CN110055274A - 一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，具体包括以下步骤方法,S1、R1601‑hEGF菌株构建；S2、转hEGF花生毛状根的诱导与筛选；S3、转hEGF花生毛状根的摇瓶培养；S4、花生毛状根中hEGF的含量测定与蛋白特征分析。本发明通过花生毛状根技术实现高效安全表达hEGF，具有培养简便，培养成本低廉，hEGF含量高的优点，且宿主安全性高，具有较强的竞争优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，本发明还涉及含有hEGF表达载体的侵染菌株构建方法以及利用该侵染菌株侵染花生叶片获得转hEGF花生毛状根的方法。
背景技术
人表皮生长因子(Human Epidemal Growth Factor，hEGF)可用于烧伤，美容，胃病治疗、角膜移植手术及肿瘤等方面的治疗和应用，具有巨大的经济效益和应用前景，目前许多国家已经批准hEGF作为基因工程药物进入I期临床试验或者成为商品。
现已通过不同的途径来分离和提取hEGF。而直接从组织中提取hEGF比较困难且产量低；化学合成hEGF存在产率低等问题，远远满足不了人们对hEGF的需求。而关于hEGF的转基因植物生产的报道主要集中在利用根癌农杆菌介导法进行转染烟草和番茄的研究，都不尽理想。植物毛状根表达系统作为药用蛋白生物反应器具有成本低廉，易于规模化生产，与人无交叉感染，使用安全等优点，具有极大的商业应用价值。利用植物毛状根技术进行hEGF表达，仅见在烟草毛状根中有报道，但烟草含有多种有害的生物碱，不利于hEGF的提纯或对烟草毛状根的综合开发利用。本发明基于寻求更安全植物表达宿主，将毛状根株系整株开发的理念，以植物毛状根表达系统为基础，选取农业生产上已经证明安全的植物材料花生(其植株是优良的牧草)为研究对象，将hEGF转化花生毛状根，探究hEGF在花生毛状根中的表达情况及毛状根的可持续培养能力，为综合利用花生毛状根合成hEGF提供技术支持，针对以上所述，那么如何发明出一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，这成为我们需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，解决了背景技术中所提出的问题。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，具体包括以下步骤方法,S1、R1601-hEGF菌株构建；S2、转hEGF花生毛状根的诱导与筛选；S3、转hEGF花生毛状根的摇瓶培养；S4、花生毛状根中hEGF的含量测定与蛋白特征分析。
作为本发明的进一步优选方式，将pCAMBIA1300Ⅰ质粒用BamHI、SacI双酶切，回收pCAMBIA1300Ⅰ质粒大片段，将hEGF与pCAMBIA1300Ⅰ大片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR验证，挑取转化成功的大肠杆菌DH5α菌落接种于LB液体培养基中37℃培养后，提取质粒DNA，即为构建的hEGF表达载体(命名为pCAMBIA1300I-hEGF)，于-20℃保存备用。将pCAMBIA1300I-hEGF转化发根农杆菌R1601感受态细胞，利用pCAMBIA1300I-hEGF表达载体的潮霉素抗性和发根农杆菌R1601的卡那霉素抗性，通过潮霉素和卡那霉素的双重抗性筛选，得到含有pCAMBIA1300I-hEGF的侵染菌株，28℃培养2-3天后，挑取单菌落进行菌落PCR验证，对转化成功的发根农杆菌R1601(命名为R1601-hEGF)。
作为本发明的进一步优选方式，利用吸光度值(OD600)为1.0-1.5的R1601-hEGF菌液侵染鲁花11号花生的幼嫩叶片(并用发根农杆菌R1601侵染作为对照)，25℃，16小时光照，8小时暗培养，进行毛状根的诱导；每隔24小时转移至含头孢噻肟钠500mg/L的固体MS培养基，根据R1601-hEGF生长情况，在含头孢噻肟钠500mg/L的固体MS培养基和固体MS培养基之间进行转换，直至没有R1601-hEGF生长，然后放置于固体MS培养基，约2周即可诱导出毛状根。将毛状根从花生叶上切下，置于MS固体培养基上继代培养，用于PCR鉴定转入hEGF的花生毛状根，将转hEGF花生毛状根提取总蛋白，SDS-PAGE验证hEGF的表达，选择6.5KDa附近条带清晰且蛋白条带浓的毛状根株系继代培养。
作为本发明的进一步优选方式，将筛选的转hEGF花生毛状根，截取2厘米以上，置于100ml MS液体培养基中，25℃±1℃，150rpm培养4-10周。
作为本发明的进一步优选方式，将培养的转hEGF花生毛状根，每2周取样分析毛状根中的hEGF表达水平，其中到第6周时hEGF表达水平进入平台期，用ELISA法测hEGF含量高达18.75μg/g(干重)，MTT实验表明花生毛状根表达的hEGF具有生物学活性，能够促进人肝细胞活力，LC-MS-MS检测表明表达的hEGF氨基酸序列与天然的hEGF序列一致。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明通过构建hEGF表达载体(命名为pCAMBIA1300I-hEGF)，把该表达载体转化到发根农杆菌R1601菌株(命名为R1601-hEGF)，并用转化的发根农杆菌R1601侵染菌株侵染花生幼嫩的叶片，将侵染的叶片于MS固体培养基培养，诱导得到花生毛状根，筛选到表达hEGF蛋白的高表达株系，通过植物毛状根技术实现高效安全表达hEGF蛋白，通过SDS-PAGE、LC-MS-MS、MTT实验和ELISA实验等进行鉴定，hEGF含量高达18.75μg/g(干重)，并且具有生物学活性。通过花生毛状根技术实现高效安全表达hEGF，具有培养简便，培养成本低廉，hEGF含量高的优点，且宿主安全性高，具有较强的竞争优势。
附图说明
图1为R1601-hEGF侵染诱导花生毛状根示意图；
图2为PCR技术分析hEGF在花生毛状根中的整合的电泳图谱；
图3为转hEGF花生毛状根继代培养示意图；
图4为转hEGF花生毛状根表达的hEGF MALDI-TOF-TOF检测示意图；
图5为转hEGF花生毛状根表达的hEGF活性分析示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-5，本实用发明提供一种技术方案：一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，具体包括以下步骤方法,S1、R1601-hEGF菌株构建；S2、转hEGF花生毛状根的诱导与筛选；S3、转hEGF花生毛状根的摇瓶培养；S4、花生毛状根中hEGF的含量测定与蛋白特征分析。
步骤S1中，将pCAMBIA1300Ⅰ质粒用BamHI、SacI双酶切，回收pCAMBIA1300Ⅰ质粒大片段，将hEGF与pCAMBIA1300Ⅰ大片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR验证，挑取转化成功的大肠杆菌DH5α菌落接种于LB液体培养基中37℃培养后，提取质粒DNA，即为构建的hEGF表达载体(命名为pCAMBIA1300I-hEGF)，于-20℃保存备用。将pCAMBIA1300I-hEGF转化发根农杆菌R1601感受态细胞，利用pCAMBIA1300I-hEGF表达载体的潮霉素抗性和发根农杆菌R1601的卡那霉素抗性，通过潮霉素和卡那霉素的双重抗性筛选，得到含有pCAMBIA1300I-hEGF的侵染菌株，28℃培养2-3天后，挑取单菌落进行菌落PCR验证，对转化成功的发根农杆菌R1601(命名为R1601-hEGF)。
步骤S2中，利用吸光度值(OD600)为1.0-1.5的R1601-hEGF菌液侵染鲁花11号花生的幼嫩叶片(并用发根农杆菌R1601侵染作为对照)，25℃，16小时光照，8小时暗培养，进行毛状根的诱导；每隔24小时转移至含头孢噻肟钠500mg/L的固体MS培养基，根据R1601-hEGF生长情况，在含头孢噻肟钠500mg/L的固体MS培养基和固体MS培养基之间进行转换，直至没有R1601-hEGF生长，然后放置于固体MS培养基，约2周即可诱导出毛状根。将毛状根从花生叶上切下，置于MS固体培养基上继代培养，用于PCR鉴定转入hEGF的花生毛状根，将转hEGF花生毛状根提取总蛋白，SDS-PAGE验证hEGF的表达，选择6.5KDa附近条带清晰且蛋白条带浓的毛状根株系继代培养。
步骤S3中，将筛选的转hEGF花生毛状根，截取2厘米以上，置于100ml MS液体培养基中，25℃±1℃，150rpm培养4-10周。
步骤S4中，将培养的转hEGF花生毛状根，每2周取样分析毛状根中的hEGF表达水平，其中到第6周时hEGF表达水平进入平台期，用ELISA法测hEGF含量高达18.75μg/g(干重)，MTT实验表明花生毛状根表达的hEGF具有生物学活性，能够促进人肝细胞活力，LC-MS-MS检测表明表达的hEGF氨基酸序列与天然的hEGF序列一致。
实施例一
hEGF扩增及R1601-hEGF菌株构建
以合成在pBluescript II SK(+)载体上的hEGF为模板，根据hEGF序列，采用GeneTool软件设计引物hEGF1(5′-GGATCCATGAACAGTGATTCAGAATGTCCTC-3′)和hEGF2(5′-GAGCTCCTATCGCAGTTCCCACCATTTC-3′)进行PCR扩增。得到含hEGF的177bp目的条带。将其连接到pMDTM19(simple)载体，转化大肠杆菌DH5α，用引物hEGF1和hEGF2进行PCR扩增hEGF，筛选转化成功的大肠杆菌DH5α株系，将转化成功的菌株测序，确定hEGF与载体连接的正确性(命名为pMDTM19-hEGF)。将pMDTM19-hEGF用BamHI和SacI双酶切，回收含hEGF的177bp目的条带。将pCAMBIA1300Ⅰ载体用BamHI和SacI进行双酶切反应，回收大片段。将含hEGF的177bp目的条带和pCAMBIA1300Ⅰ载体大片段连接，转化大肠杆菌DH5α，用引物hEGF1和hEGF2进行PCR扩增hEGF，筛选转化成功的大肠杆菌DH5α株系，将转化成功的菌株测序，确定hEGF与载体连接的正确性(命名为pCAMBIA1300I-hEGF)。将pCAMBIA1300I-hEGF转化发根农杆菌R1601。筛选转化菌落，对含有hEGF的单菌落(命名为R1601-hEGF)，保存备用。
实施例二
转hEGF花生毛状根株系的建立
将花生(鲁花11号)种子种植于花盆中，室温、自然光照、潮湿土壤环境下生长至3-5个复叶时期，从底部向上选取2-4个复叶作为实验材料。将花生叶片，自来水流水冲洗10min，晾干水分，用4％的次氯酸钠溶液浸泡除菌5min，以叶柄切口处略显白色为准。倒掉4％的次氯酸钠溶液，用无菌水温和洗涤，洗涤2-3次后，再用无菌水浸泡10min，去掉无菌水备用。将保存在-80℃的发根农杆菌R1601-hEGF菌株接种于含卡那霉素(100μg/mL)和潮霉素(200μg/mL)的YEB固体培养基中，28℃培养2-3天后，挑取单菌落接种于100mL含卡那霉素(100μg/mL)和潮霉素(200μg/mL)的YEB液体培养基中，28℃，180rpm，16h后，取100μL菌液接种于100ml新的YEB液体培养基，连续活化3次，然后测定菌液OD600值，取1.0-1.5用于侵染花生叶片。同时取发根农杆菌R1601菌株作为对照菌株(活化时，培养基中不添加潮霉素)。将无菌处理的花生叶片切成1cm左右，并做2-3处划痕处理，用发根农杆菌R1601-hEGF侵染，浸泡2min后取出叶片，用无菌滤纸吸干菌液后置于MS固体培养基表面，每皿约8-12块花生叶片，24h后将叶片转移到含有100mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基上，24h后再转移到MS固体培养基上，依次轮流在两种培养基上转移，直至发根农杆菌R1601-hEGF菌株不再生长为止，然后在MS固体培养基上培养，诱导分化毛状根。用发根农杆菌R1601作为对照，侵染方法一致；同时做无侵染花生叶片为对照，除不与发根农杆菌R1601-hEGF及发根农杆菌R1601接触外，其余操作均相同。选取2cm以上的毛状根(图1)，转移到MS固体培养基上进行继代培养2周后，截取部分毛状根提取DNA，用引物hEGF1和hEGF2进行PCR扩增hEGF，筛选转化成功的花生毛状根株系(图2)，继续培养2周后，提取毛状根中的蛋白用SDS-PAGE进一步确认转化成功的花生毛状根株系。
实施例三
选取表达hEGF的花生毛状根株系继代培养，25℃，160rpm，100mL MS液体培养基继代培养，每隔2周更换新配制的MS液体培养基，连续培养10周(图3)，仍保持旺盛的生长能力，说明；每2周取样，于37℃烘干称量干重，提取蛋白，分析毛状根中的hEGF表达水平，并用发根农杆菌R1601侵染的毛状根对照。用ELISA法测hEGF含量，高达18.75μg/g(干重)，培养至第6周时hEGF表达水平进入平台期。LC-MS-MS检测表明表达的hEGF氨基酸序列与天然的hEGF序列一致(图4)。MTT实验表明花生毛状根表达的hEGF具有生物学活性，能够促进人肝细胞株HL-7702活力(图5)。
综上，本发明通过构建hEGF表达载体(命名为pCAMBIA1300I-hEGF)，把该表达载体转化到发根农杆菌R1601菌株(命名为R1601-hEGF)，并用转化的发根农杆菌R1601侵染菌株侵染花生幼嫩的叶片，将侵染的叶片于MS固体培养基培养，诱导得到花生毛状根，筛选到表达hEGF蛋白的高表达株系，通过植物毛状根技术实现高效安全表达hEGF蛋白，通过SDS-PAGE、LC-MS-MS、MTT实验和ELISA实验等进行鉴定，hEGF含量高达18.75μg/g(干重)，并且具有生物学活性。通过花生毛状根技术实现高效安全表达hEGF，具有培养简便，培养成本低廉，hEGF含量高的优点，且宿主安全性高，具有较强的竞争优势。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，其特征在于：具体包括以下步骤方法,S1、R1601-hEGF菌株构建；S2、转hEGF花生毛状根的诱导与筛选；S3、转hEGF花生毛状根的摇瓶培养；S4、花生毛状根中hEGF的含量测定与蛋白特征分析。
2.根据权利要求1所述的一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，其特征在于：步骤S1中，将pCAMBIA1300Ⅰ质粒用BamHI、SacI双酶切，回收pCAMBIA1300Ⅰ质粒大片段，将hEGF与pCAMBIA1300Ⅰ大片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取单菌落进行菌落PCR验证，挑取转化成功的大肠杆菌DH5α菌落接种于LB液体培养基中37℃培养后，提取质粒DNA，即为构建的hEGF表达载体(命名为pCAMBIA1300I-hEGF)，于-20℃保存备用。将pCAMBIA1300I-hEGF转化发根农杆菌R1601感受态细胞，利用pCAMBIA1300I-hEGF表达载体的潮霉素抗性和发根农杆菌R1601的卡那霉素抗性，通过潮霉素和卡那霉素的双重抗性筛选，得到含有pCAMBIA1300I-hEGF的侵染菌株，28℃培养2-3天后，挑取单菌落进行菌落PCR验证，对转化成功的发根农杆菌R1601(命名为R1601-hEGF)。
3.根据权利要求1所述的一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，其特征在于：步骤S2中，利用吸光度值(OD600)为1.0-1.5的R1601-hEGF菌液侵染鲁花11号花生的幼嫩叶片(并用发根农杆菌R1601侵染作为对照)，25℃，16小时光照，8小时暗培养，进行毛状根的诱导；每隔24小时转移至含头孢噻肟钠500mg/L的固体MS培养基，根据R1601-hEGF生长情况，在含头孢噻肟钠500mg/L的固体MS培养基和固体MS培养基之间进行转换，直至没有R1601-hEGF生长，然后放置于固体MS培养基，约2周即可诱导出毛状根；将毛状根从花生叶上切下，置于MS固体培养基上继代培养，用于PCR鉴定转入hEGF的花生毛状根，将转hEGF花生毛状根提取总蛋白，SDS-PAGE验证hEGF的表达，选择6.5KDa附近条带清晰且蛋白条带浓的毛状根株系继代培养。
4.根据权利要求1所述的一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，其特征在于：步骤S3中，将筛选的转hEGF花生毛状根，截取2厘米以上，置于100ml MS液体培养基中，25℃±1℃，150rpm培养4-10周。
5.根据权利要求1所述的一种利用花生毛状根技术表达人表皮生长因子的方法，其特征在于：步骤S4中，将培养的转hEGF花生毛状根，每2周取样分析毛状根中的hEGF表达水平，其中到第6周时hEGF表达水平进入平台期，用ELISA法测hEGF含量高达18.75μg/g(干重)，MTT实验表明花生毛状根表达的hEGF具有生物学活性，能够促进人肝细胞活力，LC-MS-MS检测表明表达的hEGF氨基酸序列与天然的hEGF序列一致。
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| CN110786245A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-02-14 | 山东省花生研究所 | 一种花生组培苗根诱导培养基及其制备方法和应用 |
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