CN1711831A - 一种籼稻的离体培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于新植物技术领域。公开了一种籼稻的离体培养方法。筛选得到一种适用于籼稻离体培养的愈伤组织继代培养基(J3)和一种分化培养基(DL3)。新的培养基含有大量成分、微量成分、附加成分、碳源和植物激素等组分。应用本发明的培养基和现有经典培养基，在四个有广泛代表性的、目前普遍推广的籼稻品种“明恢63”、“珍汕97B”、“中419”和“W9864S”组培材料上进行了对比试验。结果显示，本发明的籼稻离体培养方法和培养基，在籼稻愈伤组织的继代和再生方面明显优于同类方法和培养基，可以较好地克服籼稻品种离体培养和转基因应用中的困难。

Description

一种籼稻的离体培养方法
技术领域
本发明属于新植物技术领域。具体涉及一种籼稻的离体培养方法，更具体地说，涉及到籼稻愈伤组织继代和分化培养基的改良及其在籼稻离体培养和转基因中的应用。
背景技术
培养基是植物离体培养方法的关键，任何植物离体培养方法的建立都主要是围绕培养基的筛选来进行。植物离体培养是室内人工模拟植物自然生长的过程，不同物种有不同的生长条件和环境，因此，可以想象，设计一种适合所有物种组织培养的培养基是不可能实现的，每种培养基都有其最适的物种甚至基因型范围。众所周知，目前已经广泛应用的几种经典培养基，由于其组分含量不同。其作用和效果也不相同。B5培养基(Gamborg OL等，1968.Nutrient requirements of suspension culture of soybean roots cells.Exp CellRes，50：150-158)主要适用于十字花科植物的离体培养；N6培养基(Chu CC等.1975.Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparativeexperiments on the nitrogen sources.Scientia Sinica，18：659-668)主要适合于粳稻的组织培养；MS培养基(Murashige T，Skoog F.1962.A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco cultures.Plant Physiol，15：473-493)使烟草、番茄、马铃薯等茄科植物的离体培养变得十分容易和方便。这些培养基被称为植物组织培养的常用培养基而被沿用至今。
上述这些经典培养基的组成一般是由基本培养基和附加成分组成，其中基本培养基主要包括无机盐(大量元素和微量元素)，维生素、甘氨酸和肌醇等有机营养成份，碳源等。植物激素和有机添加物，则是根据不同的培养目的、不同的培养对象和不同的培养时期进行调整的。对基本培养基的部分成分进行调整的培养基称为改良的基本培养基，如改良的MS、改良的B5培养基等等。
至今，在籼稻品种离体培养过程中，愈伤组织不耐继代以及继代后愈伤组织难以分化仍是很突出的问题，这也是籼稻成为转基因的遗难物种的主要原因。因为现在用于植物转基因的任何成熟方法都是建立在植物离体培养方法基础之上，且需要一个较长时间的抗性愈伤的筛选和继代过程。目前，绝大多数关于籼稻品种离体培养过程中的愈伤组织继代和分化报道试验都是采用MS或N6培养基进行的，但使用这类培养基效果非常不能令人满意。主要问题是现有的继代的的愈伤组织生长速度很慢，而且愈伤组织的褐化严重，不能连续继代培养，从而导致整个试验失败。因此，筛选适合籼稻愈伤组织继代和分化的培养基，从而建立一种籼稻品种的离体培养方法对于籼稻的组织培养和转基因研究及其应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于建立一种籼稻离体培养的方法，筛选适合于籼稻离体培养用的愈伤组织继代和分化培养基，这种新的培养方法和培养基，能够广泛地适应于离体条件下的籼稻组织培养和转基因的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
一种籼稻离体培养的方法，其步骤包括：
1)将去壳的成熟种子、幼胚或花药的籼稻外植体，置于75％酒精中清洗1分钟，0.15％升汞浸泡10-15分钟，无菌水漂洗，接入MS+2，4-D 2.5mg/L+谷氨酰胺300mg/L+脯氨酸500mg/L+3-5％蔗糖+0.3％植物胶(Phytagel)的培养基上，该培养基的pH为5.9，培养条件为26±1℃，暗培养，将所述的外植体诱导出愈伤组织；
2)将步骤1)所得到的愈伤组织接入继代培养基(编号为J3)培养，该培养基的组分为：KNO3 1900-2000mg/L，NH4NO3 1500-1650mg/L，KH2PO4 150-170mg/L，MgSO4·7H2O 350-370mg/L，CaCl2·2H2O 350-400mg/L，FeSO4·7H2O 35-42mg/L，Na2EDTA 50-56mg/L，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB1 0.5-1.0mg/L，VB6 1.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，2，4-D 2.0-3.0mg/L，麦芽糖30g/L，植物胶3.0g/L，pH为5.9，培养条件为26±1℃，暗培养，每隔20天继代一次；
3)取步骤2)所得到的继代愈伤组织接入分化培养基(编号为DL3)，该培养基的组分如下：KNO3 2800-3000mg/L，(NH4)2SO4 350-450mg/L，KH2PO4 300-400mg/L，MgSO4·7H2O 180-200mg/L，CaCl2·2H2O 170-200mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，60-74mg/L Na2EDTA，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB1 0.5-1.0mg/L，VB6 1.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，麦芽糖30-50g/L，6-苄基氨基嘌呤2mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，植物胶5g/L，pH为6.0，光照培养(16小时光/8小时暗)，再生出植株。
一种用于离体培养的籼稻愈伤组织继代培养基(编号为J3)，其组分如下：
KNO3 1900-2000mg/L，NH4NO3 1500-1650mg/L，KH2PO4 150-170mg/L，MgSO4·7H2O350-370mg/L，CaCl2·2H2O 350-400mg/L，FeSO4·7H2O 35-42mg/L，Na2EDTA 50-56mg/L，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO3 25-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB1 0.5-1.0mg/L，VB6 1.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，2，4-D 2.0-3.0mg/L，麦芽糖30g/L，植物胶3.0g/L。
一种用于离体培养的籼稻愈伤组织分化培养基(编号为DL3)，其组分如下：
KNO3 2800-3000mg/L，(NH4)2SO4 350-450mg/L，KH2PO4 300-400mg/L，MgSO4·7H2O180-200mg/L，CaCl2·2H2O 170-200mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，60-74mg/L Na2EDTA，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO3 25-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB1 0.5-1.0mg/L，VB6 1.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，麦芽糖30-50g/L，6-苄基氨基嘌呤2mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，植物胶5g/L。
本发明的方法可应用于籼稻组织培养或转基因上。
本发明的籼稻愈伤组织继代培养基和/或分化培养基，可应用于籼稻组织培养或转基因上。
本发明的优点在于：
利用生产上广泛种植的、基因型差异较大的四个籼稻品种如明恢63(一种籼稻三系恢复系)、珍汕97B(一种籼稻三系保持系)、中419(一种籼稻三系或两系恢复系)和W9864S(一种籼稻两系不育系)为试验材料，以现有的经典培养基做平行对比试验，筛选得到的籼稻愈伤组织继代培养基和分化培养基以及由此建立的籼稻离体培养方法，具有广泛的针对性和适用性，可用于大多数籼稻品种的组织培养和转基因的研究与应用。
具体实施方式
实施例1：籼稻愈伤组织继代培养基的筛选
试验设计共分两部分：1、用MS、N6、B5和N6B(该培养基为N6的大量营养成分和B5的微量和有机营养成分)四种最常用的基本培养基(参见表5所示)为基础，设置1倍(以X表示，下同)、2X，与蔗糖、麦芽糖两种碳源组合成16种培养基；2、以MS大量营养元素为基础，麦芽糖为碳源，设置MS、N6、B5的微量元素，每种微量元素设1X、2X、5X、10X四个水平，Fe2+设1X、1.5X、3X、5X四个梯度组合成48种培养基。将设计的共64种培养基分别接种籼稻愈伤组织进行继代，每种培养基分别接愈伤组织5瓶。在26±1℃下暗培养20天。通过观察比较各种培养基上的愈伤组织的生长情况(生长速度、质地和颜色)，筛选出适合籼稻离体愈伤组织的继代培养基(编号为J3)。该培养基的组分如下：KNO3 1900-2000mg/L，NH4NO3 1500-1650mg/L，KH2PO4 150-170mg/L，MgSO4·7H2O 350-370mg/L，CaCl2·2H2O 350-400mg/L，FeSO4·7H2O 35-42mg/L，Na2EDTA 50-56mg/L，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB1 0.5-1.0mg/L，VB6 1.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，2，4-D 2.0-3.0mg/L，麦芽糖30g/L，植物胶3.0g/L，pH为5.9。
实施例2：籼稻愈伤组织继代效果的比较试验
试验采用中国目前生产上广泛种植的、基因型差异较大的并具有代表性的四个籼稻品种：明恢63(一种籼稻三系恢复系)、珍汕97B(一种籼稻三系保持系)、中419(一种籼稻三系或两系恢复系)和W9864S(一种籼稻两系不育系)。将本发明的J3培养基与另外三种由常用的基本培养基MS(编号为J1)、N6(编号为J2)和B5(编号为J4)组成的继代培养基，这些培养基中添加的附加成分和植物激素如2，4-D、脯氨酸、谷氨酰胺、麦芽糖和植物胶用量相同，区别仅仅在于基本培养基的成分及用量，pH均为5.9。做培养基性能的比较试验。
不同籼稻继代培养基的试验设计：
编号J1：MS的无机盐、微量元素和有机成分(下同)+2，4-D 2.5mg/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺300mg/L+3％麦芽糖(碳源)+0.3％植物胶，pH5.9；
编号J2：N6的无机盐、微量元素和有机成分(下同)+2，4-D 2.5mg/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺300mg/L+3％麦芽糖+0.3％植物胶，pH5.9；
编号J3：J3无机盐、微量元素和有机成分(下同)+2，4-D 2.5mg/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺300mg/L+3％麦芽糖+0.3％植物胶，pH5.9；
编号J4：B5的无机盐、微量元素和有机成分(下同)+2，4-D 2.5mg/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺300mg/L+3％麦芽糖+0.3％植物胶，pH5.9。
在本试验中，四个用于试验的籼稻品种的愈伤组织来自于实验室接种诱导培养30天左右的新鲜愈伤组织，将这些愈伤组织称量后分别接入四种以及按标准灭菌程序制备的固体继代培养基(按常量预先加入琼脂)上，每种培养基接种供试品种的愈伤组织各5瓶，接种后立即置于26℃暗培养。培养20天后，称量愈伤组织的重量(以鲜重计)，计算不同培养下的愈伤组织的增重率。试验结果见表1所示。
表1  不同培养基对籼稻愈伤组织继代培养的效果
籼稻品种 培养基编号  接种时愈伤组织的鲜重(克)  培养20天后愈伤组织的鲜重(克) 增重率(％)   继代后愈伤的质地
明恢63 J1J2J3(本发明)J4      0.2710.2670.2570.253      1.6621.6582.1271.277    6.130±0.1476.201±0.2338.269±0.2005.048±0.181     水渍化褐化鲜黄、紧实褐化
珍汕97 J1J2J3(本发明)J4      0.3020.2870.2690.278      2.0381.7912.0161.496    6.752±0.0506.241±0.5837.493±0.2825.378±0.058      水渍化褐化鲜黄、紧实褐化
W9864S J1J2J3(本发明)J4      0.2710.2830.2580.244      1.2591.6152.2521.305    4.648±0.0845.707±0.0908.747±0.5035.355±0.338      水渍化褐化鲜黄、紧实褐化
中419 J1J2J3(本发明)J4      0.2460.2800.2510.255      1.3591.4871.9441.211    5.534±0.2845.322±0.2607.750±0.1704.741±0.212      水渍化褐化鲜黄、紧实褐化
注：表中统计的接种时愈伤组织鲜重和培养20天后的愈伤组织鲜重均为每品种5瓶愈伤组织鲜重的平均重量。
从试验及方差分析结果可以看出：在设计的四种培养基中，本发明的培养基J3对四个籼稻品种愈伤组织的继代效果大大优于其余三种培养基；且J3培养基继代的愈伤组织的质地鲜黄紧实，呈现很强的胚性状态，有利于进一步培养。
实施例3：籼稻愈伤组织继代培养基J3对籼稻愈伤组织连续继代的效果试验
按实施例提供的将上述四种供试籼稻品种的愈伤组织接入所述的J3培养基，进行连续继代培养试验，每次继代培养的时间为20天。每次继代后，称量接种每个供试品种愈伤组织各5瓶做分化活力测定，以评价本发明的J3培养基对连续继代愈伤胚性的保持能力。试验效果见表2所示。
表2籼稻愈伤组织继代培养基J3对连续继代的籼稻愈伤组织的分化活力测定
    籼稻品种   继代次数    接种愈伤量a    分化植株数b   每克愈伤组织分化的植株数(株)
    明恢63     123      0.9211.0120.882        165148109       179.2±29.3146.8±16.6123.6±22.1
    珍汕97B     123      0.8090.9270.911        192164128       236.7±35.9176.9±26.2140.5±24.4
    W9864S     123      0.7840.8980.796        998959       120.9±20.899.6±17.074.1±15.1
    中419     123      0.9790.9330.839        14611283       149.2±26.8120.1±19.698.4±22.9
注：a接种五瓶愈伤的总重量；b五瓶愈伤总分化的植株数
结果显示，本发明的继代培养基，虽然随着继代次数的增加，愈伤的分化活力呈下降趋势。但下降速度缓慢。继代三次后各供试材料的愈伤组织仍保持较高的分化活力。完全可满足转化愈伤筛选继代的要求，
实施例4：籼稻分化培养基的筛选与比较试验
试验材料和方法以及愈伤组织的处理按照实施例1的步骤进行，通过观察比较各种培养基上的愈伤组织的分化情况(分化速度和分化苗数)，筛选出的愈伤组织分化培养基(DL3)的成分如下：
KNO3 2800-3000mg/L，(NH4)2SO4 350-450mg/L，KH2PO4 300-400mg/L，MgSO4·7H2O 180-200mg/L，CaCl2·2H2O 170-200mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，60-74mg/L Na2EDTA，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB1 0.5-1.0mg/L，VB6 1.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，麦芽糖30-50g/L，6-苄基氨基嘌呤2mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，植物胶5g/L；pH为6.0。
以本发明的培养基DL3的基本营养组分(包括大量成分、微量成分和维生素)与MS、N6基本培养基，另添加植物激素：6-苄基氨基嘌呤2mg/L、激动素2mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.2mg/L、萘乙酸(NAA)0.2mg/L、氨基酸：脯氨酸500mg/L、谷氨酰胺500mg/L，与两种不同碳源组成的培养基进行分化效率测试。结果见表3。
不同籼稻分化培养基的试验设计：
编号DL1:：MS，2.0mg/l 6-苄基氨基嘌呤，2.0mg/l激动素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％麦芽糖，0.3％植物胶，pH6.0；
编号DL2:：MS，2.0mg/l 6-苄基氨基嘌呤，2.0mg/l激动素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％蔗糖，0.3％植物胶，pH6.0；
编号DL3:DL3基本培养基，2.0mg/l 6-苄基氨基嘌呤，2.0mg/l激动素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％麦芽糖，0.3％植物胶，pH6.0；
编号DL4:：DL3基本培养基，2.0mg/l 6-苄基氨基嘌呤，2.0mg/l激动素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％蔗糖，0.3％植物胶，pH6.0；
编号DL5:：N6，2.0mg/l 6-苄基氨基嘌呤，2.0mg/l激动素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％麦芽糖，0.3％植物胶，pH6.0；
编号DL6:：N6，2.0mg/l 6-苄基氨基嘌呤，2.0mg/l激动素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％蔗糖，0.3％植物胶，pH6.0；
说明：a每个三角瓶接种的愈伤组织鲜重。
说明：b每个三角瓶内分化的植株数。
表3不同籼稻分化培养基对籼稻愈伤组织分化效率的影响
籼稻品种 培养基编号  愈伤鲜重a  分化苗数b   每克愈伤分化苗数
明恢63  DL1DL2DL3(本发明)DL4DL5DL6    0.1220.1440.1280.1180.1340.139     10.47.238.912.624.612.4      85.250.0303.9106.8183.689.2
珍汕97B  DL1DL2DL3(本发明)DL4DL5DL6    0.0840.0790.0960.0980.1090.091     12.47.235.214.624.613.4      134.891.4371.4152.5231.7147.4
 W9864S  DL1DL2DL3(本发明)DL4DL5DL6    0.2050.2000.1970.1970.2040.198     12.47.022.28.812.62.8      60.235.0113.144.761.714.2
中419  DL1DL2DL3(本发明)DL4DL5DL6    0.2030.2010.1130.1970.1380.121     11.04.412.68.011.03.8      54.621.8141.040.981.131.6
试验结果显示，本发明的DL3培养基的分化效率极显著高于其它培养基，即在设计的六种分化培养基中，DL3培养基最适于籼稻愈伤组织的分化培养。
实施例5：本发明的籼稻离体培养方法在农杆菌介导的转基因上的应用
采用本发明的实施例1-4所述的籼稻品种的外植体，详细的技术步骤按照本申请人同日提出的另一份申请中关于农杆菌介导的籼稻转基因方法的发明申请所提供的技术步骤，用本发明提供的籼稻诱导培养基诱导出愈伤组织，然后用所述的编号为J3的培养基进行愈伤组织继代，经过愈伤组织预培养、共培养和筛选培养，在筛选培养基上长出抗性愈伤组织。将筛选获得的抗性愈伤组织经预分化和分化培养(采用编号为DL3的培养基)，最后再生出完整的转基因植株。试验结果如表4所示。
表4本发明的籼稻离体培养方法在农杆菌介导的转基因上的应用
供试籼稻品种  接种愈伤数  抗性愈伤数  转基因株系数   基因转化效率％
    明恢63珍汕97B中419W9864S   201227189234     914244138     47211652      23.4％9.3％8.5％22.2％
表4显示：四个供试的籼稻品种均获得较高的转化效率，说明本发明的农杆菌介导的籼稻基因转化方法是非常有效的。
表5 MS、N6、B5培养基的基本培养基及其组成
    成    分   MS(mg/L)   N6(mg/L)   B5(mg/L)
KNO3     1900     2830     2500
NH4NO3     1650
(NH4)2SO4     463     134
KH2PO4     170     400     150
MgSO4·7H2O     370     185     250
CaCl2·2H2O     440     166     150
FeSO4·7H2O     27.85     27.85     27.8
Na2EDTA     37.25     37.25     37.3
MnSO4·4H2O     22.3     4.4     10
ZnSO4·7H2O     8.6     1.5     2
H3BO3     6.2     1.6     3
KI     0.83     0.8     0.75
CuSO4·5H2O     0.025     0.025
Na2MoO4·2H2O     0.25     0.25
CoCl2·6H2O     0.025     0.025
甘氨酸     2.0     2.0
VB1     0.4     1.0     10.0
VB6     0.5     0.5     1.0
烟酸     0.5     0.5     1.0
肌醇     100     100     100
注：配方来源MS(Murashige和Skoog，1962)；B5(Gamborg等，1968)；N6(Chu等，1975)；AA(Toriyama和Hinata，1985)

Claims (7)

1、一种籼稻的离体培养方法，其步骤包括：
1)将去壳的成熟种子、幼胚或花药的籼稻外植体，置于75％酒精中清洗1分钟，0.15％升汞浸泡10-15分钟，无菌水漂洗，接入MS+2，4-D 2.5mg/L+谷氨酰胺300mg/L+脯氨酸500mg/L+3％蔗糖+0.3％植物胶(Phytagel)的培养基上，该培养基的pH为5.9，培养条件为26±1℃，暗培养，将所述的外植体诱导出愈伤组织；
2)将步骤1)所得到的愈伤组织接入继代培养基培养，该培养基的组分为：KNO3 1900-2000mg/L，NH4NO3 1500-1650mg/L，KH2PO4 150-170mg/L，MgSO4·7H2O 350-370mg/L，CaCl2·2H2O 350-400mg/L，FeSO4·7H2O 35-42mg/L，Na2EDTA 50-56mg/L，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO3 25-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB1 0.5-1.0mg/L，VB6 1.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，2，4-D 2.0-3.0mg/L，麦芽糖30g/L，植物胶3.0g/L，pH为5.9，培养条件为26±1℃，暗培养，每隔20天继代一次；
3)取步骤2)所得到的继代愈伤组织接入分化培养基，该培养基的组分如下：KNO3 2800-3000mg/L，(NH4)2SO4 350-450mg/L，KH2PO4 300-400mg/L，MgSO4·7H2O 180-200mg/L，CaCl2·2H2O 170-200mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，60-74mg/L Na2EDTA，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO3 25-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB1 0.5-1.0mg/L，VB6 1.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，麦芽糖30-50g/L，6-苄基氨基嘌呤2mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，植物胶5g/L，pH为6.0，培养条件为26±1℃，光照培养(16小时光/8小时暗)，再生出植株。
2、一种用于离体培养的籼稻愈伤组织继代培养基，其组分如下：
KNO3 1900-2000mg/L，NH4NO3 1500-1650mg/L，KH2PO4 150-170mg/L，MgSO4·7H2O 350-370mg/L，CaCl2·2H2O 350-400mg/L，FeSO4·7H2O 35-42mg/L，Na2EDTA 50-56mg/L，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO3 25-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB1 0.5-1.0mg/L，VB6 1.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，2，4-D 2.0-3.0mg/L，麦芽糖30g/L，植物胶3.0g/L。
3、一种用于离体培养的籼稻愈伤组织分化培养基，其组分如下：
KNO3 2800-3000mg/L，(NH4)2SO4 350-450mg/L，KH2PO4 300-400mg/L，MgSO4·7H2O 180-200mg/L，CaCl2·2H2O 170-200mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，60-74mg/L Na2EDTA，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO3 25-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB1 0.5-1.0mg/L，VB6 1.0-1.5mg/L，烟酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，麦芽糖30-50g/L，6-苄基氨基嘌呤2mg/L，激动素2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，植物胶5g/L。
4、权利要求1所述的方法，其特征在于在籼稻组织培养中的应用。
5、权利要求1所述的方法，其特征在于在籼稻转基因中的应用。
6、权利要求2和/或3所述的培养基，其特征在于在籼稻组织培养中的应用。
7、权利要求2和/或3所述的培养基，其特征在于在籼稻转基因中的应用。
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