源基因的方法，由棉花种植、制备转化液、注射侵染、棉花培养、GUS基因表达检测步骤组成。本发明具有方便、快捷、易于操作、染色清晰等优点，适合检测棉花来源的外援基因的表达，亚细胞定位及启动子活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到农杆菌介导的棉花子叶瞬时表达系统的建立。
背景技术
瞬时表达是指外源基因导入到植物细胞后，作为一种基因组外的遗传物质进行转录和翻译，并在转化细胞内积累表达产物的技术，转录和翻译的时间通常为几天到十几天。瞬时表达系统具有表达效率高，实验周期短，操作简单而且对材料限制小等优点。瞬时表达系统常见的转化法有基因枪轰击法、摩擦接种法、原生质体转化法和农杆菌介导的瞬时转化法。这些转化法各有优缺点，其中基因枪的效率比较高，但费用很大；摩擦接种法虽然花费少，但是不适于大规模侵染和筛选；而农杆菌介导的瞬时表达技术不仅费用少、操作简单。而且转化的材料种类范围比较广泛，植物叶片、胚珠、愈伤组织以及原生质体等均可以被转化，目前已被用于拟南芥、烟草、玉米、甘蔗、土豆等多种植物。但是瞬时转化系统仍然存在一些问题，尤其是外源基因在其他植物中的异源表达无法真实反映蛋白质的天然活性、亚细胞定位和其他蛋白的互作情况。因此用所研究基因来源的物种做为瞬时表达的材料可以更合理、更有效、更真实的反应基因功能。
棉花是锦葵科木棉属植物，是世界上最主要的经济作物之一，棉花的基因组测序已经完成，对棉花中功能基因的研究也进入到更深更广的阶段。近年来，棉花中瞬时表达系统主要利用棉花愈伤组织经酶解法处理后形成的原生质体来完成，该方法能快速检测棉花功能基因的瞬时表达、亚细胞定位等，但操作复杂，需要基因枪进行基因转化，费用大。
因此，在转基因技术领域，当前需要解决的一个技术问题是建立一种更方便、更快捷的棉花瞬时表达方法以便研究棉花功能基因的亚细胞定位，蛋白互作，启动子活性等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺点，提供一种方便、快捷、有效的棉花子叶瞬时表达外源基因的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、棉花种植
棉花种子37℃浸泡12小时，将营养土与蛭石按质量比为3：1混合成栽培土，营养土和蛭石为市场上销售的商品，由上海亚轩绿化工程有限售公司销售，吸水8小时，待表面浸润后，种植棉花种子，覆土，25℃、湿度51±2%、16小时光照、8小时黑暗、光照强度24000lux的培养箱中培养至棉花种子萌发。
2、制备转化液
吸取含有外源基因+GUS表达载体的农杆菌GV3101与LB液体培养基按1：50的体积比加入到LB液体培养基中，在LB液体培养基中加入50mg/mL的卡那霉素、50mg/mL的利福平、20mg/mL的庆大霉素，LB液体培养基与50mg/L的卡那霉素、50mg/L的利福平、50mg/L的庆大霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.001，28℃，180转/分钟振荡培养15～18小时，制备成600nm的OD值为0.3～0.6的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为1：90：10，得到转化液。
上述外源基因+GUS表达载体用pCambia1301或pCambia2301或pBI121按常规的载体构建方法构建并转化进农杆菌GV3101中，外源基因与GUS基因应连接成融合基因，以便表达出外源基因+GUS标签的融合蛋白。pCambia1301和pCambia2301植物表达载体购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号：MCV033和MCV037；pBI121植物表达载体购于北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：MP-091；
上述侵染液由100μmol/L的乙酰丁香酮与10mmol/L的硫酸镁按体积比为1：1混合制成。
3、注射侵染
用蒸馏水清洁生长2～18天的棉花子叶，用质量浓度为75%的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射30～150μl转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。
4、棉花培养
将注射侵染后的棉花植株放入24±1℃、光照强度24000lux、湿度51%的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，共培养24～96小时，在培养过程中GUS基因表达。
5、GUS基因表达检测
将培养24～96小时的子叶用蒸馏水清洗，置于pH7.0的GUS染色液中，180转/分钟，37℃振荡染色24小时，浸泡在染色液中的棉花子叶用水循环式真空泵0.08MPa抽真空30分钟，继续振荡染色48小时，用乙醇脱色8小时，脱去叶绿素。
所用GUS染色液用1mol/L的磷酸二氢钠、1mol/L的磷酸氢二钠、0.5mol/L的乙二胺四乙酸二钠、0.1mol/L的铁氰化钾、0.1mol/L的亚铁氰化钾、质量浓度为0.1%的曲拉通X-100，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）配制成，1mol/L的磷酸二氢钠与1mol/L的磷酸氢二钠、0.5mol/L的乙二胺四乙酸二钠、0.1mol/L的铁氰化钾、0.1mol/L的亚铁氰化钾、质量浓度为0.1%的曲拉通X-100、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）的体积比为21：29：20：10：10：1。
在本发明的制备转化液步骤2中，吸取含有外源基因+GUS表达载体的农杆菌GV3101与LB液体培养基按1：50的体积比加入到LB液体培养基中，在LB液体培养基中加入50mg/mL的卡那霉素、50mg/mL的利福平、20mg/mL的庆大霉素，LB液体培养基与50mg/L的卡那霉素、50mgL/的利福平、50mg/L的庆大霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.001，28℃、180转/分钟振荡培养15～18小时，制备成600nm的OD值最佳为0.5的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为1：90：10，得到转化液。
在本发明的注射侵染步骤3中，用蒸馏水清洁生长最佳6天的棉花子叶，用质量浓度为75%的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处最佳各注射50μl转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。
在本发明的棉花培养步骤4中，将注射侵染后的棉花植株放入24±1℃、光照强度24000lux、湿度51%的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，最佳培养48小时，可促进外源基因和GUS表达。
本方法具有方便、快捷、易于操作、染色清晰等优点，适合检测棉花来源的外援基因的表达，亚细胞定位及启动子活性。
附图说明
图1是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.3时收菌配制50ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图2是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.4时收菌配制50ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图3是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制50ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图4是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.6时收菌配制50ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图5是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制30ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图6是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制100ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图7是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制150ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图8是棉花生长2天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制50ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图9是棉花生长10天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制50ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图10是棉花生长14天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制50ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图11是棉花生长18天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制50ul的转化液培养2天GUS染色结果照片。
图12是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制50ul的转化液培养1天GUS染色结果照片
图13是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制50ul的转化液培养3天GUS染色结果照片。
图14是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为0.5时收菌配制50ul的转化液培养4天GUS染色结果照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例棉花子叶瞬时表达外源基因的方法由下述步骤组成：
1、棉花种植
将棉花种子40粒在37℃的中浸泡12小时，营养土与蛭石按质量比为3：1混合成栽培土，营养土和蛭石为市场上销售的商品，由上海亚轩绿化工程有限公司销售，浸泡后的棉花种子吸水8小时，种植在栽培土中，种植深度为1cm，覆土，25℃、湿度51±2%、16小时光照、8小时黑暗、光照强度24000lux的培养箱中培养至棉花种子萌发。
2、制备转化液
外援基因D7-pCambia1301表达载体按如下方法构建，设计含有Nco I酶切位点的PCR上游、下游扩增引物，引物序列为：
F:ATTCCATGGCAGTTACACAATTCAGAG，R:GGACCATGGCCTTCCTAGTAACAGTAG
采用常规RT-PCR方法扩增获得5’端带Nco I酶切位点和3’端带Nco I酶切位点的D7基因（基因序列号为GenBank:X13201.1）与Easy Vector连接，按EasyVector试剂盒的操作步骤进行，获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，测序鉴定后命名为TEasy-D7质粒。对pCambia1301载体及TEasy-D7质粒分别用Nco I进行酶切，各自的酶切体系如下：
上述体系各自混匀，37℃水浴2小时，30ml质量浓度为1.0%的琼脂糖凝胶分离条带并回收，pCambia1301酶切后回收11837bp的片段，命名为pCambia1301-1，TEasy-D7质粒酶切后回收531bp条带，命名为D7-1，具体回收步骤按DNA纯化试剂盒说明书进行。
T4 DNA连接酶连接pCambia1301-1与TEasy-D7，反应体系如下：
上述连接体系混匀，16℃连接16小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含50mg/L的卡那霉素的LB筛选培养基上筛选阳性菌落，摇菌提取质粒，测序鉴定后命名为D7-pCambia1301表达载体。
吸取200μL含有D7-pCambia1301表达载体的农杆菌GV3101加入到10mL的LB液体培养基中，含有D7-pCambia1301表达载体的农杆菌GV3101与LB液体培养基的体积比为1：50，在LB液体培养基中加入50mg/mL的卡那霉素、50mg/mL的利福平、20mg/mL的庆大霉素，LB液体培养基与50mg/L的卡那霉素、50mg L/的利福平、50mg/L的庆大霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.001，28℃，180转/分钟振荡培养15～18小时，制备成600nm的OD值为0.3～0.6的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为1：90：10，得到转化液；
上述载体构建过程中所用pCambia1301植物表达载体购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号：MCV033，T4 DNA连接酶，10×T4 DNA连接酶缓冲液、DNA胶回收试剂盒购于Promega公司，Nco I、10×K缓冲液、10×BSA购于大连宝生物工程有限公司，大肠杆菌DH5α和Easy载体试剂盒购置于Promega公司；
上述的侵染液由100μmol/L的乙酰丁香酮与10mmol/L的硫酸镁的体积比为1：1混合制成；
本实施例中的外源基因也可采用棉花中的其它基因，如Ghatp6、GhaccD、GhPPR3等。
3、注射侵染
用蒸馏水清洁生长6天的棉花子叶，用质量浓度为75%的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射50μl转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。
4、棉花培养
将注射侵染后的棉花植株放入24±1℃、光照强度24000lux、湿度51%的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，共培养48小时，在培养过程中GUS基因表达。
5、GUS基因表达检测
将培养48小时的子叶用蒸馏水清洗，置于pH7.0的GUS染色液中，180转/分钟，37℃振荡染色24小时，浸泡在染色液中的棉花子叶用水循环式真空泵0.08MPa抽真空30分钟，继续振荡染色48小时，用乙醇脱色8小时，脱去叶绿素。
所用GUS染色液用1mol/L的磷酸二氢钠4.2ml、1mol/L的磷酸氢二钠5.8ml、0.5mol/L的乙二胺四乙酸二钠4ml、0.1mol/L的铁氰化钾2ml、0.1mol/L的亚铁氰化钾2ml、质量浓度为0.1%的曲拉通X-100 0.2ml，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）100mg配制成，1mol/L的磷酸二氢钠与1mol/L的磷酸氢二钠、0.5mol/L的乙二胺四乙酸二钠、0.1mol/L的铁氰化钾、0.1mol/L的亚铁氰化钾、质量浓度为0.1%的曲拉通X-100、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）的体积比为21：29：20：10：10：1。
实施例2
本实施例棉花子叶瞬时表达外源基因的方法由下述步骤组成：
棉花种植步骤1与实施例1相同。
在制备转化液步骤2中，吸取200μL含有D7-pCambia1301表达载体的农杆菌GV3101加入到10mLLB液体培养基中，在10ml的LB液体培养基中加入50mg/mL的卡那霉素10μL、50mg/mL的利福平10μL、50mg/mL的庆大霉素10μL，LB液体培养基与50mg/L的卡那霉素、50mg L/的利福平、50mg/L的庆大霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.001，28℃、180转/分钟振荡培养15～18小时，制备成600nm的OD值为0.3的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为1：90：10，得到转化液。
在注射侵染步骤3中，用蒸馏水清洁生长6天的棉花子叶，用质量浓度为75%的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射150μl转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。
其他步骤与实施例1相同。
实施例3
本实施例棉花子叶瞬时表达外源基因的方法由下述步骤组成：
棉花种植步骤1与实施例1相同。
在制备转化液步骤2中，吸取200μL含有D7-pCambia1301表达载体的农杆菌GV3101加入到10mLLB液体培养基中，在10ml的LB液体培养基中加入50mg/mL的卡那霉素10μL、50mg/mL的利福平10μL、50mg/mL的庆大霉素10μL，LB液体培养基与50mg/L的卡那霉素、50mg L/的利福平、50mg/L的庆大霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.001，28℃、180转/分钟振荡培养15～18小时，制备成600nm的OD值为0.6的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为1：90：10，得到转化液。
在注射侵染步骤3中，用蒸馏水清洁生6天的棉花子叶，用质量浓度为75%的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射30μl转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。
其他步骤与实施例1相同。
实施例4
在以上的实施例1～3中，棉花种植步骤1、制备转化液步骤2、注射侵染步骤3与相应的实施例相同。
在棉花培养步骤4中，将注射侵染后的棉花植株放入24±1℃、光照强度24000lux、湿度51%的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，共培养24小时，在培养过程中GUS基因表达。
其他步骤与实施例1相同。
实施例5
在以上的实施例1～3中，棉花种植步骤1、制备转化液步骤2、注射侵染步骤3与相应的实施例相同。
在棉花培养步骤4中，将注射侵染后的棉花植株放入24±1℃、光照强度24000lux、湿度51%的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，共培养96小时，在培养过程中GUS基因表达。
其他步骤与实施例1相同。
其他步骤与实施例1相同。
实施例6
在以上的实施例1～5的制备转化液步骤2中的pCambia1301用等体积的pCambia2301替换，该步骤中的其他步骤与实施例1相同.其他步骤与相应的实施例相同。
实施例7
在以上的实施例1～5的制备转化液步骤2中的pCambia1301用等体积的pBI121替换，该步骤中的其他步骤与实施例1相同.其他步骤与相应的实施例相同。
为了确定本发明的最佳步骤，发明人进行了大量的研究实验，各种实验情况如下：
1、农杆菌不同OD600对棉花子叶的生长影响
棉花种植步骤1与实施例1相同。
在制备转化液步骤2中，吸取200μL含有D7-pCambia1301表达载体的农杆菌GV3101加入到10mLLB液体培养基中，在10ml的LB液体培养基中加入50mg/mL的卡那霉素10μL、50mg/mL的利福平10μL、50mg/mL的庆大霉素10μL，LB液体培养基与50mg/L的卡那霉素、50mg L/的利福平、50mg/L的庆大霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.001，28℃、180转/分钟振荡培养15～18小时，上述原料各取4份，分别制备成600nm的OD值为0.3、0.4、0.5、0.6的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为1：90：10。侵染液的制备与实施例1相同。制备成4种转化液。
其他步骤与实施例1相同，实验结果见图1～图4。由图可见，600nm的OD值为0.3～0.6的菌液制备的转化液注射在子叶背面两条叶脉分支处，培养2天的棉花子叶GUS染色显示转化效率较高，600nm的OD值为0.5时棉花子叶的转化效率最高。
2、转化液的注射量对棉花子叶的生长影响
棉花种植步骤1、制备转化液步骤2与实施例1相同。
在注射侵染步骤3中，用蒸馏水清洁生长6天的棉花子叶，用质量浓度为75%的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射30μl、50μl、100μl、150μl转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。
其他步骤与实施例1相同。实验结果见图3、图5、图6、图7。由图可见，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处注射30～150μl转化液培养2天的棉花子叶GUS染色显示转化效率较高，注射50μl转化液时转化效率最高。
3、不同时期注射对棉花子叶的生长影响
棉花种植步骤1、制备转化液步骤2与实施例1相同。
在注射侵染步骤3中，用蒸馏水分别清洁生长2天、6天、10天、14天、18天的棉花子叶，用质量浓度为75%的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射50μl转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。
其他步骤与实施例1相同。实验结果见图3、图8、图9、图10、图11。由图可见，生长2～18的棉花子叶GUS染色显示转化效率较高，生长6的棉花子叶转化效率最高。
4、不同共培养时间对棉花子叶的生长影响
棉花种植步骤1、制备转化液步骤2、注射侵染步骤3与实施例1相同。
在棉花培养中，将注射侵染后的棉花植株放入24±1℃、光照强度24000lux、湿度51%的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，分别培养24、48、72、96小时，GUS基因表达。
其他步骤与实施例1相同。实验结果见图3、图12、图13、图14。由图可见，共培养24～96小时棉花子叶GUS染色显示转化效率较高，共培养48小时的棉花子叶GUS染色显示转化效率最高。
Claims (2)
1.一种棉花子叶瞬时表达外源基因的方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)棉花种植
棉花种子37℃浸泡12小时，将营养土与蛭石按质量比为3：1混合成栽培土，吸水8小时，待表面湿润后，种植棉花种子，覆土，25℃、湿度51±2％、16小时光照、8小时黑暗、光照强度24000lux的培养箱中培养至棉花种子萌发；
(2)制备转化液
吸取含有外源基因+GUS表达载体的农杆菌GV3101与LB液体培养基按1：50的体积比加入到LB液体培养基中，在LB液体培养基中加入50mg/mL的卡那霉素、50mg/mL的利福平、20mg/mL的庆大霉素，LB液体培养基与50mg/L的卡那霉素、50mg L/的利福平、50mg/L的庆大霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.001，28℃，180转/分钟振荡培养15～18小时，制备成600nm的OD值为0.5的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为1：90：10，得到转化液；
上述外源基因用pCambia1301或pCambia2301或pBI121按常规的载体构建方法构建并转化进农杆菌GV3101中，外源基因与GUS基因连接成融合基因；
上述的侵染液由100μmol/L的乙酰丁香酮与10mmol/L的硫酸镁的体积比为1：1混合制成；
(3)注射侵染
用蒸馏水清洁生长2～18天的棉花子叶，用质量浓度为75％的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射30～150μl转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面；
(4)棉花培养
将注射侵染后的棉花植株放入24±1℃、光照强度24000lux、湿度51％的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时培养48小时，在培养过程中GUS基因表达；
(5)GUS基因表达检测
将培养48小时的子叶用蒸馏水清洗，置于pH 7.0的GUS染色液中，180转/分钟，37℃振荡染色24小时，浸泡在染色液中的棉花子叶用水循环式真空泵0.08MPa抽真空30分钟，继续振荡染色48小时，用乙醇脱色8小时，脱去叶绿素。
2.根据权利要求1所述的棉花子叶瞬时表达外源基因的方法，其特征在于：在注射侵染步骤(3)中，用蒸馏水清洁生长6天的棉花子叶，用质量浓度为75％的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射50μl转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。
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