CN103773797A - 一种诱发花生毛状根的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诱发花生毛状根的组织培养方法，属于植物组织培养领域。包括如下步骤：1）花生种子表面消毒和浸种；2）种子去掉种皮，保留含完全胚的一片子叶，接种到萌发培养基，光照培养7天；3）发根农杆菌的活化，挑空白或已转质粒的发根农杆菌（A.rhizogenes，K599）单克隆，在相应液体培养基中活化；4）用解剖刀将花生苗的根部完整切除，用注射器注射发根农杆菌至剩余下胚轴基部；5）转移至共培养培养基黑暗培养3天；6）转移至继代培养基20天，直至毛状根发出。通过本发明的方法，可在30天内得到花生毛状根，用于花生根部性状的转基因研究及次级代谢产物的生物合成。
Description
技术领域
本发明提供一种诱发花生毛状根的组织培养方法，属于植物组织培养领域。用于花生根部性状的转基因研究及花生次级代谢产物的生物合成。
背景技术
发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）同属根瘤菌科，都能介导T-DNA进入植物细胞核，与宿主基因组整合。所不同的是，发根农杆菌rol基因整合到植物基因组后，能使侵染的组织分化出大量的毛状根，并合成并合成冠瘿碱，该特性区别于根癌农杆菌侵染细胞形成的瘤状物。发根农杆菌独立于染色体之外的Ri质粒有重要的T-DNA区域，含有冠瘿碱合成和生长素合成相关的基因，其中左端TL-DNA是发根所必须的，包含发根相关的rol基因。
利用发根农杆菌侵染植物组织效率较高，目前已经成功诱导100多种植物产生发状根，主要研究的方向如下：
（1）发根农杆菌的种类与不同侵染机制。根据分泌冠瘿碱的不同，一般将发根农杆菌分为黄瓜碱、异黄瓜碱、甘露碱和农杆碱型4种，4种发根农杆菌在T-DNA结构和侵染机制上有一定差异。
（2）作为转基因手段之一研究植物根部性状。相比起根癌农杆菌转化，发根农杆菌转化更为便捷，一些根部性状的研究已经采用该技术手段，如对大豆生物固氮途径中的信号传导的研究，对根系与土壤微生物群落的共生关系的研究等等。
（3）直接利用毛状根再生成完整的转基因植株。发根农杆菌侵染后的植物为嵌合体，即整个植株只有根部带有外源基因，但一些植物，如苜蓿、百脉根等，可以利用诱导的毛状根，通过组培与外源激素的施加，也可以再生成为完整的转基因植株，便于后期的研究。
（4）植物次生代谢产物的人工合成。植物中很多有重要的次生代谢产物都在根部有数量可观的积累，直接从根部提取将破坏植物生长。毛状根易于诱发和培养，能较长时间产生次级代谢产物，且产物直接分泌到培养基中，易于提取，是一个比较理想的生物反应器。目前比较成功的案例有生物碱、白黎芦醇等等。
花生从属豆科，为重要的经济作物与油料作物，相比起其他模式作物，花生基因组学、分子生物学的研究还有待深入，其中花生高效转基因体系亟需建立。本发明建立了通过发根农杆菌感染诱发花生产生毛状根的系统，对于花生根部性状（如土壤耐逆、土传病抗性等）的转基因研究，及次级代谢产物的生物合成提供较为成熟的平台，也可藉此平台对花生转基因植株的再生加以探讨。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于建立发根农杆菌感染诱发花生产生毛状根的方法，以便于对于花生根部性状（如土壤耐逆、土传病抗性等）的转基因研究，及次级代谢产物的生物合成提供较为成熟的平台，也可藉此平台对花生转基因植株的再生加以探讨。
技术方案
一种诱发花生毛状根的组织培养方法，包括如下步骤：
1）花生种子表面消毒和浸种，将花生去壳，75%乙醇中放置1分钟，弃乙醇，1%次氯酸钠中放置3分钟，随后用无菌水漂洗干净，放置无菌滤纸上晾干；
2）取步骤 1）所述种子去掉种皮，保留含完全胚的单片子叶，接种到萌发培养基，30℃光照培养7天。所述萌发培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂粉；
3）挑空白或已转质粒的发根农杆菌（A. rhizogenes）K599单克隆，在相应液体培养基中活化，条件为30℃，200rpm至OD600=0.6。所述液体培养基为LB 培养基+100mg/L利福平Rifampicin+100mg/L链霉素Streptomycin，已转质粒的农杆菌另加入载体上抗性基因所对应的抗生素；
4）取步骤 2）所述诱发的花生幼苗，用解剖刀将花生苗的根部完整切除，用注射器多点注射发根农杆菌（A. rhizogenes）K599至剩余下胚轴基部；
5）取步骤 4）所述样品，转移至共培养培养基黑暗培养3天。所述共培养培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂粉+ 50μM乙酰丁香酮；
6）取步骤 5）所述样品，转移至继代培养基，30℃光照培养20天，每5-6天继代一次直至毛状根发出。所述继代培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂粉, 已转质粒的农杆菌另加入载体上抗性基因所对应的抗生素。
有益效果
通过本发明的方法，首次在30天内得到花生毛状根，不仅能用于花生根部性状（如耐盐旱逆境、土传病害抗性等）相关基因的转基因功能验证，也可藉此手段富集和获取花生根部白藜芦醇等各种活性次级代谢产物。此外，对于花生毛转根诱导愈伤和再生的研究，也能为花生高效转基因平台的建设提供新的思路。
附图说明
图1 为萌发培养基培养7天后花生幼苗照片；
图2 为根部完整切除及发根农杆菌注射照片；
图3 为毛状根培养与再生照片。
图4 为选择农杆菌生长处于对数期的OD600=0.6作为最佳接菌时间。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用化学试剂均为化学纯，均购自Sigma。
1）花生种子表面消毒和浸种，将花生去壳，75%乙醇中放置1分钟，弃乙醇，1%次氯酸钠中放置3分钟，随后用无菌水漂洗干净，放置无菌滤纸上晾干；
2）取步骤 1）所述种子去掉种皮，保留含完全胚的单片子叶，接种到萌发培养基，30℃光照培养7天。所述萌发培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂粉。
3）挑空白发根农杆菌（A. rhizogenes）K599（参见Savka, M.A等，Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cystnematode，Phytopathology，1990，80, 503–508）单克隆，在相应液体培养基中活化，农杆菌于液体培养基中活化，条件为30℃，200rpm。接菌所用OD600的确定如下实验所述：分别取OD600为0.2，0.6，1.0，2.0，3.0，5.0等6份活化农杆菌菌液进行接菌，其诱导发根时间如下图所示。据此，选择农杆菌生长处于对数期的OD600=0.6作为最佳接菌时间（图4）。所述液体培养基为LB 培养基+100mg/L利福平Rifampicin+100mg/L链霉素Streptomycin；
4）取步骤 2）所述诱发的花生幼苗，用解剖刀将花生苗的根部完整切除，用注射器多点注射发根农杆菌（A. rhizogenes）K599至剩余下胚轴基部（图1）；
5）取步骤 4）所述样品，转移至共培养培养基黑暗培养3天（图2）。所述共培养培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂粉+ 50μM乙酰丁香酮；
6）取步骤 5）所述样品，转移至继代培养基，30℃光照培养20天，每5-6天继代一次直至毛状根发出。所述继代培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂，已转质粒的农杆菌另需加入载体上携带的抗性基因所对应的抗生素。
以pCAMBIA3301转基因载体（商业化公开载体）构建转基因质粒，应用此方法，获得了花生转基因根系，应用于花生根部耐旱研究：采取冻融法进行农杆菌质粒转化，挑取单克隆在液体培养基中活化，注射下胚轴，共培养3天后于继代培养基中继续培养至毛状根发出。液体培养基为LB 培养基+100mg/L利福平Rifampicin+100mg/L链霉素Streptomycin+100mg/L卡那霉素Kanamycin；继代培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂+100mg/L卡那霉素Kanamycin；其余操作参数按照步骤1），2），4），5）与6）。
通过本发明的方法，首次在30天内得到花生毛状根（图3），用于花生根部性状的转基因研究及次级代谢产物的生物合成。
Claims (1)
1. 一种诱发花生毛状根的组织培养方法，包括如下步骤：
1）花生种子表面消毒和浸种，将花生去壳，75%乙醇中放置1分钟，弃乙醇，1%次氯酸钠中放置3分钟，随后用无菌水漂洗干净，放置无菌滤纸上晾干；
2）取步骤 1）所述种子去掉种皮，保留含完全胚的单片子叶，接种到萌发培养基，30℃光照培养7天，所述萌发培养基为MS无机盐+质量比3%蔗糖+质量比0.8%琼脂粉；
3）挑空白或已转质粒的发根农杆菌（A. rhizogenes）K599单克隆，在液体培养基中活化，条件为30℃，200rpm至OD600=0.6，所述液体培养基为LB 培养基+100mg/L利福平Rifampicin+100mg/L链霉素Streptomycin，已转质粒的农杆菌加入载体上抗性筛选基因所对应的抗生素；
4）取步骤 2）所述诱发的花生幼苗，用解剖刀将花生苗的根部完整切除，用注射器多点注射发根农杆菌（A. rhizogenes）K599至剩余下胚轴基部；
5）取经步骤 4）处理的花生苗，转移至共培养培养基黑暗培养3天，所述共培养培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂粉+ 50μM乙酰丁香酮；
6）取经步骤 5）处理的花生苗，转移至继代培养基，30℃光照培养20天，每5-6天继代一次直至毛状根发出，所述继代培养基为MS无机盐+3%蔗糖+0.8%琼脂粉, 已转质粒的农杆菌加入载体上抗性筛选基因所对应的抗生素。
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