CN103355175A - 一种水稻花药愈伤组织的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻花药愈伤组织的培养方法，包括：取稻穗，消毒后去除颖壳的顶端；将稻苞茎秆朝上，穗部朝下使穗部悬置于盛有培养液的收集瓶内进行振荡处理；振荡结束后将收集瓶转移，黑暗条件下进行诱导培养，得到水稻花药愈伤组织；所述培养液的配方为：SK3基本培养基中含有2.5～3g/L脯氨酸、0.4～0.6g/L谷氨酸、1.8～2.5mg/L 2-4D和1.8～2.5mg/L NAA。本发明提供了一种水稻花药愈伤组织的培养方法，花药收集方便、收集效率高，愈伤组织的诱导率高且降低了污染几率。

Description

一种水稻花药愈伤组织的培养方法

技术领域

本发明涉及植物花药离体培养技术领域，尤其涉及一种水稻花药愈伤组织的培养方法。

背景技术

花药培养是通过植物组织培养技术，将发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上，以改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化，并连续进行有丝分裂，形成细胞团，进而形成一团无分化的薄壁组织-愈伤组织，或分化成胚状体，随后诱使愈伤组织分化成完整的植株。

在我国，水稻花药培养技术主要应用于三个方面：第一，将花培技术（花药培养技术）与常规品种间杂交育种相结合，进行新品种的培育，该方面已经取得了显著的成绩。第二，将花培技术用于籼、粳亚种间杂交育种，这方面育成的品种比较多。第三，将花培技术用于杂交水稻提纯复壮，用花药提纯更新不育系、保持系，其产量比对照增产10％。目前，将花药得到的植株用于育种的理论基础已经建立，水稻已经成为可利用花药培养技术快速育种的作物。

在水稻的花药培养中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜，此时期对花药进行培养，诱导效率高，而花粉是否处于单核靠边期可通过一些形态指标进行判断和鉴定，如叶枕距、水稻颖壳颜色、雄蕊长度等。

取花药是水稻花药培养的第一步也是非常重要的步骤，花药作为组织培养的原材料，在取花药时，应可能避免对花药造成伤害，以免影响诱导效率，同时还需尽量减少污染的几率，此外还应考虑实验操作的便捷性。目前，在取花药时，通常先将稻穗进行消毒，消毒后，在超净工作台中，通过眼科剪将稻穗的颖壳剪开，取出花药后眼科镊将其接种到培养基中进行培养。该方法存在以下问题：（1）操作繁琐且难度高，劳动强度大，费工费时，不易规模化进行生产操作；（2）在操作过程中镊子（剪刀不会接触培养基的）等器具直接接触花药或培养基，容易造成接触污染，引入杂菌，污染培养基，同时也极易对花药造成损伤，影响愈伤组织诱导率。

除了水稻花药收集难度较大的问题外，在水稻花药的离体培养中，还存在着愈伤组织诱导率低下的问题，而诱导培养基是愈伤组织形成的关键因素，目前针对培养基已经做出了大量的研究，如向珣朝、张楷正等（向珣朝、张楷正等，影响水稻籼粳亚种间杂交构建回交自交系的花药培养效果的2个因素.植物生理学通讯，2006，42（6）：1041-1044）探讨了N₆、SK₃通用培养基对花药出愈率的影响，愈伤组织的出愈率约为8%左右，仍然比较低。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明提供了一种水稻花药愈伤组织的培养方法，花药收集方便、收集效率高，愈伤组织的诱导率高且降低了污染几率。

一种水稻花药的离体培养方法，包括：

（1）取稻穗，消毒后去除颖壳的顶端；

（2）将稻苞茎秆朝上，穗部朝下使穗部悬置于盛有培养液的收集瓶内进行振荡处理；振荡结束后将收集瓶转移，黑暗条件下进行诱导培养，得到水稻花药愈伤组织；

所述培养液的配方为：SK₃基本培养基中含有2.5～3g/L脯氨酸、0.4～0.6g/L谷氨酸、1.8～2.5mg/L 2-4D和1.8～2.5mg/L NAA。

由于水稻的花药被颖壳包裹，将颖壳的顶端去除，即为花药的释放提供了通道，通过振荡，花药可在重力的作用下落入收集瓶内。

去除颖壳的顶端时，可采用剪除或切除的方法。

SK₃基本培养基为花药愈伤组织培养的一种基础培养基，主要由SK₃大量、SK₃微量、SK₃有机、铁盐、麦芽糖、蔗糖等组成，琼脂的有无可分别制成固体或者液体培养基，SK3基本培养基可采用常规的方法进行配置或者购买，本发明除了在SK3基本培养基的基础上添加激素2-4D、NAA外，还增加了谷氨酸和脯氨酸作为培养基的补充养分，并合理控制其用量，谷氨酸和脯氨酸能够提高愈伤组织的抗性，增加愈伤组织成活率，从而提高愈伤组织的诱导率。优选的，所述脯氨酸在培养液中的浓度为2.8g/L，谷氨酸在培养液中的浓度为0.5g/L，2-4D在培养液中的浓度为2g/L，NAA在培养液中的浓度为2g/L。

稻苞抽出的剑叶叶枕到第2叶，颖壳出现浅绿色时从所述的稻苞中取出稻穗。此时，水稻的花粉处于单核靠边期，该时期取水稻的花药进行离体培养，愈伤组织诱导率高。

消毒前，将所述的稻穗于4℃放置4～6天。适当的低温预处理可抑制花药壁的退化及褐变，促使花药脱分化形成愈伤组织。

所述消毒的方法包括：将所述稻穗用70%酒精消毒30s～1min后，将稻穗置于1%的次氯酸钠中浸泡10～15min。

颖壳去除的部分占颖壳的1/3～1/2，优选为1/3。若去除的部分过少，则颖壳开口小，花药不易被振荡出，影响收集效果；去除的部分过大，则易使花药受到机械损伤。

所述穗部与培养液液面之间的距离为2～6cm。距离过小，振荡所收集的花药分布范围较小，造成花药分布不均匀，局部花药密度大；而距离过大，花药容易被振荡到收集瓶壁上，培养液容易飞溅，影响收集效果。

优选的，所述收集瓶分为上下两层，上层设有用于固定所述稻穗的固定装置，下层盛装有所述的培养液。将收集瓶设置为两层，方便了对稻穗进行固定，且由于花药落入到收集瓶的下层，当花药收集完毕后，能够将上下两层拆开，将盛有花药的下层转移进行操作，减少污染几率。

所述振荡的频率为0.1～10赫兹，优选为3～6赫兹。通过控制振荡的频率能够调节花药的下落速度，但是振荡频率过高或过低均不合适，若振荡频率过低，则花药不易落下，影响花药的收集效率，而振荡频率过高则易导致花药下落方向发生变化，导致其碰触收集瓶内壁，增加污染几率，甚至对花药造成损伤，同时，花药还可能粘到收集瓶内壁，影响收集效果，此外，振荡频率过大也易将稻穗上的的杂质震落，影响收集的效果，增加离体培养的污染机会。

所述振荡的时间为1～30s，优选为10～15s。适宜的振荡时间能够保证收集足够量的花药，同时也可以避免振荡时间过长而导致稻穗上杂质的落入。

所述培养的温度为23～26℃，时间为28～38天。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）与传统用镊、剪剥离取花药的方法相比，本发明通过振荡即可进行花药的收集，操作更加方便，收集两小时可收集至少24瓶花药，且每瓶花药≥150枚，而采用传统方法，两个小时仅收集花药1200枚左右，收集速度也较传统方法大大提高，可达其三倍多，且能够连续大规模采集，不产生任何环境污染。

（2）较传统方法相比，本发明在花药收集过程中，操作工具如镊子等不直接接触花药，不会对花药造成机械损伤和污染，接种离体培养时，也不需要直接接触花药和培养基质，避免了接触污染，降低了污染几率。

（3）本发明在花药收集过程中，通过调节振荡频率，控制花药下落速度，花药的收集更加灵活，无需用镊子从颖壳中挑取花药，有助于缓解眼睛疲劳和操作人员持续工作状态，操作更加简便。

（4）本发明改良了花药离体培养的培养基，通过添加适量的谷氨酸和脯氨酸，愈伤组织诱导率可达15.37%，较传统的SK₃基本培养基提高了2.95%。

附图说明

图1为实施例1～2收集瓶收集花药的示意图。

图2为实施例2中花药经培养形成的愈伤组织。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

图1显示了实施例1～2收集瓶收集花药的示意图，图中可见，收集瓶为圆筒状，分为上筒、下筒两层，上筒和下筒可通过螺纹连接。上筒2的顶沿固定有一支撑杆1，支撑杆1与收集瓶的轴向垂直，支撑杆1的中部带有一夹子8，用于夹持稻穗6的茎秆，下筒3的底部盛装有琼脂滤纸4。收集花药时，整个收集瓶置于振荡器5上，振荡器5的振荡将花药振落。

实施例1

（1）稻苞抽出的剑叶叶枕到第2叶，稻穗颖壳出现浅绿色时在田间取穗，将稻穗用湿润的纱布包裹好于4℃低温预处理5天。

（2）将处理后的稻穗置于无菌组织培养瓶中，用70%的酒精进行表面消毒1min，倒去酒精，在单人无菌超净工作台中用1%的次氯酸钠消毒15min，倒去次氯酸钠，用无菌水冲洗5次。

（3）在单人无菌超净台内用剪刀将着生于穗部中间部分生理状态较好的颖壳顶端的1/3以上部分剪去，图1中显示了完整的颖壳6，去除顶端的颖壳7。

（4）在无菌条件下将收集瓶底层装入培养液，拧紧收集瓶上下二层，将剪去颖壳的穗部朝瓶底，稻穗茎秆朝上放入收集瓶，并将茎秆夹牢，穗部的顶端与培养液液面之间的距离为3cm；组织培养液（培养液）的配方如下：SK₃基本培养基（SK₃大量+SK₃微量+SK₃有机+铁盐+3%麦芽糖+3%蔗糖）+2mg/L2,4D+2mg/L NAA，pH为5.8。

（5）收集瓶放入振荡器上振荡收集，振荡频率调节在3赫兹，振荡15s至花药基本收集于收集瓶中。

（6）收集完成后在无菌操净台内拧开收集瓶，瓶底层组织培养液中花药直接放入25℃培养箱中暗培养至诱导出愈伤组织。

经统计，采用本发明的方法，两个小时能收集24瓶花药，且每瓶花药≥150枚，将收集的花药进行离体培养，暗培养35天后，统计愈伤组织诱导率，其诱导率为12.42%，且没有产生任何污染，图2示出了本实施例花药经培养形成的愈伤组织。

实施例2

（1）稻苞抽出的剑叶叶枕到第2叶，稻穗颖壳出现浅绿色时在田间取穗，将稻穗用湿润的纱布包裹好于4℃低温预处理6天。

（2）将处理后的稻穗置于无菌组织培养瓶中，用70%的酒精进行表面消毒1min，倒去酒精，在单人无菌超净工作台中用1%的次氯酸钠消毒15min，倒去次氯酸钠，用无菌水冲洗5次。

（3）在单人无菌超净台内用剪刀将着生于穗部中间部分生理状态较好的颖壳顶端的1/3以上部分剪去。

（4）在无菌条件下将收集瓶底层装入培养液，拧紧收集瓶上下二层，将剪去颖壳的穗部朝瓶底，稻穗茎秆朝上放入收集瓶，并将茎秆夹牢，穗部的顶端与培养液液面之间的距离为5cm；组织培养液的配方如下：SK₃基本培养基（SK₃大量+SK₃微量+SK₃有机+铁盐+3%麦芽糖+3%蔗糖）+2.8g/LPro（脯氨酸）+0.5g/LGlu（谷氨酸）+2mg/L 2,4D+2mg/L NAA，pH为5.8。

（5）收集瓶放入振荡器上振荡收集，振荡频率调节在6赫兹，振荡10s，花药基本收集于收集瓶中。

（6）收集完成后在无菌操净台内拧开收集瓶，瓶底层组织培养液中花药直接放入25℃培养箱中暗培养至诱导出愈伤组织。

经统计，采用本发明的方法，两个小时能收集24瓶花药，且每瓶花药≥150枚，将收集的花药进行离体培养，暗培养35天后，统计愈伤组织诱导率，其诱导率为15.37%，较实施例1提高了2.95%，且没有产生任何污染。

对比例

（1）稻苞抽出的剑叶叶枕到第2叶，稻穗颖壳出现浅绿色时在田间取穗，将稻穗于5摄氏度低温预处理6天。

（2）将处理后的稻穗置于无菌组织培养瓶中，用70%的酒精进行表面消毒1min，倒去酒精，在单人无菌超净工作台中用1%的次氯酸钠消毒15min，倒去次氯酸钠，用无菌水冲洗5次。

（3）取花药时采用传统方法，先通过眼科剪将稻穗的颖壳剪开，取出花药后接种到诱导培养基中，置于25℃培养箱中暗培养至诱导出愈伤组织，其中，培养基的配方为：SK₃基本固体培养基（SK₃大量+SK₃微量+SK₃有机+铁盐+3%麦芽糖+3%蔗糖+6～8%琼脂）+2mg/L 2,4D+2mg/L NAA，pH为5.8。

经统计，一个人操作取1200枚花药，约2个小时，将这1200枚花药接种到培养基中，每个培养皿接种150枚，共8个培养皿，培养35天后，统计愈伤组织诱导率，其诱导率为9.95%，且发现有两皿产生污染。

Claims (10)

1.一种水稻花药愈伤组织的培养方法，包括：

（1）取稻穗，消毒后去除颖壳的顶端；

（2）将稻苞茎秆朝上，穗部朝下使穗部悬置于盛有培养液的收集瓶内进行振荡处理；振荡结束后将收集瓶转移，黑暗条件下进行诱导培养，得到水稻花药愈伤组织；

所述培养液的配方为：SK₃基本培养基中含有2.5～3g/L脯氨酸、0.4～0.6g/L谷氨酸、1.8～2.5mg/L 2-4D和1.8～2.5mg/L NAA。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，稻苞抽出的剑叶叶枕到第2叶，颖壳出现浅绿色时从所述的稻苞中取出稻穗。

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，消毒前，将所述的稻穗于4℃放置4～6天。

4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述消毒的方法包括：将所述稻穗用70%酒精消毒30s～1min后，将稻穗置于1%的次氯酸钠中浸泡10～15min。

5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，颖壳去除的部分占颖壳的1/3～1/2。

6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述穗部与培养液液面之间的距离为2～6cm。

7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述脯氨酸在培养液中的浓度为2.8g/L，所述谷氨酸在培养液中的浓度为0.5g/L。

8.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述收集瓶分为上下两层，上层设有用于固定所述稻穗的固定装置，下层盛装有所述的培养液。

9.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述振荡的频率为0.1～10赫兹。

10.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述振荡的时间为1～30s。

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