CN110408651A - 提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法，属于基因工程领域。本发明通过从花生中克隆出分泌肽基因，构建植物基因表达载体后，利用发根农杆菌介导的方法获得含花生分泌肽基因的花生毛状根，并鉴定转基因花生毛状根中花生分泌肽基因的表达，测定花生毛状根的生物量，用Tricine SDS‑PAGE法测定花生分泌肽的表达水平，用BCA蛋白质定量检测法测定花生分泌肽的含量。本发明利用花生毛状根系统生产花生分泌肽具有操作简单、周期短、产量高、成本低且产物具有生物学活性等优点，是比较经济、高效的花生分泌肽制备方法。

Description

提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法。

背景技术

花生是重要的油料作物，但其产量极易受到外界细菌、真菌、干旱或盐渍等环境胁迫的影响，已有研究表明，花生分泌肽在植物生长发育、抗菌、耐盐碱等方面发挥重要的作用，这为改良花生抗逆抗病性提供了新的研究方向。

目前，一般采用化学合成法和DNA重组合成法合成花生分泌肽，但化学合成法存在成本较高、副产物较多、产物没有生物学活性等缺点，DNA重组合成法由于不同的植物受体转化效率差异较大，造成最终产量参差不齐。现有技术中报道了利用毛状根培养体系得到转基因毛状根实现某些功能性物质的高产，但目前关于毛状根培养体系在花生分泌肽领域未见报道，所以如何培育出转基因花生毛状根，以提高有活性的花生分泌肽的含量，这对提高花生抵御环境胁迫的能力，实现花生增产具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术存在的技术问题，提出提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法，包括以下步骤：

从花生cDNA中克隆出花生分泌肽基因后，将所述花生分泌肽基因连接到表达载体上，构建含花生分泌肽基因的植物表达载体；

将含花生分泌肽基因的植物表达载体转化至发根农杆菌，获得含花生分泌肽基因的发根农杆菌；

利用含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染花生叶片，得到被含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染的花生叶片后，诱导其产生转基因花生毛状根，转入MS培养基中培养；

鉴定所述转基因花生毛状根中花生分泌肽基因是否表达后，测定转基因花生毛状根生产花生分泌肽的能力和含量。

在上述操作中，所述提取花生总RNA的方法为Trizol抽提法或根据RNA提取试剂盒说明提取得到；所述反转录过程是使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix反转录试剂盒说明制得的；利用含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染叶片前要对花生叶片进行预处理，即在叶片上加2-3处的划痕，目的是保证发根农杆菌菌液能进入叶片内完成诱导过程。

作为优选，构建所述植物表达载体的方法采用酶切连接法或gateway系统构建法。

作为优选，利用所述含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染花生叶片的方法是浸泡法或涂抹法。

作为优选，所述含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液浓度OD₆₀₀为0.5～3.0；所述转基因花生毛状根的培养时间为4周～8周。

在上述优选中，发根农杆菌菌液浓度OD₆₀₀可选择0.5、1.0、1.5、2.0或2.5等数值，转基因花生毛状根的培养时间可选取4周、6周或8周等。

作为优选，鉴定所述转基因花生毛状根中花生分泌肽基因表达的方法为RT-PCR法或qRT-PCR法。

作为优选，在测定所述转基因花生毛状根生产花生分泌肽的能力和含量之前，还包括测定转基因花生毛状根的生物量，步骤如下：

从同一转基因花生毛状根中选择3个分支，称重后分别转入MS液体培养基中继续培养；

每隔1～2周更换新鲜的MS培养基，最后用无菌水洗净晾干，分别称取不同转基因花生毛状根鲜重，然后进行烘干处理；

测定不同转基因花生毛状根干重，最后统计不同转基因花生毛状根生物量。

作为优选，转基因花生毛状根分支的培养条件为23～26℃、150～180rpm；所述烘干处理的条件为37～40℃、20～24h，转基因花生毛状根鲜重的计算公式为：鲜重＝每瓶毛状根重量-接种重量。

在上述优选中，转基因花生毛状根的培养条件中温度可选择23、24、25或26℃等数值，转速可选择150、160、170或180rpm等数值；烘干处理条件中温度可选择37、38、39或40℃等数值，烘干时长可选择20、21、22、23或24h等数值。

作为优选，利用Tricine-SDS-PAGE法测定所述转基因花生毛状根生产花生分泌肽的能力，利用BCA蛋白质定量检测法测定所述转基因花生毛状根生产花生分泌肽的含量，包括以下步骤：

称取转基因花生毛状根的分支，转移至1/8MS液体培养基中培养7～10d；

利用分子筛富集所述1/8MS液体培养基；

对所述富集样品进行Tricine-SDS-PAGE和BCA蛋白质定量检测；

电泳结束后，进行染色。

在上述优选中，选择Tricine-SDS-PAGE法测定花生分泌肽含量有两个原因：(1)分泌肽分子量小，该电泳法能分离大小在1-100kDa的蛋白，尤其是分离分子量小于30kDa的蛋白质效果较好(2)由于不同转基因花生毛状根株系表达目的分泌肽的能力不同，因而需要通过蛋白质水平检测，筛选出较为理想的转基因株系并优化培养条件，为后续进一步扩大培养打下基础。

作为优选，染色步骤中使用的染色方法为银染法或考马斯亮蓝染色法，BCA蛋白质定量检测根据Thermo Fisher BCA蛋白质定量检测试剂盒的说明进行。

在上述优选中，选取两种染色方法的原因是蛋白质水平检测需要用较为敏感的方法，两种染色方法可以使用试剂盒，也可以配置染色液进行此项操作。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

(1)本发明提供的花生毛状根转化体系操作简单、转化效率高；

(2)本发明提供的转基因花生毛状根继代培养生物量增加迅速，并能持续培养，周期短；

(3)本发明提供的转基因花生毛状根能稳定的表达花生分泌肽并且具有生物活性，且产量较高，花生叶片没有毒性物质，不存在安全隐患，仍能作为动物饲料使用；

(4)本发明提供的转基因花生毛状根只需要在普通MS培养基上生长，培养基配置简单、成本低、无需添加生长激素，利用空间少；

(5)本发明中侵染花生叶片使用的转基因发根农杆菌浓度OD₆₀₀为0.5～2.5时，均能取得较好的诱导效率，其中OD₆₀₀在1.0～2.0范围内，诱导效率最佳；

(6)本发明中的转基因花生毛状根培养时间为4～8周时，花生毛状根的生物量增长情况良好，其中在4～6周时，生物量增加率较高。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的构建表达载体示意图；

图2为本发明实施例所提供的花生毛状根的形态图；

图3为本发明实施例所提供的不同浓度发根农杆菌诱导花生毛状根效率图；

图4为本发明实施例所提供的不同花生叶片诱导花生毛状根效率图；

图5为本发明实施例所提供的检测不同转基因花生毛状根株系转录表达分泌肽基因能力结果图；

图6为本发明实施例所提供的不同培养时间转基因花生毛状根形态图(A)及生物量变化图(B)；

图7为本发明实施例所提供的不同转基因花生毛状根株系表达分泌肽水平检测结果图；

图8为本发明实施例所提供的不同转基因花生毛状根在不同继代培养时期生产分泌肽的含量图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1：花生分泌肽基因获取

(S1)花生RNA提取

使用天根植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取花生的总RNA，具体步骤如下：

S1-1：取生长15d左右花生幼苗在液氮中充分研磨，每50-100mg组织加入400μL试剂盒中RL试剂，漩涡振荡混匀，56℃孵育1-3min，使植物组织完全裂解；

S1-2：将步骤S1-1中溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm离心5min。用剪去部分末端的吸头小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free1.5mL离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；

S1-3：缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，轻轻混匀后将溶液转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

S1-4：向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

S1-5：向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液(10μL DNase I储存液和70μLRDD缓冲液，轻柔混匀)，室温放置15min；

S1-6：再次向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

S1-7：向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，再重复一次此步骤；

S1-8：12,000rpm空转2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干残余的漂洗液；

S1-9：将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，获得RNA溶液，并置于-80℃冰箱长久保存。

(S2)反转录cDNA第一链的合成

将提取的RNA溶解后测定RNA浓度，然后使用天根FastKing gDNA Dispelling RTSuperMix反转录试剂盒进行反转录：

取2μg总RNA，加入4μL 5×FastKing-RT SuperMix，补水到20μL，42℃孵育15min，95℃酶失活3min，获得花生cDNA。

实施例2：花生分泌肽基因克隆与载体构建

将实施例1中得到的花生cDNA为模板，进行基因克隆与载体构建。

(P1)目标花生肽基因克隆

P1-1：以花生cDNA为模板，利用诺唯赞高保真酶(2×Phanta Max Master Mix,p515)扩增目标小肽，反应体系为：2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA模板1μL，水补齐到25μL；

PCR反应体系为：95℃预变性5min，95℃变性25s，55-60℃退火25s(根据引物退火温度)，72℃延伸15-30s(根据扩增长度)，35个循环，72℃后延伸5min；

P1-2：PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带切胶并进行胶回收，胶回收操作根据天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)步骤进行。

(P2)载体构建

P2-1：克隆载体构建：PCR产物与pMD19-T克隆载体过夜连接，反应体系如下：pMD19-T 0.5μL，Solution I 5.0μL和胶回收产物4.5μL。连接产物使用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄霉素的LB平板上生长过夜；

P2-2：挑取白色单个菌落进行菌落PCR，反应体系为2×Taq Master Mix10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，菌液模板1μL，水补齐到20μL，选取阳性菌落转移至5mL摇菌管中扩大培养；

P2-3：质粒DNA的提取：使用天根质粒小提中量试剂盒(DP106)提取质粒DNA；

P2-4：序列测定：测序工作由生工生物工程股份有限公司完成；

P2-5：表达载体的构建：用特定限制性内切酶酶切pCAMBIA1300和peptide-pMD19-T，37℃酶切一个小时之后，进行琼脂糖凝胶电泳，切除正确的条带进行胶回收，将胶回收产物用Thermo公司的T₄DNA连接酶连接，连接产物转化DH5α菌株，在含有卡那霉素的LB平板上生长过夜。挑取白色单个菌落进行菌落PCR，选取阳性菌落在LB液体培养基中过夜扩大培养，并利用天根质粒小提试剂盒提取质粒并酶切鉴定。用目标小肽替换pCAMBIA1300中glucuronidase，如图1所示，构建得到35S:peptide的过表达载体；

P2-6：取2.0μL质粒转化发根农杆菌R1601获得的发根农杆菌命名为peptide-R1601，准备侵染花生叶片。

实施例3：花生毛状根诱导

将实施例2中得到的peptide-R1601转化发根农杆菌进行花生叶片侵染。

(M1)花生外植体获取

准备供试的花生品种(包含2个大粒花生品种HY25花育25号、鲁花11号和2个小粒花生品种HY20花育20号、鲁花12号)种子种植于人工气候室的花盆中(底部直径36cm，花盆高26cm)，培养温度为白天28℃，夜间25℃，16h光照/8h黑暗，花生单粒种植，每盆4粒。花生幼苗生长至3-6片复叶时期，从底部向上选取2-4个复叶作为实验材料。用自来水冲洗花生叶片10min，用无菌水温和洗涤2min，用4％的次氯酸钠溶液浸泡2min，以叶柄切口处略显白色为准。然后用无菌水温和洗涤3-4次后，再用无菌水浸泡10min，晾干水分备用。

(M2)peptide-R1601菌株活化

吸取100μL保存在-80℃的转化peptide-pCAMBIA1300的发根农杆菌菌株peptide-R1601接种于100mL含卡那霉素(100μg/mL)和潮霉素(200μg/mL)的YEB液体培养基中，28℃，180rpm震荡培养18h，取100μL菌液接种于100mL新的YEB液体培养基，28℃震荡培养，连续活化3次。第三次扩大培养时，28℃震荡培养不同时间，培养至不同浓度，然后测定菌液OD₆₀₀值，选取OD₆₀₀＝0.5、1.0、1.5、2.0、2.5浓度的菌液分别用于侵染花生叶片。同时取pCAMBIA1300转化发根农杆菌R1601菌株作为对照菌株。

(M3)peptide-R1601侵染花生叶片

将消毒处理的花生叶片切成1cm左右，叶片上加2-3处划痕，用peptide-R1601侵染，操作过程如下：将处理的花生叶片没于不同OD值的peptide-R1601菌液中，浸泡5min，期间轻柔摇匀，使叶片表面充分沾满菌液，取出叶片，用无菌滤纸吸干菌液后，平整铺在MS固体培养基表面，每皿约12块花生叶片，24h后将叶片转移到添加100mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基上(抑制发根农杆菌的生长)，24h后再转移到MS固体培养基上，依次轮流在两种培养基上转移，直至peptide-R1601农杆菌不再生长为止，然后在MS固体培养基上培养，诱导分化产生花生毛状根。注意操作，防止染菌。用发根农杆菌R1601侵染的花生叶片作为对照，侵染方法一致。实验结果如图1至图3所示，图2可显示花生毛状根的形态，图3说明不同浓度发根农杆菌侵染花生叶片诱导花生毛状根的生成效率，图4可说明不同花生叶片诱导花生毛状根的效率。

结果表明，随着发根农杆菌菌液浓度提高，毛状根诱导效率也提高，当发根农杆菌菌液浓度OD₆₀₀在0.5～2.5时，均能取得较好的诱导效率，其中当发根农杆菌菌液浓度OD₆₀₀在1.0～2.0时的诱导效率更佳，当OD₆₀₀为1.5时，诱导效率最佳，随之逐渐降低。所以发根农杆菌菌液浓度选择OD₆₀₀＝1.5诱导花生毛状根。

在菌液浓度OD₆₀₀＝1.5的条件下，不同粒型不同品种花生叶片诱导毛状根效率略有差异，四种品种的花生叶片诱导毛状根效率均高达80％，其中鲁花11号诱导效率稍高，故选择鲁花11号花生叶片诱导花生毛状根。

实施例4：转基因花生毛状根RT-PCR鉴定

将实施例3中得到的花生毛状根，选取2cm以上的毛状根，转移到MS固体培养基上进行继代培养2周后，截取部分毛状根提取RNA。

(Q1)分别取不同花生毛状根(包括转化peptide-pCAMBIA1300和空载pCAMBIA1300的毛状根)，用无菌水冲洗3次，晾干备用；

(Q2)液氮研磨成粉末，利用天根植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取花生毛状根RNA。将提取的RNA溶解后测定RNA浓度，然后使用天根FastKing gDNA Dispelling RTSuperMix反转录试剂盒进行反转录获得花生毛状根cDNA；

(Q3)反转录的cDNA按5～10倍浓度稀释，利用特异性小肽引物检测合适稀释倍数，在最适稀释倍数下将cDNA再稀释5倍作为RT-PCR模板，以花生分泌肽和内参基因actin11特异性引物分别进行RT-PCR扩增；

反应体系为：2×Phanta Max Master Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA模板5μL，水补齐到25μL。该体系是改良体系，cDNA稀释5倍后再作为模板可以减少误差；

PCR反应体系为：95℃预变性5min，95℃变性25s，55-60℃退火25s(根据引物退火温度)，72℃延伸15-30s(根据扩增长度)，选取25-35个循环的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，筛选获得比较合适的PCR循环数进行RT-PCR实验；

(Q4)以内参基因actin11为引物，通过多次PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，增减样品模板量，使最终不同样本内参基因扩增获得的目的条带亮度一致。以此样本上样量为最终实验模板量，使用小肽特异性引物再次进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳获得的不同样本中花生分泌肽目的条带亮度就是不同转基因毛状根中花生分泌肽的转录能力。

结果表明，如图5所示，不同转基因花生毛状根株系转录表达花生分泌肽的能力不同，其中株系1、2、3转录表达水平较高，株系4、5转录表达水平低。

实施例5：转基因花生毛状根生物量测定

对继代培养的转基因花生毛状根进行形态学观察，然后从同一转基因花生毛状根株系再分别选择3个分枝，称重后分别转移至100mL MS液体培养基中，25℃，160rpm，继代培养，连续培养6周，期间每隔2周更换新鲜的MS液体培养基，最后用无菌水洗净晾干，分别称不同转基因花生毛状根鲜重(鲜重＝每瓶毛状根重量-接种重量)，即为花生毛状根生物量；然后将花生毛状根转移至37℃培养箱中烘干，大约需要24h，测定不同转基因花生毛状根干重；最后统计不同转基因毛状根干鲜重之比，图6A显示了不同培养时期花生毛状根形态图，图6B为不同转基因花生毛状根株系的生物量。

结果表明，株系1培养4周时，生物量为2.43g，培养6周时，生物量为11.10g，培养8周时，生物量为14.27g，从第4～8周，生物量增加了487.24％；其中，株系2培养4周时，生物量为2.53g，培养6周时，生物量为15.90g，培养8周时，生物量为18.60g，从第4～8周，生物量增加了635.18％；其中，株系3培养4周时，生物量为2.46g，培养6周时，生物量为12.40g，培养8周时，生物量为16.00g，从第4～8周，生物量增加了550.41％；其中，株系4培养4周时，生物量为1.70g，培养6周时，生物量为7.30g，培养8周时，生物量为9.10g，从第4～8周，生物量增加了435.30％；其中，株系5培养4周时，生物量为1.80g，培养6周时，生物量为5.57g，培养8周时，生物量为7.83g，从第4～8周，生物量增加了335.00％，其中株系2的生长速率最快，株系3次之，总之随着培养时间的不断增加，株系1～5均呈现生物量逐渐增加的趋势。

实施例6：转基因花生毛状根生产花生分泌肽含量检测

选取不同继代培养时期、不同转基因花生毛状根株系的分支，分别转移至100mL1/8MS液体培养基中，25℃，160rpm，培养7-10d，用分子筛将1/8MS液体培养液富集，利用Tricine SDS-PAGE及银染检测不同样品花生分泌肽的含量的高低，包括以下步骤：

(N1)Tricine SDS-PAGE：

N1-1：清洗Tricine SDS-PAGE制胶用的所有装置，包括玻璃板、卡槽、梳子等，晾干备用；

N1-2：制胶装置组装好后加水验漏，确保装置严密后将水倒出，用吸水纸吸净多余水分；

N1-3：配置分离胶

7mL分离胶：2.5mL Acr-Bis溶液(46.5g Arc，3g Bis，定容至100mL)，2.5mL gelbuffer(36.342g Tris-base，3g SDS，用浓盐酸调pH8.45，定容至100mL)，0.6mL甘油，25μL10％APS，2.5μL TEMED，1.75mL ddH₂O；

迅速混匀后从玻璃板两侧缓慢装填到配胶装置(每块需要～6.5mL)。

N1-4：加ddH₂O封板：用移液器将水沿着玻璃板边缘缓慢加入，压平分离胶胶面，同时赶出制胶时产生的气泡。室温或28℃培养箱中静置30min。等待分离胶完全凝固后将水倒出，用吸水纸轻轻吸净多余水分；

N1-6：然后配置浓缩胶

3mL浓缩胶：1.8mL ddH₂O，0.3mL Acr-Bis溶液，0.9mL gel buffer，27μL10％APS，2.7μL TEMED；

混匀后从玻璃板两侧缓慢加入到分离胶上方，迅速插入梳子，室温或28℃培养箱中静置30min，使浓缩胶完全凝固；

N1-7：完全凝固后将制胶装置外壳拆除，置于电泳槽，倒入足量电泳液，拔出梳子进行点样，接通电泳仪，设置30V恒压，10min。随后调整电压为100V，恒压1.5h。

(N2)银染或考马斯亮蓝染色

电泳结束后去掉浓缩胶，将分离胶切下，银染实验按照碧云天快速银染试剂盒操作步骤(P0017S)进行，考马斯亮蓝染色按照碧云天考马斯亮蓝染色液(P0017)步骤进行操作。

(N3)检测不同花生转基因毛状根株系分泌肽表达水平。

用Thermo Fisher BCA蛋白质定量检测试剂盒定量检测不同转基因花生毛状根系生产分泌肽的含量。

考马斯亮蓝染色分析结果表明(图7)，转基因花生毛状根株系2和株系3目的条带清晰，说明能成功表达分泌肽，而转基因花生毛状根株系1、4、5与侵染R1601转基因花生毛状根对照相似，未检测到目的条带，表明这些毛状根材料未表达或表达分泌肽的量较少，无法检测到。

BCA测定转基因花生毛状根分泌肽含量的结果表明(图8)，株系1～5的分泌肽含量均随着转基因花生毛状根培养时间的增加而增加，培养至6周时，分泌肽含量达到峰值，随之逐渐降低。其中，株系2和3的分泌肽含量较高，株系2培养至4周时，分泌肽含量为8.23μg/g，培养至6周时，分泌肽含量为23.23μg/g，从第4～6周，分泌肽含量增加了182.26％，株系3培养至4周时分泌肽含量为7.13μg/g，培养至6周时，分泌肽含量为18.00μg/g，从第4～6周，分泌肽含量增加了152.45％。因此，可以将转基因花生毛状根的培养条件优化为选取株系2或3作为待培养的转基因花生毛状根体系，培养至6周，花生分泌肽含量达到峰值。

由于培养至4～6周与培养至8周的转基因花生毛状根的生物量都处在上升阶段，但培养至8周时花生分泌肽的含量却呈下降趋势，针对此问题作出相关机理分析，分析内容如下：

推测可能是转基因花生毛状根在4～6周属于快速生长阶段，生物量增长较快，外源蛋白的表达量增加也较快。随着培养时间的增加，溶氧量和培养基营养供应等方面限制转基因花生毛状根的生长和外源蛋白的表达。如图5所示，培养至6～8周时，虽然转基因花生毛状根生物量在增加，但是增加速率明显低于4～6周。并且随着继代培养时间的增加，转基因花生毛状根的活性会不断降低，其表达分泌肽的能力也会随之下降。

Claims (9)

1.提高花生毛状根花生分泌肽含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

从花生cDNA中克隆出花生分泌肽基因后，将所述花生分泌肽基因连接到表达载体上，构建含花生分泌肽基因的植物表达载体；

将含花生分泌肽基因的植物表达载体转化至发根农杆菌，获得含花生分泌肽基因的发根农杆菌；

利用含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染花生叶片，得到被含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染的花生叶片后，诱导其产生转基因花生毛状根，转入MS培养基中培养；

鉴定所述转基因花生毛状根中花生分泌肽基因是否表达后，测定转基因花生毛状根生产花生分泌肽的能力和含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，构建所述植物表达载体的方法采用酶切连接法或gateway系统构建法。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用所述含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液侵染花生叶片的方法是浸泡法或涂抹法。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含花生分泌肽基因的发根农杆菌菌液浓度OD₆₀₀为0.5～3.0；所述转基因花生毛状根的培养时间为4周～8周。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，鉴定所述转基因花生毛状根中花生分泌肽基因表达的方法为RT-PCR法或qRT-PCR法。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在测定所述转基因花生毛状根生产花生分泌肽的能力和含量之前，还包括测定转基因花生毛状根的生物量，步骤如下：

从同一转基因花生毛状根中选择3个分支，称重后分别转入MS液体培养基中继续培养；

每隔1～2周更换新鲜的MS培养基，最后用无菌水洗净晾干，分别称取不同转基因花生毛状根鲜重，然后进行烘干处理；

测定不同转基因花生毛状根干重，最后统计不同转基因花生毛状根生物量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，转基因花生毛状根分支的培养条件为23～26℃、150～180rpm；所述烘干处理的条件为37～40℃、20～24h，转基因花生毛状根鲜重的计算公式为：鲜重＝每瓶毛状根重量-接种重量。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用Tricine-SDS-PAGE法测定所述转基因花生毛状根生产花生分泌肽的能力，利用BCA蛋白质定量检测法测定所述转基因花生毛状根生产花生分泌肽的含量，包括以下步骤：

称取转基因花生毛状根的分支，转移至1/8MS液体培养基中培养7～10d；

利用分子筛富集所述1/8MS液体培养基；

对所述富集样品进行Tricine-SDS-PAGE和BCA蛋白质定量检测；

电泳结束后，进行染色。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，染色步骤中使用的染色方法为银染法或考马斯亮蓝染色法，BCA蛋白质定量检测根据Thermo Fisher BCA蛋白质定量检测试剂盒的说明进行。