CN1860860A - 象草体细胞培养高频率植株再生技术 - Google Patents
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Abstract
本发明为象草体细胞培养高频率植株再生技术，属于生物技术领域。为象草工厂化试管苗生产和生物技术育种提供实用技术，颗粒状胚性愈伤组织适用于开展体细胞突变体筛选和农杆菌介导法基因转化工作。以改良的MS为基本培养基，诱导培养基添加4.0mg/L 2，4－D、0.05mg/L KT和4.0mg/L 2，4－D、0.1mg/LKT，继代培养基添加3.0mg/L 2，4－D、0.2mg/L 6－BA，分化培养基添加2.0mg/LCPPU、0.01mg/L NAA或0.5mg/L KT和0.5mg/L IAA，总成苗率达50.2％和43.99％，试管苗的移栽成活率达95％以上。
Description
一、技术领域
本发明涉及象草体细胞培养获得高频率植株再生的技术方法，属于生物技术领域，专用于象草体细胞培养、试管苗微繁殖和体细胞突变体筛选，并适用于农杆菌介导法基因转化。
二、技术背景
象草(Pennisetum Purpureum Schumach)为禾本科狼尾草属多年生草本植物，原产热带非洲，是适宜于热带和亚热带地区种植的高产牧草，可用于草食畜禽养殖、公路护坡、中高档纸浆和人造木板生产，近年来的研究表明象草还是一种理想的生物质能源作物，国内外种植面积有迅速扩大的趋势。但由于象草为对光照敏感的短日照作物，只能在北纬28°以南地区正常开花完成生育过程及自然越冬，在长江中下游及其相同纬度地区主要作一年生利用，不能自然开花结实。自然开花或人工诱导象草开花，均由于种子成熟期不一、易于落粒和发芽率极低，在生产上只能采用种茎无性繁殖的方法提供种苗，且缺乏抗寒、耐盐性强的象草品种，影响其大面积推广种植。
宣朴等以狼尾草属杂交种皇竹草的腋芽和顶芽为外植体材料，通过愈伤组织诱导和绿苗分化途径建立快繁体系，但皇竹草腋芽和顶芽诱导愈伤组织的频率仅为10％，绿苗分化率为5％。迄今为止尚未见国内外有关象草组织培养高频率植株再生技术的报道。本研究以象草品种N51的幼穗为外植体材料，试图探明不同激素组合对处于不同发育时期幼穗的愈伤组织诱导和植株再生能力的影响，以期建立起象草体细胞培养高频率植株再生技术体系，为实现象草工厂化试管苗生产和利用生物技术培育抗寒、耐盐新品种奠定基础。
三、发明内容
技术问题 本发明的目的在于建立象草幼穗培养获得颗粒状胚性愈伤组织和高频率植株再生的技术，克服高梁属作物在组织培养中诱导产生白色、半透明、粘状愈伤组织，绿苗分化率低，愈伤组织经过继代培养后丧失植株分化能力，不宜用于规模化试管苗繁殖和分子生物学育种等缺陷。
技术方案
象草体细胞培养高频率植株再生技术，其特征在于，
(1)材料
选用7～9月经短日照处理3周分枝穗原基分化期的象草幼穗为外植体材料。
(2)培养基
基本培养基：MS大量元素、微量元素、B5维生素，蔗糖3％，琼脂条的用量为0.8％；
愈伤组织诱导培养基：附加2，4-二氯苯氧乙酸(简称2，4-D)4.0mg/L和激动素(简称KT)0.05mg/L或0.1mg/L；
愈伤组织继代培养基：附加2，4-D 3.0mg/L和6-苄基氨基嘌呤(简称6-BA)0.2mg/L
愈伤组织分化培养基：附加苯基脲类细胞分裂素(简称CPPU)2.0mg/L和萘乙酸(简称NAA)0.01mg/L或KT 0.5mg/L和吲哚乙酸(简称IAA)0.5mg/L；
培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8。
(3)培养方法
取分枝穗原基分化期2～5cm长的幼穗，在无菌条件下用70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外的叶鞘，剥出幼穗，切成2～3mm长的段片。把幼穗切段接种于愈伤组织诱导培养基上，20～25d后将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基。继代培养20～25d后转入绿苗分化培养基，20～25d后绿芽或颗粒状愈伤组织再转入新鲜的分化培养基继续分化培养。3片叶大小的幼苗转入壮根培养基，15d长成根系发育良好的的完整小植株。培养室温度为26℃～28℃，光强为2000lux，每天光照16h。冬季和早春试管苗移栽至温室，其它季节可直接移栽至大田。
有益效果 本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
本发明采用暗处理人工诱导幼穗分化的方法，选取象草分枝穗原基分化期的幼穗(离穗轴2～5cm)的幼穗为材料，通过激素调控，在离体培养条件下，有效地解决了象草在组织培养过程中由于诱导产生的愈伤组织水渍化或因形成大量毛状根而丧失植株分化能力的难题。本发明颗粒状胚性愈伤组织的诱导率在70％80％之间、绿苗分化频率在44～51％之间。
使用本发明方法培养的白色或浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织，在耐盐(NaCl6～18‰)体细胞突变体胁迫筛选过程中能始终保持白色或浅黄色、颗粒状结构和高频率植株再生的能力；在农杆菌介导基因转化过程中愈伤组织能基本保持颗粒状结构，为开展象草细胞生物学和分子生物学育种提供了重要的基础条件。
四、附图说明
图1 幼穗诱导产生的愈伤组织
图2 幼穗离体培养得到的再生植株
图3 耐盐突变体筛选获得的植株
图4 农杆菌介导法转耐盐基因(BADH)植株
五、具体实施方式
1材料与方法
1.1材料
象草品种N51，(公知公用，1985年从美国引进)种茎无性繁殖保存，大田扩繁。用黑塑料薄膜覆盖暗处理15小时(白天光照9小时)，暗处理3周后，取象草的幼穗进行离体培养。
1.2培养基
基本培养基由MS无机盐和B5有机成分组成，添加不同配比的激素组合，附加3％蔗糖和0.8％琼脂，pH值为5.8。
愈伤组织诱导培养基和愈伤组织继代培养基添加设置不同的激素组合(见表1)。绿苗分化培养基添加的激素组合为：SG1，附加CPPU 2.0mg/L、NAA 0.01mg/L；SG2，附加KT 0.5mg/L、IAA 0.5mg/L。壮根培养基为Rr：1/2MS培养基，添加NAA 0.5mg/L。
表1 愈伤组织诱导和继代培养基的激素组合
| 培养基编号 | 诱导培养基 | 培养基编号 | 继代培养基 | |||
| 2，4-D | KT | 2，4-D | KT | 6-BA | ||
| NI1NI2NI3 | 444 | 0.020.050.1 | NC1NC2NC3NC4 | 3324 | 0.05000.05 | 00.20.20 |
1.3培养方法
剪取植株上半部，去掉叶片，在无菌条件下用70％的酒精擦拭包在幼穗外部的叶鞘和茎，剥出幼穗。幼穗长度小于2cm，直接接种；幼穗长度2～5cm，切成2～3mm长的穗段；幼穗长度超过5cm，则取幼穗基部5cm以内和以外两部分，同样切成2～3mm长的穗段。
幼穗接种于愈伤组织诱导培养基上，20～25d后将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基。愈伤组织继代20～25d后转入绿苗分化培养基，20～25d后绿芽或颗粒状愈伤组织再转入新鲜的分化培养基继续分化培养。3片叶大小的幼苗转入壮根培养基，生长15d，试管苗经1d温室练苗后移入简易大棚。
培养室温度为26℃～28℃，光强为2000lux，每天光照16h。
2结果与分析
2.1愈伤组织的诱导
象草幼穗的长度对出愈的时间、愈伤组织的状态及诱导频率具有明显的影响(表2)。当幼穗长度为2～5cm时，接种2～3d后，有少量的幼穗出现形变，6～8
表2 幼穗大小和激素组合对愈伤组织诱导率的影响
| 培养基编号 | 幼穗长度 | 诱导率(％)* | 颗粒状愈伤组织诱导率**(％) |
| NI1 | ≤2cm2～5cm5～10cm上部(top)5～10cm基部(base) | 82.172.385.775.8 | 15.238.28.618.2 |
| NI2 | ≤2cm2～5cm5～10cm上部(top)5～10cm基部(base) | 76.579.070.680.0 | 15.545.510.620.0 |
| NI3 | ≤2cm2～5cm5～10cm上部(top)5～10cm基部(base) | 88.872.663.869.0 | 17.646.07.29.8 |
*接种后15d统计平均数
**接种后30d统计平均数
d大部分幼穗切段出现明显形变，10～15d陆续产生白色或浅黄色颗粒状愈伤组织(图1)，21d后少量愈伤组织分化出毛状根、愈伤组织呈蓬松状或褐化，诱导培养30d颗粒状愈伤组织的平均值为44.9％。当所取幼穗处于初始分化阶段，即幼穗长度小于2cm时，接种10d后，少量幼穗开始发生形变，14～21d大部分幼穗形变并产生白色或淡黄色颗粒状愈伤组织，但25～30d后大多数愈伤组织呈乳白色水渍状，诱导培养30d保持颗粒状结构的愈伤组织的平均值为16.1％。长度为5～10cm的幼穗，将其穗基部5cm之内的小穗接种于诱导培养基，7～9d大部分幼穗发生穗形变，10～15d同时产生部分颗粒状愈伤组织和根，21d后大量颗粒状愈伤组织变成蓬松状或褐化，30d后颗粒状愈伤组织的平均值为16％。离穗轴5cm以上的小穗，7d左右大部分幼穗也发生穗形变，10～15d同时产生部分颗粒状愈伤组织和分化出根，30d颗粒状愈伤组织的平均值为8.8％。这一结果表明，象草幼穗离体培养以长度2～5cm最为适宜。
本试验中设置的3种激素组合对幼穗的出愈时间和愈伤组织状态无明显影响。幼穗接种15d后，愈伤组织均呈现白色或浅黄色颗粒状，颗粒状愈伤组织诱导率均较高。不同激素组合对愈伤组织状态的影响表现在，幼穗接种30d后，颗粒状愈伤组织的发生频率不同，这种影响与幼穗的长度也有关。幼穗长度小于5cm时，在2，4-D浓度为4.0mg/L时，接种30d后，颗粒状愈伤组织的诱导率总体呈现随KT浓度的升高而提高的趋势；幼穗长度为2～5cm，KT浓度为0.05mg/L和0.1mg/L时，颗粒状愈伤组织的诱导频率无差异，均明显高于KT浓度为0.02mg/L的诱导培养基中颗粒状愈伤组织的频率。幼穗长度5～10cm时，无论穗基部或上部，KT浓度为0.05mg/L时，颗粒状愈伤组织的诱导率最高。诱导培养基中KT浓度为0.02mg/L时，愈伤组织易产生纤毛或毛状根，这可能与KT浓度偏低有关。
2.2愈伤组织的继代培养
愈伤组织在诱导培养基中培养25～30d后转移至继代培养基，水渍状愈伤组织在所有继代培养基中3～5d全部死亡；蓬松状愈伤组织转移至继代培养基生长迅速，但7～10d后，部分蓬松状愈伤组织产生大量的毛状结构和不定根，大部分蓬松状愈伤组织15d以后逐渐恶化，丧失绿苗分化的能力。从诱导培养基中选择色泽鲜亮、颗粒状愈伤组织进行继代培养，当添加的激素组合为4.0mg/L2，4-D、0.05mg/L KT，即采用NI2诱导培养基进行继代培养时，来自不同诱导培养基中的白色或浅黄色颗粒状愈伤组织继代10d后全部褐化，这可能是由于4.0mg/L 2，4-D浓度太高的原因。2，4-D浓度降至3.0mg/L或2.0mg/L，颗粒状愈伤组织在继代培养基上生长迅速，10d后，部分愈伤组织开始变为蓬松状，部分愈伤组织开始分化出绿芽点或毛状根，15d后在添加激素组合为3.0mg/L2，4-D、0.2mg/L 6-BA的培养基上，少量绿芽点分化成苗。继代21d的统计结果表明，来自诱导培养基NI1、NI3的颗粒状愈伤组织在3.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L6-BA和2.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L 6-BA培养基中增殖快，颗粒状愈伤组织的频率分别为74.0％和69.5％，明显高于激素组合为3.0mg/L 2，4-D、0.05mg/L KT的继代培养基上颗粒状愈伤组织的频率；来自诱导培养基NI2的颗粒状愈伤组织，在本试验的3种继代培养基中，颗粒状愈伤组织的频率较低，为31.1％～43.6％，
表3 不同诱导、继代培养基对颗粒状愈伤组织的影响
| 诱导培养基 | 继代培养基 | 愈伤块数 | 颗粒愈伤％ | 蓬松愈伤％ | 绿点％ | 苗％ | 毛状根％ |
| NI1 | NC1NC2NC3 | 114110107 | 56.868.062.5 | 18.217.226.7 | 25.014.810.8 | 000 | 21.716.126.1 |
| NI2 | NC1NC2NC3 | 155161182 | 43.640.931.1 | 23.023.733.9 | 31.035.425.3 | 2.409.7 | 27.427.037.9 |
| NI3 | NC1NC2NC3 | 414329 | 59.874.069.5 | 23.410.520.2 | 16.815.510.3 | 000 | 16.321.220.7 |
但绿芽点分化率明显最高。激素组合为3.0mg/L 2，4-D、0.2mg/L 6-BA的培养基中，绿芽点分化率最高为35.4％，在3.0mg/L 2，4-D、0.05mg/L KT和2.0mg/L2，4-D、0.2mg/L 6-BA的继代培养基中，部分绿芽点甚至分化成苗。这一结果表明，愈伤组织在继代培养过程中保持愈伤组织的颗粒状结构及绿芽点的分化除受继代培养基激素组成的影响外，还与幼穗初始诱导愈伤组织的培养基激素组分有关。
2.3愈伤组织的分化
颗粒状愈伤组织经20～25d继代培养后，选择色泽鲜艳、白色或浅黄色颗粒状愈伤组织和带绿芽点的愈伤组织分别转入分化培养基，带绿芽点的愈伤组织在SG1和SG2分化培养基上成苗率均达到100％。来自不同继代培养基中的颗粒状愈伤组织在不同分化培养基上的表现不一(表4)。在继代培养基为3.0mg/L2，4-D、0.2mg/L 6-BA(NC2)上的颗粒状愈伤组织，转入2.0mg/L CPPU、0.01mg/LNAA(SG1)分化培养基，21d成苗率达36.4％；转入0.5mg/L KT、0.5mg/L IAA
表4 不同继代、分化培养基对颗粒状愈伤组织分化的影响
| 继代培养基 | 分化培养基 | 愈伤块数 | 绿芽％ | 苗％ | (绿芽+苗)％ |
| NC1NC2NC3 | SG1SG2SG1SG2SG1SG2 | 293831332320 | 11.15.3030.84.40 | 02.636.47.713.00 | 11.17.936.438.517.40 |
注：培养21d的平均数
(SG2)分化培养基，21d颗粒状愈伤组织成苗率仅为7.7％，但绿芽分化率为30.8％，由于在分化培养基中的绿芽转入相同分化培养基后成苗率达100％，因此来自继代培养基NC2的颗粒状愈伤转入SG2的最终成苗率达38.5％，表明SG2对来自分化培养基NC2的颗粒状愈伤组织也是适宜的分化培养基。继代培养基为NC1和NC3，颗粒状愈伤组织转入分化培养基后，绿芽和绿苗总的分化率均以SG1高于SG2。来自继代培养基NC3的颗粒状愈伤组织转入分化培养基SG2，21d，大部分愈伤组织继续保持颗粒状结构，部分颗粒状愈伤分化出毛状根，部分愈伤组织褐化，无绿芽和苗分化，这可能是由于在继代培养时2，4-D浓度太低，影响愈伤组织的分化能力。分化培养基中的颗粒状愈伤组织再次转入分化培养基，10d后均恶化不能成苗。在分化培养基上的苗长势较弱，早春移入简易大棚后活棵慢，而且不易发棵；有3片叶的小苗转入壮根培养基，生长15d，根系发达苗壮(图2)。试管苗经1d温室练苗，移栽至简易大棚后，活棵快，移栽成活率达95％以上，生长健壮的小苗15d左右长出新的分蘖。
三.讨论
在禾本科植物组织培养和基因转化研究中，国内外学者普遍认为幼穗、未成熟胚和成熟胚是最为适宜的外植体材料，胚性愈伤组织的诱导频率和植株再生频率显著高于其它类型的外植体材料。宣朴等以皇竹草的腋芽和顶芽为外植体材料，通过愈伤组织诱导和绿苗分化途径建立快繁体系，但皇竹草腋芽和顶芽诱导愈伤组织的频率仅为10％，绿苗分化率为5％。王凭青等以杂交狼尾草(美洲狼尾草与象草杂交种)的茎节(带侧芽)、茎段、心叶和嫩叶为外植体材料，通过培养基配方筛选，建立起植株再生体系。本发明以象草的幼穗为外植体材料，建立起较高频率的植株再生技术体系，并在此基础上展开了体细胞突变体筛选和农杆菌介导基因转化工作，目前已得到耐盐胁迫筛选和转耐盐基因BADH的植株(图3，图4)。
本发明试验结果表明，象草幼穗的不同发育时期对颗粒状愈伤组织的诱导率影响最大。2～5cm长的幼穗颗粒状愈伤组织的诱导率显著高于＜2cm或＞5cm长的幼穗。2，4-D浓度为4.0mg/L，KT浓度为0.05mg/L或0.1mg/L，颗粒状愈伤组织的诱导率较高。当继代培养基中2，4-D浓度与诱导培养基相同时，继代后愈伤组织迅速恶化，降低继代培养基中2，4-D浓度，有利于颗粒状愈伤组织的的保持和增殖。继代培养时颗粒状愈伤组织所占的比例和绿芽分化率的高低不仅与继代培养基中的激素组合有关，还受到初始诱导培养基中的激素组合的影响。采用相同继代培养基NC2，当诱导培养基中激素组合为2，4-D 4.0mg/L和KT0.05mg/L(NI2)时，继代培养时颗粒状愈伤组织的保持率只有40.9％，但绿芽分化率高为35.4％；而诱导培养基中激素组合为2，4-D 4.0mg/L和KT0.1mg/L(NI3)时，继代培养时颗粒状愈伤组织的保持率高达74.0％，绿芽分化率只有15.5％。相同分化培养基来自诱导培养基NI2和NI3的最后成苗率分别为50.2％和43.99％。来自诱导培养基NI3的颗粒状愈伤组织尽管最后成苗率略低于NI2，但由于继代培养时颗粒状愈伤组织保持率高，有利于开展生物技术育种研究；诱导培养基NI2诱导的愈伤组织早期分化率高，对微繁殖有利。在继代培养过程中，选择外表呈干燥、紧密、颗粒状愈伤组织有利于愈伤组织的增殖和植株再生能力的保持。
Claims (1)
1、象草体细胞培养高频率植株再生技术，其特征在于，
1)材料
选用象草的幼穗为外植体材料；
2)培养基
基本培养基：MS大量元素、微量元素、B5维生素，蔗糖质量比3％，琼脂条质量比0.8％；
愈伤组织诱导培养基：附加2，4-二氯苯氧乙酸4.0mg/L和激动素0.05mg/L或0.1mg/L；
愈伤组织继代培养基：附加2，4-二氯苯氧乙酸3.0mg/L和6-苄基腺嘌呤0.2mg/L；
愈伤组织分化培养基：附加苯基脲类细胞分裂素2.0mg/L和萘乙酸0.01mg/L；或附加激动素0.5mg/L和吲哚乙酸0.5mg/L；
幼苗壮根培养基：1/2MS培养基，附加萘乙酸0.5mg/L；
培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8；
3)培养方法
取象草2～5cm长的幼穗，在无菌条件下用70％的酒精彻底擦拭包在幼穗外部的叶鞘和茎，剥出幼穗，切成2～3mm长的片段或把小花从穗轴上剥下，把幼穗的切段或小花接种在愈伤组织诱导培养基上，培养室温度为26℃～28℃，每天光照16h，在散射光下培养，20～25d后获得白色或浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织，转入愈伤组织继代培养基增殖20～25d后，转入愈伤组织分化培养基上，20～25d后绿芽或颗粒状愈伤组织再转入新鲜的分化培养基继续培养；带有3片叶的幼苗转入壮根培养基，15d长成根系发达的健壮试管植株。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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