JP4858790B2 - 植物生長調整補助剤を使用した再分化植物体の作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、植物体の一部を細胞分裂して誘導した組織塊であるカルスを効率よく短期間に再分化させるグルタチオンからなる植物生長調整補助剤、及び該植物生長調整補助剤を使用した再生植物体の作製方法に関する。

植物体のもつ分化全能性を利用した組織培養技術は、均質な優良クローンの増産、ウィルスフリー植物の再生、新品種作出を目的とした育種に不可欠なものになっている。植物体の組織培養技術は、通常、カルス培養等によってカルス等の組織を増殖させ、次いで増殖組織を再分化させている。これらの組織培養技術で用いられる基本培地や炭素源及び植物生長調整剤（植物ホルモン）の種類、濃度あるいは培養温度等が大きな役割を担っていることが知られている。
しかしながら、異なる品種間では培養に用いる培地組成も異なり、共通する一般的手法の確立が困難で、それぞれの品種固有の技術にたよらざるを得ない。また、同一種内においても、用いる植物種の倍数性などの遺伝的な要因や培養材料（外植体）のエイジなどの生理的な要因によって、安定的な再現性を得ることが困難になることが多い。再分化が効率よく得られる植物材料においても、同調性に欠ける場合がある。
また、カルスを継代培養していくに従って分化能が徐々に低下していくことも知られており、カルスを経由して大量の再分化体を得ようとする場合は、その都度カルス誘導が必要となる。

高等植物へ外来遺伝子を導入する形質転換系や細胞融合には組織培養技術が応用されている。例えば、アグロバクテリウム形質転換法においては、植物片又はカルスにアグロバクテリウムを感染させたあと、選抜用抗生物質を含む再分化培地に移して培養を行い、外来遺伝子が導入された細胞を選抜しつつ再分化させる過程を経る。この際、植物種によっては植物細胞内に外来遺伝子が導入されているにもかかわらず、再分化能の低さから形質転換効率が著しく低い、または形質転換体が得られない場合がある。また、遠縁の組み合わせによる細胞融合雑種の作出では、融合細胞が得られた場合でも、再分化能が低いために途中の段階で一方の染色体が脱落してしまったり、完全な植物体へと再分化できないという問題もある。
このように、その形質転換の成否を決定する要因は、目的とする植物の組織培養技術（再分化技術）であると考えられている。

従来、効率よく短期間で再分化させるために、いくつかの提案がなされてきた。例えば、特許文献１には、ポテトエクストラクトを添加したカルス増殖培地で培養して得られた不定胚様のカルスを主要無機塩類濃度を低減した再分化培地に移植することによるイネ科植物の再生方法が、特許文献２には、増殖させたカルスをある程度乾燥させてから再分化培地に移植し、静置培養するイグサのカルス再分化法が、特許文献３には、サイトカイニン系の植物ホルモンを含有するｐＨ調整された合成培地に置床して培養するケナフのカルス再分化方法が、特許文献４には、スターチスの植物体の一部をピクロラムを含有する培地で培養し、カルスを誘導、培養増殖し、そのカルスをサイトカイニンを含有する培地で培養する再分化植物体を作製する方法が、それぞれ報告されている。
更に、特許文献５、６及び７には、エンターバクター属、バチルス属あるいはシュードモナス属に属する微生物を培養し、該培養液から抽出した植物カルス細胞分化剤が開示されている。
しかしながら、これら方法はいずれも品種や生理的な要因が限定的であると共に、その効果も十分なものとは言い難かった。

特開平５−２１９８５１号公報 特開平６−１５３７３０号公報 特開２０００−２１７４５７号公報 特開２０００−２７０８５４号公報 特開平５−４９４７０号公報、 特開平１０−１９１９６６号公報、 特開平１０−２２９８７５号公報

従って、本発明は、再分化の基本培地に添加することで誘導条件の統一性に寄与でき、効率よく短期間で再分化体が得られる植物生長調整補助剤を提供することを課題とする。また、本発明は、植物体の一部から誘導されたカルスを効率よく短期間で再分化させる方法を提供することを課題とする。

かかる課題を解決するための手段は、下記の通りである。
（１）グルタチオンからなる植物生長調整補助剤、
（２）グルタチオンが酸化型グルタチオンである、上記（１）記載の植物生長調整補助剤、
（３）植物体の一部から誘導されたカルスを、グルタチオンを含有する培地で培養することを特徴とする、再分化植物体の作製方法、
（４）グルタチオンが酸化型グルタチオンである、上記（３）記載の再分化植物体の作製方法、
（５）植物体がイネである上記（３）又は（４）記載の再分化植物体の作製方法、
（６）植物体がトルコギキョウである上記（３）又は（４）記載の再分化植物体の作製方法。

本発明によると、再分化の基本培地に添加するだけで、発根を促進し、効率よく短期間でカルスから再分化体が得られる植物生長調整補助剤、及び該植物生長調整補助剤を使用した再分化植物体の作製方法が提供される。

トルコギキョウの幼植物体から誘導されたカルスを再分化寒天培地に移した状態の写真である。 トルコギキョウ：再分化培地に移して３０日目の、滅菌水をスポットした培地の細胞の写真である。 トルコギキョウ：再分化培地に移して３０日目の、１ｍＭＧＳＳＧ溶液をスポットした培地の細胞の写真である。 トルコギキョウ：再分化培地に移して３０日目の、１０ｍＭＧＳＳＧ溶液をスポットした培地の細胞の写真である。 トルコギキョウ：再分化培地に移して３０日目の、１００ｍＭＧＳＳＧ溶液をスポットした培地の細胞の写真である。 トルコギキョウ：図４のシャーレを裏から見た拡大写真（一部）である。 トルコギキョウ：図５のシャーレを裏から見た写真である。 イネ：再分化培地に移して４日目の、滅菌水をスポットした培地の細胞の写真である。 イネ：再分化培地に移して４日目の、１０ｍＭＧＳＳＧ溶液をスポットした培地の細胞の写真である。 イネ：図９のＣの四角囲み内の拡大写真である。 イネ：図９のＤの四角囲み内の拡大写真である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいう植物体とは、作物、野菜、果樹、花きなどが挙げられ、好ましくはイネ科、リンドウ科などの植物があげられ、更に好ましくはイネ、トルコギキョウなどである。
また、植物体の一部とは、カルス誘導可能な植物体の一部、例えば、葉、茎、根、葯、子葉、胚軸などが挙げられる。

本発明の植物生長調整補助剤であるグルタチオンは、グルタミン酸、システイン及びグリシンを構成アミノ酸とするトリペプチドで、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオン、及びこれらの混合物のいずれでもよいが、酸化型グルタチオンが特に好ましい。
グルタチオンは、培地、好ましくは再分化培地に添加される。添加方法は任意であるが、固体培地を用いる場合は、グルタチオンの１ｍＭ〜５００ｍＭ溶液、好ましくは５〜１００ｍＭ溶液、として添加、液体培地を用いる場合は、グルタチオン濃度として０．０１ｍＭ〜１０ｍＭとなるように添加することが好ましい。これより濃度が低いと再分化効率があがらず、一方、これを超えて用いても効果はなく、逆に再分化効率が低下する場合がある。

本発明の再分化植物体の作製方法において用いられるカルスは、植物体の一部から誘導されたものであり、形質転換系のものでも良い。
植物体の一部からカルスの誘導は、従来公知の方法を用いることができる。すなわち、植物体の一部を、植物組織培養に用いられている培地、例えば、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｎ₆培地等の基本培養液に、ショ糖などの栄養源を加え、これに植物ホルモン、例えば２，４−ジクロロフェノキシ酢酸等のオーキシン、カイネチン、ベンジルアデニン等のサイトカイニン等を加えて調整される固体培地あるいは液体培地で培養することにより、カルスを得ることができる。
カルスを誘導する培養条件は、光存在下あるいは不存在下、１５〜３５℃で静置あるいは振とう培養すればよい。

誘導されたカルスは、増殖（継代）培地に移植され培養されるが、直接、後述する再分化培地に移植することもできる。
増殖（継代）培地は、前記のＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｎ₆培地等に、糖類、無機塩、ビタミン、オーキシン、必要に応じてアミノ酸等を添加したものであり、固体培地を用いることができるが液体培地が好ましい。
培養条件は、カルス誘導培養条件と同様である。
増殖培地においては、カルスの継代を１〜４週間毎に行うことが好ましい。

このようにして得られたカルスを再分化するには、再分化培地にグルタチオンが添加された培地が用いられる。
グルタチオンの添加方法は任意であるが、例えば、再分化培地として固体培地を用い、固体培地上に置いたろ紙に添加する場合は、グルタチオンの１〜５００ｍＭ溶液、好ましくは５〜１００ｍＭ溶液、として添加（グルタチオンとして０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．０５ｍｇ〜２ｍｇ）、また、液体培地を用いる場合は、グルタチオン濃度として０．０１ｍＭ〜１０ｍＭとなるようにグルタチオンあるいはその溶液を添加すること、が好ましい。また、グルタチオンは水溶液中では不安定なため、特に液体培地において
は、数度にわたって添加することが望ましい。
グルタチオンの濃度がこれより低いと再分化効率があがらず、一方、これを超えて用いても効果はなく、逆に再分化効率が低下する場合がある。
用いられる再分化培地としては、従来公知の培地が用いられ、例えば、上述したＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｎ₆培地等に、糖類、無機塩、ビタミン、オーキシン、必要に応じてアミノ酸等が添加されたものである。
培地は固体培地あるいは液体培地を用いることができるが、固体培地の方が好ましい。固体培地を調整するときのゲル化剤としては、寒天、ジェランガム等が挙げられる。
培養条件は、光存在下、１５〜３５℃で静置培養することが望ましい。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
実施例１
カルス誘導寒天培地（ＭＳ４Ｄ）にトルコギキョウ（Eustoma grandiflorum）の幼植物体を移し、１４時間明期・１０時間暗期、２５℃の条件下で培養した。約８週間後に誘導されたカルスを以下の実験に供した。
再分化寒天培地（Ｒ２Ｒからナフタレン酢酸及びゼアチンを除いたもの）の９ｃｍ角シャーレ中央部に１ｃｍ×８．５ｃｍのろ紙を置き、ろ紙上に２００μＬの１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）溶液又は滅菌水をスポットしたあと、培地上にカルスを移し、１４時間明期・１０時間暗期、２５℃の条件下で培養した。再分化寒天培地に移した状態のカルスを図１に示す。
再分化培地に移して３０日目の細胞を観察したところ、滅菌水をスポットした培地の細胞では緑化と細胞増殖は認められたものの、発根は認められなかった（図２）。
これに対してＧＳＳＧ溶液をスポットした培地の細胞では、１ｍＭ（図３）、１０ｍＭ（図４）、１００ｍＭ（図５）と、濃度依存的に根の伸長度及び発根頻度が高かった。根はトルコギキョウに特有の緑根であった。（図６は図４のシャーレを裏から見た拡大写真（一部）、図７は図５のシャーレを裏からみた写真である。）
ＧＳＳＧの濃度依存的に発根が促進されたことから、ＧＳＳＧには再分化過程において発根を促進する効果があることが分かる。

実施例２
カルス誘導寒天培地（ＭＳ４Ｄ）に種皮を除き滅菌したイネ（日本晴品種）種子をまき、３０℃の連続光下で培養した。４週間後に誘導されたカルスを、カルス継代培地（Ｒ２Ｓ）に移し、３０℃の連続光下で振とう培養した。７〜１１日おきにカルス継代培地を交換すると、約２ヶ月後にほぼ均一な大きさを持つ培養細胞が得られた。
再分化寒天培地（Ｒ２Ｒ）の９ｃｍ角シャーレ中央部に１ｃｍ×８．５ｃｍのろ紙を置き、ろ紙上に２００μＬの１０ｍＭ−ＧＳＳＧ溶液または滅菌水をスポットしたあと、培地上に培養細胞を置き、３０℃の連続光下で培養した。
再分化培地に移して４日目の培養細胞を観察したところ、滅菌水をスポットした培地の細胞では変化が見られなかった（図８）。これに対して１０ｍＭ−ＧＳＳＧ溶液をスポットした培地の細胞では発根が見られた（図９）。（図１０及び図１１は、図９のＣ及びＤの四角囲み内の拡大写真である。）。
この結果から、ＧＳＳＧには植物細胞に対して再分化を促進する効果があることが分かる。

Claims (2)

1. 固体の再分化培地上にろ紙を置いて、該ろ紙に酸化型グルタチオンの１〜５００ｍＭ溶液を添加し、当該培地上に植物体の一部から誘導されたカルスを移して培養することにより、カルスから発根させることを特徴とする、再分化植物体の作製方法。
2. 前記培地上に前記カルスを移すときに、前記ろ紙とカルスとの距離に勾配をつけて並べることを特徴とする、請求項１記載の再分化植物体の作成方法。

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