CN107410029B

CN107410029B - 一种提高籼稻及籼粳交花药培养效率的培养基及应用

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Publication number: CN107410029B
Application number: CN201710742143.3A
Authority: CN
Inventors: 刘凯; 孙明法; 严国红; 唐红生; 王爱民; 朱国永; 何冲霄; 张桂云; 施伟; 赵绍路; 孙一标; 朱静雯; 宛柏杰
Original assignee: Jiangsu Institute of Coastal Area Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute of Coastal Area Agricultural Sciences
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2019-07-26
Anticipated expiration: 2037-08-25
Also published as: CN107410029A

Abstract

本发明公开了一种提高籼稻及籼粳交花药培养效率的培养基及应用，属于作物育种技术领域。具体涉及：设计出一种新的水稻花药培养的培养基，是指对比M₈和N₆培养基后花药在经过测试的组织培养基上直接分化成苗，并可直接移栽。利用该培养基能够简化花药培养程序，提高培养效率，为拓展花培技术在水稻育种领域的应用增加了可能，从而创建了一个高效的花药培养的系统，解决水稻花药组织培养过程中水稻基因型的狭窄和组织培养的低效率、以及产苗率难以满足育种群体需要等问题，同时该技术能够适应生产上大规模获得水稻组培苗的轻简模式，降低了劳动强度，减少生产成本。

Description

一种提高籼稻及籼粳交花药培养效率的培养基及应用

技术领域

本发明属于水稻作物育种技术领域，具体涉及一种提高籼稻及籼粳交花药培养效率的培养基及应用。

背景技术

我国从20世纪70年代初开始进行水稻花药组织培养的应用研究，并于1975年首先育成花培品种并应用于生产。花药组织培养已成为水稻生物技术育种中较为成熟的途径，利用该技术选育的水稻新品种有常规粳稻、常规籼稻及三系杂交水稻的恢复系和两系杂交水稻的光温敏不育系等，其类型涉及到当前水稻育种中所有领域。

花药培养技术虽然具有缩短育种周期、提高选择效率、快速创新种质等诸多优势，但植物组织培养存在很强的物种依赖性和基因型特异性。目前水稻花药培养效率尤其是籼稻，平均出愈率只有0.5％左右，一般不超过5％，绿苗率大多在20％以下，有些材料甚至不能诱导出愈伤组织或者难以得到花粉植株。目前江苏丘陵地区镇江市农业科学研究所余波等人提出了一种提高粳稻花药培养效率的方法(专利公开号：CN103461141B)，因此为了简化培养程序，提高培养效率，本实验室提出一种新的水稻花药组织培养基配方，是指花药在一种改良的组织培养基上直接分化成苗，并且可以直接移栽大田的培养方法。

发明内容

技术问题

目前水稻花培育种已经成为水稻育种比较成熟的手段，但是依旧存在许多理论和技术问题，比如出愈率、分化率以及绿苗得率并不完全呈正相关，尤其是籼稻产苗率难以满足育种群体的需要。正是由于水稻品种间性状有明显差异,离体花药对于培养基的反应差异很大,导致花药诱导频率较低，白化苗偏多等现象。为了解决目前技术中存在的问题和不足，本发明探索出一种新的培养基配方，以期能够提高水稻花药培养的效率，拓展花培技术在水稻育种领域的应用。

技术方案

一种提高籼稻及籼粳交花药培养效率的培养基，其特征在于，包括大量元素、Fe盐、微量元素、激素类，所有试剂均用ddH₂O配制，其中：

(1)大量元素其组分以及浓度(20×)如下：KNO₃ 57171.70mg/L、MgSO₄·7H₂O3737.40mg/L、KH₂PO₄ 8040.20mg/L、(NH₄)₂SO₄9353.50mg/L、CaCl₂·2H₂O 4210.50mg/L；

(2)Fe盐其组分以及浓度(20×)如下：FeSO₄·7H₂O 2785.00mg/L、Na₂·EDTA3725.00mg/L；

(3)微量元素其组分以及浓度(100×)如下：KI 421.30、H₃BO₃ 3115.60mg/L、MnSO₄·4H₂O 8535.40mg/L、ZnSO₄·7H₂O 4321.60mg/L、NaMoO₄·2H₂O 126.30mg/L、CoCl₂·6HO 12.60mg/L、CuSO₄·5H₂O 12.60mg/L；

(4)基本培养基为在上述中大量元素、Fe盐和微量元素的基础上附加蔗糖50g/L、琼脂粉8g/L、2,4-D(2,4-苯氧乙酸)0.01mg/L、甘氨酸2mg/L、VB₅(泛酸钙，CalciumPantothenate)0.5mg/L、VB₆(吡哆素，Vitamin B6)0.5mg/L、VB₁(硫胺素，thiamine)4mg/L、KT(kinetin激动素)3mg/L、NAA(naphthaleneaceticacid，萘乙酸)3mg/L；

生根培养基为在上述大量元素、Fe盐、微量元素的基础上附加蔗糖15g/L、琼脂粉8g/L、甘氨酸2mg/L、VB₅(泛酸钙，Calcium Pantothenate)0.5mg/L、VB₆(吡哆素，VitaminB6)0.5mg/L、VB₁(硫胺素，thiamine)4mg/L、IAA(吲哚-3-乙酸，indole-3-acetic acid)1mg/L、PPP(多效唑)2.5mg/L、秋水仙素4mg/L。

所述的培养基可以在提高籼稻或籼粳交花药培养效率方面得到应用。水稻花药培养无需经过愈伤组织的转移分化，能够在基本培养基上直接产生组培苗。具体包括以下步骤：

1)选取花粉细胞正处于小孢子单核靠边期的穗子，消毒后用纱布将稻穗包裹好，6-10℃低温预处理；

2)将消毒过的穗子颖壳剪开，将花粉接种于所述提高籼稻及籼粳交花药培养效率的基本培养基上诱导培养，每个试管接种花药40-60枚，每个材料做10管，放入暗培养室(26±2)℃黑暗条件下培养；

3)水稻花药暗培养30d后，花药组织陆续产生金黄色愈伤组织，随后转至(26±2)℃光照条件下基本培养基上分化培养，光强为400μmol·m^-2·s^-1，每日光照16h，培养30d，诱导产生不定芽；

4)生根壮苗、实验室炼苗、移栽大田。

有益效果

一种提高籼稻及籼粳交花药培养效率的培养基属于改良的组织培养基，利用该培养基进行水稻花药培养，省去了配置分化培养基以及转移花药愈伤组织等步骤，从而省去了多级培养中三分之一的工序，能显著降低愈伤组织的污染率。分化产生的绿苗生长快壮，根芽同出，较为整齐，且无无根绿苗出现。

本发明培养基进行水稻花药培养成本较低。由于省了花药愈伤组织的转移培养，因而人工费用、药品、材料消耗、电耗及培养室场地等方面均得到节省。

试验表明，对于籼粳交杂交组合，本发明改良培养基具有最高的出愈率，变异幅度从20.95-30.67％，平均出愈率为现有技术中N₆培养基、镇江所培养基、M₈培养基的4.51、4.55、2.38倍；对于籼稻强恢复系，本发明改良培养基平均出愈率为N₆培养基、镇江所培养基、M₈培养基的3.91、3.88、2.35倍，因此适合诱导籼粳交及籼稻恢复系花药组织产生愈伤组织。同时，对于籼粳交杂交组合，本发明改良培养基具有最高的分化率，愈伤组织平均分化率分别是N₆培养基、镇江所培养基、M₈培养基的2.11、2.16、2.03倍；对于籼稻强恢复系，本发明培养基上愈伤组织平均分化率分别为N₆培养基、镇江所培养基、M₈培养基的4.11、3.21、1.33倍，表明本发明改良培养基能够使得籼稻及籼粳交获得更高的愈伤组织分化率。

附图说明

图1水稻花药在诱导培养基上诱导愈伤、分化

图2水稻花药在生根培养基中生根

图3组培苗在实验室练苗

图4组培苗大田移栽苗期

图5组培苗大田抽穗时期

图6技术路线图

具体实施方式

(一)试验对照材料：

1、N₆培养基它是1974年由朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO₃和NH₄NO₃含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。具体配方参照(表1)

(二)表1N₆培养基配方

2、M₈培养基是1987年由梅传生等为籼稻花药组织培养而设计的。其特点是各个组分浓度含量较低，如果与其他培养基交叉使用能够获得较好的培养效果。具体配方参照(表2)

(三)表2M₈培养基成分表

3、江苏丘陵地区镇江农业科学研究所提出的“一种提高粳稻花药培养效率的方法”(专利公开号：CN103461141B)的培养基配方如下：母液A包括如下组分：按10倍浓度计算，KNO₃ 30g/L、NH₄NO₃ 16.5g/L、KH₂PO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 3.7g/L、CaCl₂4.4g/L；

母液B包括如下组分：按100倍浓度计算，ZnSO₄·7H₂O 500mg/L、MnSO₄·H₂O1000mg/L、H₃BO₃500mg/L、CuSO₄·5H₂O 2.5mg/L、KI 83mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 25mg/L、CoCl₂·6H₂O 2.5mg/L；

母液C包括如下组分：按100倍浓度计算，Na₂-EDTA5.6g/L、Fe₂(SO₄)₃·7H₂O 4.3g/L；

母液D包括如下组分：按100倍浓度计算，肌醇10g/L、烟酸50mg/L、盐酸硫胺素50mg/L、盐酸吡哆醇50mg/L、甘氨酸200mg/L。

(二)试验设计：

在江苏沿海地区农业科学研究所试验农场种植的水稻育种材料进行花药培养。

表3本发明水稻花药培养改良培养基成分

(基本培养基用于诱导、分化，生根培养基用于生根)

1)配制基本培养基(用于诱导、分化培养)

在表3中大量元素、Fe盐、微量元素的基础上加入50g/L的蔗糖，8g/L的琼脂粉和0.01mg/L的2,4-D(2,4-苯氧乙酸)。此外还附加了甘氨酸2mg/L VB₅(泛酸钙，CalciumPantothenate)，0.5mg/L VB₆(吡哆素，Vitamin B6)，4mg/L VB₁(硫胺素，thiamine)，以及3mg/L KT(kinetin激动素)和3mg/L NAA(naphthaleneaceticacid，萘乙酸)等外源激素。(上述药品均购置于生工生物工程(上海)股份有限公司)

2)配制生根培养基(用于生根培养)

在表3中大量元素、Fe盐、微量元素的基础上加入15g/L蔗糖，8g/L琼脂粉，2mg/L甘氨酸，0.5mg/L VB₅(泛酸钙，Calcium Pantothenate)，0.5mg/L VB₆(吡哆素，Vitamin B6)，4mg/L VB₁(硫胺素，thiamine)，1mg/L IAA(吲哚-3-乙酸，indole-3-acetic acid)，2.5mg/L PPP(多效唑)和4mg/L秋水仙素。(上述药品均购置于生工生物工程(上海)股份有限公司)

3)材料预处理

取穗安排在晴天傍晚时间进行，选取花粉细胞正处于小孢子单核靠边期的穗子，具体以稻苞抽出的叶枕距长短为标准(15cm左右)。取回的稻穗表面首先用75﹪酒精擦拭消毒，后用纱布将稻穗包裹好，放入冰箱，6-10℃低温预处理3-5天。

4)水稻花药接种

将预处理的稻穗，经75％酒精处理90S，然后用10％双氧水溶液浸泡15min，再用无菌水漂洗3-4次，最后将消毒过的穗子颖壳剪开，将花粉接种于基本培养基上面诱导，每个试管接种50枚左右，每个材料做10管，放入暗培养室(26±2)℃黑暗条件下基本培养基诱导培养。

5)水稻花药诱导、分化成苗

水稻花药在基本培养基上暗培养30d后，花药组织陆续产生金黄色愈伤组织。随后转至(26±2)℃光照条件下基本培养基上分化培养，光强为400μmol·m^-2·s^-1，每日光照16h，培养30d左右，诱导产生不定芽(见图1)。

6)生根壮苗将愈伤组织已分化长出绿叶的小苗挑出(见图2)，(26±2)℃光照条件下生根培养基培养，光照强度600μmol·m^-2·s^-1，每日光照16h，培养15d。

7)实验室炼苗(见图3)

待绿苗长至15cm左右，有8-10条不定根发生时间，将其移除试管，放置在实验室室温下进行炼苗。

8)移栽大田

实验室炼苗3天后将绿苗移栽至大田里，获得水稻花药培养的正常二倍体植株(见图4、5)。

实施例1

供试材料：4个籼粳杂交组合组合，(盐恢1393/蜀恢527)//02428，(盐恢1393/明恢86)//02428，(盐恢559/盐恢607)//02428，(盐恢559/盐恢902)//02428，其中盐恢1393、盐恢559、盐恢607、盐恢902(顾来顺,姚立生,何顺椹,等.强恢复系盐恢559的选育与应用[J].杂交水稻,1998(1):6-7；王玉平,李仕贵,黎汉云,等.高配合力优质水稻恢复系蜀恢527的选育与利用[J].杂交水稻,2004,19(4):12-14；王子明,邹江石,郑维认,等.粳型水稻广亲和新品系的选育研究[J].杂交水稻,1990(6):32-36；张建新,谢华安,郑家团,等.优质抗瘟强优恢复系“明恢86”[J].福建农业科技,1996(5):2-3；其余材料均购置于江苏盐城明天种业股份有限公司)。材料种植于江苏沿海地区农业科学研究所南洋试验场，2016年5月10号播种，6月10号移栽，田间管理按常规方法。

按照上述步骤2、3、4、5、6所述对4个籼粳交组合进行花药组织培养。

比较镇江所培养基、N₆和M₈三种培养基以及改良培养基在相同条件下对籼粳交F₁花药组织出愈率的影响，见表4，方差分析表明三种培养基组织出愈率差异显著，其中本发明培养基平均出愈率27.91％，而N₆作为诱导培养基花药组织平均出愈率为6.19％，镇江所培养基平均出愈率为6.13％，M₈培养基平均出愈率为11.73％，对比N₆培养基、镇江所培养基和M₈培养基，本发明培养基要极显著高于前三者，在四个杂交组合中平均出愈率为N₆培养基、镇江所培养基和M₈培养基的4.51、4.55、2.38倍，尤其以改良培养基最高出愈率可达32.63％，因此更适合诱导籼粳交F₁花药产生愈伤组织。

表4不同培养基对籼粳交F₁花药出愈率的影响

将上述4种培养基中花药组织陆续产生的金黄色愈伤组织随后转至(26±2)℃光照条件下培养，见表5，方差分析结果表明，以改良的培养基的4个杂交组合的愈伤组织分化率最高，变异幅度从22.66-25.53％，平均分化率分别是N₆、镇江所和M₈培养基的2.11、2.16、2.03倍，因此在本实验室改良的培养基上能够使得籼粳杂交F₁获得更高的花药组织分化率。

表5不同培养基对籼粳交F₁花药分化率的影响

实施例2

供试材料：4个籼稻强恢复系盐恢1393、盐恢559、盐恢607、盐恢902(强恢复系盐恢559的选育与应用[J].杂交水稻,1998(1):6-7；其余材料购置于江苏盐城明天种业股份有限公司)。材料种植于江苏沿海地区农业科学研究所南洋试验场，2016年5月10号播种，6月10号移栽，株行距9×4寸，田间管理按常规方法。

按照上述步骤2、3、4、5、6所述对4个籼稻强恢复系进行花药组织培养。

比较镇江所、M₈和N₆三种培养基以及改良培养基在相同条件下对籼稻强恢复系花药出愈率的影响，见表6，方差分析表明4个籼稻恢复系在四种培养基上组织出愈率差异显著，其中本发明改良培养基具有最高的出愈率，变异幅度从20.95-30.67％，平均出愈率为N₆培养基、镇江所培养基和M₈培养基的3.91、3.88、2.35倍，对比其他三种培养基，改良培养基更适合诱导籼稻强恢复系花药组织产生愈伤。

表6不同培养基对籼稻恢复系花药出愈率的影响

将上述4种培养基中花药组织陆续产生的金黄色愈伤组织随后转至(26±2)℃光照条件下培养，见表7，方差分析表明，改良培养基上的愈伤分化率要极显著高于N₆培养基、镇江所培养基和M₈培养基，变异幅度为30.27-36.87％，平均分化率在4个杂交组合中分别为N₆、镇江所、M₈培养基的4.11、3.21、1.33倍，同样结果表明本实验改良培养基能够使得籼稻恢复系获得较高的愈伤组织分化率。

表7不同培养基对籼稻恢复系花药分化率的影响

Claims

1.一种提高籼稻及籼粳交花药培养效率的培养基，其特征在于，包括大量元素、Fe盐、微量元素、激素类，所有试剂均用ddH₂O配制，其中：

(1)20倍浓度的大量元素其组分以及浓度如下：KNO₃57171.70mg/L、MgSO₄·7H₂O3737.40mg/L、KH₂PO₄8040.20mg/L、(NH₄)₂SO₄9353.50mg/L、CaCl₂·2H₂O 4210.50mg/L；

(2)20倍浓度的Fe盐其组分以及浓度如下：FeSO₄·7H₂O 2785.00mg/L、Na₂·EDTA3725.00mg/L；

(3)100倍浓度的微量元素其组分以及浓度如下：KI 421.30、H₃BO₃ 3115.60mg/L、MnSO₄·4H₂O 8535.40mg/L、ZnSO₄·7H₂O 4321.60mg/L、NaMoO₄·2H₂O 126.30mg/L、CoCl₂·6HO 12.60mg/L、CuSO₄·5H₂O 12.60mg/L；

(4)基本培养基为在上述大量元素、Fe盐和微量元素的基础上附加蔗糖50g/L、琼脂粉8g/L、2,4-D(2,4-苯氧乙酸)0.01mg/L、甘氨酸2mg/L、VB₅(泛酸钙，CalciumPantothenate)0.5mg/L、VB₆(吡哆素，Vitamin B6)0.5mg/L、VB₁(硫胺素，thiamine)4mg/L、KT(kinetin激动素)3mg/L、NAA(naphthaleneaceticacid，萘乙酸)3mg/L；

生根培养基为在上述大量元素、Fe盐、微量元素的基础上附加蔗糖15g/L、琼脂粉8g/L、甘氨酸2mg/L、VB₅(泛酸钙，Calcium Pantothenate)0.5mg/L、VB₆(吡哆素，Vitamin B6)0.5mg/L、VB₁(硫胺素，thiamine)4mg/L、IAA(吲哚-3-乙酸，indole-3-acetic acid)1mg/L、PPP(多效唑)2.5mg/L、秋水仙素4mg/L。

2.权利要求1所述的培养基在提高籼稻或籼粳交花药培养效率方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

2)将消毒过的穗子颖壳剪开，将花粉接种于权利要求1所述的基本培养基上面诱导，每个试管接种花药40-60枚，每个材料做10管，放入暗培养室26±2℃黑暗条件下培养；

3)水稻花药暗培养30d后，花药组织陆续产生金黄色愈伤组织，随后转至26±2℃光照条件下基本培养基上分化培养，光强为400μmol·m^-2·s^-1，每日光照16h，培养30d，诱导产生不定芽；

4)生根壮苗、实验室炼苗、移栽大田。