CN114176007A - 一种盾叶秋海棠组织培养繁育方法 - Google Patents

一种盾叶秋海棠组织培养繁育方法 Download PDF

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Abstract

本发明属植物栽培技术领域，涉及一种盾叶秋海棠组织培养繁育方法，其步骤包括外植体的取材与消毒、外植体诱导、外植体分化、不定芽增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗移栽。本发明以盾叶秋海棠叶片为外植体，在不经过愈伤组织的情况下采取两步诱导萌发的方式，通过诱导及分化培养基的配合使用，先对外植体进行短期诱导，为后续的萌发分化、提高分化率奠定基础，接着转入分化培养基直接分化出不定芽后进行快速繁育，所需原材料少，遗传性状稳定，变异小，具有分化速度快，操作简单、成本低、生长快速等特点，可以满足批量种苗繁殖，是一种较为高效的盾叶秋海棠无菌快繁方法，可为盾叶秋海棠的资源保护、生态恢复和发掘利用奠定基础。

Description

一种盾叶秋海棠组织培养繁育方法
技术领域
本发明属植物栽培技术领域，涉及一种盾叶秋海棠组织培养繁育方法，具体是一种以盾叶秋海棠叶片作为外植体进行组培繁育的方法。
背景技术
盾叶秋海棠(Begonia Peltatifolia)，属秋海棠科秋海棠属多年生草本植物，喜湿热气候，仅分布于海南昌江、白沙地区，为唯一生长在热带喀斯特地貌上的秋海棠属植物。盾叶秋海棠株形紧凑，叶片肥厚美观，能够与其他多肉植物形成很大反差，因此具有较强的视觉冲击力，能够使环境显得别具风格，因此人们常用来装点室内向阳之处。由于多种因素，盾叶秋海棠的生境日益恶化，该物种的野生资源几近濒危。
常规条件下秋海棠属植物的种苗繁育主要采用播种法育苗，有相关研究人员尝试利用组培技术繁殖其他秋海棠，包括四季秋海棠，掌叶秋海棠，牛耳秋海棠等10多种，利用茎、叶片、叶柄为外植体，最终获得了再生植株。目前，盾叶秋海棠主要以扦插繁殖为主，也可采用播种法育苗的方法进行育苗，但其繁殖速度慢、周期长，远远不能满足市场需求。而作为濒危物种，盾叶秋海棠的组培技术研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的提供一种盾叶秋海棠组织培养繁育方法，以盾叶秋海棠的叶片作为外植体进行组织培养，在不经过愈伤组织的情况下采取两步诱导萌发的方式，先对外植体进行短期诱导，为后续的萌发分化、提高分化率奠定基础，接着转入分化培养基直接分化不定芽，然后经过不定芽快速繁殖、壮苗、生根及移栽，获得组培苗。
本发明所采用的技术方案：
一种盾叶秋海棠组织培养繁育方法，其步骤如下：
1.外植体的取材与消毒：取盾叶秋海棠幼嫩叶片，消毒灭菌后得到无菌外植体。
所述盾叶秋海棠外植体的消毒过程是：用0.1％HgCL2溶液，加入吐温-20 2～3滴，消毒灭菌8～12min，用无菌水冲洗3～5次，得到无菌外植体。
2.外植体诱导：将经消毒的外植体切成0.5～1.0cm大小的块，平放至诱导培养基中进行前期诱导培养，培养5～8d，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1000～2000lx，光照时间为10～12h/d。所述诱导培养基是以改良MS 培养基为基本培养基，添加TDZ 0.5～1.0mg/L、2,4-D 0.1～0.2mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。
3.外植体分化：将经过前期诱导的外植体转入分化培养基中进行不定芽分化培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1000～2000lx，光照时间为 10～12h/d。所述分化培养基是以改良MS培养基为基本培养基，添加6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.02mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。
4.不定芽增殖培养：切取不定芽接种于增殖培养基中进行培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～12h/d。培养30 d后获得大量的丛生芽，更换新的增殖培养基培养。所述增殖培养基是以改良 MS培养基为基本培养基，添加6-BA 2.0～3.0mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、蔗糖 30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。
5.壮苗培养：将丛生芽接种至壮苗培养基中进行壮苗培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～12h/d。所述壮苗培养基是以改良MS培养基为基本培养基，并添加蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L， pH值为5.8。
6.生根培养：待经壮苗培养的不定芽生长到2～3叶时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基上进行生根培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～12h/d。培养30d后形成良好根系，获得完整植株。所述生根培养基是以改良MS培养基为基本培养基，添加NAA 0.5 mg/L、蔗糖20g/L、活性炭0.5g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。
7.炼苗移栽：将生根苗移至室外炼苗7～10d后取出，洗净小苗根部的培养基，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1：1的椰糠和腐殖土的基质中，覆盖薄膜保湿并遮荫70％，7d后逐渐去除保湿与遮荫物。
所述改良MS培养基是在MS培养基的基础上，调整大量元素的含量为原含量的1/2，其它成分不变。
本发明以盾叶秋海棠叶片为外植体，在不经过愈伤组织的情况下采取两步诱导萌发的方式，通过诱导及分化培养基的配合使用，先对外植体进行短期诱导，为后续的萌发分化、提高分化率奠定基础；接着转入分化培养基直接分化出不定芽后进行快速繁育，所需原材料少，遗传性状稳定，变异小，具有分化速度快，操作简单、成本低、生长快速等特点，可以满足批量种苗繁殖，是一种较为高效的盾叶秋海棠无菌快繁方法，可为盾叶秋海棠的资源保护、生态恢复和发掘利用奠定基础。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例所采用的各阶段培养基，均是以改良MS培养基为基础培养基，在不同的阶段，相应地添加不同的成分，如激素、碳源等。所述改良MS 培养基是在MS培养基的基础上，调整大量元素的含量为原含量的1/2，其它成分不变。
一、盾叶秋海棠种苗繁殖
实施例一
1、外植体的取材与消毒：于2019年5月在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所八队基地，选取处于生长旺盛时期的盾叶秋海棠植株，采集当新抽生的直径2～4cm的幼嫩叶片作为外植体。直接将叶片放入0.1％HgCL2溶液消毒灭菌12min，消毒灭菌液中加入2滴吐温-20，最后用无菌水冲洗3～5 次，得到无菌外植体。
2、外植体诱导：将经消毒的外植体切成0.5～1.0cm大小的块，平放至诱导培养基(改良MS+TDZ 0.5mg/L+2,4-D 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L， pH值为5.8)中进行前期诱导培养，培养8d，培养条件：温度为25℃，光照强度为1800lx，光照时间为10h/d。
3、外植体分化：将经过前期诱导的外植体转入分化培养基(改良MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)中进行不定芽分化培养，培养条件：温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为10h/d。
4、不定芽增殖培养：切取不定芽接种于增殖培养基(改良MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)中进行培养，培养条件：温度为24℃，光照强度为2300lx，光照时间为10h/d。培养30d后获得大量的丛生芽，更换新的增殖培养基，切分丛生芽继续培养。
5、壮苗培养：将丛生芽接种至壮苗培养基(改良MS+蔗糖30g/L+卡拉胶 6.5g/L，pH值为5.8)中进行壮苗培养，培养条件：温度为25℃，光照强度为 2000lx，光照时间为12h/d。
6、生根培养：待经壮苗培养的不定芽生长到2～3叶时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基(改良MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭0.5g/L+ 卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上进行生根培养，培养条件：温度为25℃，光照强度为2500lx，光照时间为10h/d。培养30d后形成良好根系，获得完整植株。
7、炼苗移栽：将生根苗移至室外炼苗10d后取出，洗净小苗根部的培养基，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1：1的椰糠和腐殖土的基质中，覆盖薄膜保湿并遮荫70％，7d后逐渐去除保湿与遮荫物。
实施例二
1、外植体的取材与消毒：于2019年5月在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所八队基地，选取处于生长旺盛时期的盾叶秋海棠植株，采集当新抽生的直径2～4cm的幼嫩叶片作为外植体。直接将叶片放入0.1％HgCL2溶液消毒灭菌12min，消毒灭菌液中加入2滴吐温-20，最后用无菌水冲洗3～5 次，得到无菌外植体。
2、外植体诱导：将经消毒的外植体切成0.5～1.0cm大小的块，平放至诱导培养基(改良MS+TDZ 0.8mg/L+2,4-D 0.2mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L， pH值为5.8)中进行前期诱导培养，培养6d，培养条件：温度为26℃，光照强度为1200lx，光照时间为12h/d。
3、外植体分化：将经过前期诱导的外植体转入分化培养基(改良MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)中进行不定芽分化培养，培养条件：温度为26℃，光照强度为1300lx，光照时间为12h/d。
4、不定芽增殖培养：切取不定芽接种于增殖培养基(改良MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)中进行培养，培养条件：温度为26℃，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d。培养30d后获得大量的丛生芽，更换新的增殖培养基，切分丛生芽继续培养。
5、壮苗培养：将丛生芽接种至壮苗培养基(改良MS+蔗糖30g/L+卡拉胶 6.5g/L，pH值为5.8)中进行壮苗培养，培养条件：温度为25℃，光照强度为 2300lx，光照时间为12h/d。
6、生根培养：待经壮苗培养的不定芽生长到2～3叶时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基(改良MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭0.5g/L+ 卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上进行生根培养，培养条件：温度为24℃，光照强度为1800lx，光照时间为12h/d。培养30d后形成良好根系，获得完整植株。
7、炼苗移栽：将生根苗移至室外炼苗8d后取出，洗净小苗根部的培养基，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1：1的椰糠和腐殖土的基质中，覆盖薄膜保湿并遮荫70％，7d后逐渐去除保湿与遮荫物。
实施例三
1、外植体的取材与消毒：于2019年5月在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所八队基地，选取处于生长旺盛时期的盾叶秋海棠植株，采集当新抽生的直径2～4cm的幼嫩叶片作为外植体。直接将叶片放入0.1％HgCL2溶液消毒灭菌12min，消毒灭菌液中加入2滴吐温-20，最后用无菌水冲洗3～5 次，得到无菌外植体。
2、外植体诱导：将经消毒的外植体切成0.5～1.0cm大小的块，平放至诱导培养基(改良MS+TDZ 1.0mg/L+2,4-D 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L， pH值为5.8)中进行前期诱导培养，培养5d，培养条件：温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为10h/d。
3、外植体分化：将经过前期诱导的外植体转入分化培养基(改良MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)中进行不定芽分化培养，培养条件：温度为26℃，光照强度为1800lx，光照时间为10h/d。
4、不定芽增殖培养：切取不定芽接种于增殖培养基(改良MS+6-BA 2.0～ 3.0mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)中进行培养，培养条件：温度为25℃，光照强度为1800lx，光照时间为12h/d。培养 30d后获得大量的丛生芽，更换新的增殖培养基，切分丛生芽继续培养。
5、壮苗培养：将丛生芽接种至壮苗培养基(改良MS+蔗糖30g/L+卡拉胶 6.5g/L，pH值为5.8)中进行壮苗培养，培养条件：温度为25℃，光照强度为 1700lx，光照时间为10h/d。
6、生根培养：待经壮苗培养的不定芽生长到2～3叶时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基(改良MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+活性炭0.5g/L+ 卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上进行生根培养，培养条件：温度为26℃，光照强度为200lx，光照时间为10h/d。培养30d后形成良好根系，获得完整植株。
7、炼苗移栽：将生根苗移至室外炼苗10d后取出，洗净小苗根部的培养基，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1：1的椰糠和腐殖土的基质中，覆盖薄膜保湿并遮荫70％，7d后逐渐去除保湿与遮荫物。
对比试验：
对照例一：以MS培养基作为基本培养基，添加BA1.0mg/L、NAA0.2mg/L。以盾叶秋海棠的幼嫩叶片作为外植体进行分化培养。
对照例二：以MS培养基作为基本培养基，添加TDZ 1.0mg/L、2,4-D 0.2 mg/L。以盾叶秋海棠的幼嫩叶片作为外植体进行分化培养。
对照例三：以改良MS培养基作为基本培养基，添加BA1.0 mg/L、NAA0.2 mg/L。以盾叶秋海棠的幼嫩叶片作为外植体进行分化培养。
对照例四：以改良MS培养基作为基本培养基，添加TDZ 1.0mg/L、2,4-D 0.1 mg/L。以盾叶秋海棠的幼嫩叶片作为外植体进行分化培养。
二、组织培养效果鉴定
1.盾叶秋海棠不定芽分化效果鉴定
为考察盾叶秋海棠的不定芽分化情况，对上述实施例、对照例中盾叶秋海棠的幼嫩叶片的分化方式、分化时间、不定芽数进行观测与统计，计算每块外植体的不定芽分化数。结果见表1。
表1盾叶秋海棠不定芽分化情况
Figure BDA0003429997550000071
上述不定芽分化结果表明，与未经诱导直接以盾叶秋海棠的幼嫩叶片分化不定芽的分化方式、分化时间(40d左右)、平均每块外植体分化不定芽数相比，本发明以改良MS通过对外植体采用先诱导后分化的两步诱导萌发的方式，在不经过愈伤组织的情况下，能有效地降低分化时间(28d左右)，缩短育苗周期，提高不定芽的分化数量(平均每块外植体分化不定芽最高可达19.6个)，具有非常好的分化效果。
2.不定芽增殖效果鉴定
为鉴定盾叶秋海棠不定芽的增殖效果，对上述实施例、对照例的不定芽的增殖情况进行观察和统计。30d后统计增殖数，计算增值系数，结果见表2。
表2不定芽的增殖情况
项目 不定芽生长发育状态 增殖系数
实施例一 不定芽较为正常，叶色绿，伸展较快 6.4
实施例二 不定芽较为正常，叶色绿，伸展较快 7.8
实施例三 不定芽较为正常，叶色绿，伸展较快 6.1
对照例一 不定芽细弱，叶片薄，发育缓慢 2.4
对照例二 难以分化正常的不定芽 0
对照例三 不定芽细弱，叶片薄，发育缓慢 3.0
对照例四 不定芽畸形，叶片不伸展，皱缩 1.6
上述增殖结果表明，本发明采用先诱导后分化的两步诱导萌发的方式所得不定芽，后期增殖效果最好，增殖系数达到6.0以上。对照例中所得不定芽，虽然具有一定的增值效果，但其芽形较差，还出现畸形，不利于后续的培养。
3.不定芽生根效果鉴定
为鉴定不定芽的生根效果，对上述实施例、对照例增殖获得的不定芽进行生根情况进行观察和统计。15d后统计生根数，计算生根率，结果见表3。
表3不定芽的生根情况
项目 根萌发天数 根数 根长(cm) 生根率
实施例一 12 6 1.0 100.0％
实施例二 12 7 0.8 100.0％
实施例三 12 4 1.2 100.0％
对照例一 15 3 0.2 100.0％
对照例二 —— —— —— ——
对照例三 15 3 0.5 100.0％
对照例四 15 1 0.2 100.0％
*以从不定芽基部萌发的根数为准。
上述不定芽生根结果表明，本发明对所得不定芽进行诱导生根，12～15d都已萌发不定根，生根率均达100％，生根快，根系发达，有利于提高生根苗移栽成活率以及植株生长。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种盾叶秋海棠组织培养繁育方法，其特征在于，其步骤如下：
1)外植体的取材与消毒：取盾叶秋海棠幼嫩叶片，消毒灭菌后得到无菌外植体；
2)外植体诱导：将经消毒的外植体切成0.5～1.0cm大小的块，平放至诱导培养基中进行前期诱导培养，培养5～8d，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1000～2000lx，光照时间为10～12h/d；所述诱导培养基是以改良MS培养基为基本培养基，添加TDZ 0.5～1.0mg/L、2,4-D 0.1～0.2mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8；
3)外植体分化：将经过前期诱导的外植体转入分化培养基中进行不定芽分化培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1000～2000lx，光照时间为10～12h/d；所述分化培养基是以改良MS培养基为基本培养基，添加6-BA 0.5mg/L、NAA 0.02mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8；
4)不定芽增殖培养：切取不定芽接种于增殖培养基中进行培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～12h/d；所述增殖培养基是以改良MS培养基为基本培养基，添加6-BA 2.0～3.0mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8；
5)壮苗培养：将丛生芽接种至壮苗培养基中进行壮苗培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～12h/d；所述壮苗培养基是以改良MS培养基为基本培养基，并添加蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8；
6)生根培养：待经壮苗培养的不定芽生长到2～3叶时，将不定芽丛进行单株分离，接种到生根培养基上进行生根培养，培养条件：温度为24～26℃，光照强度为1500～2500lx，光照时间为10～12h/d；所述生根培养基是以改良MS培养基为基本培养基，添加NAA 0.5mg/L、蔗糖20g/L、活性炭0.5g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8；
7)炼苗移栽：将生根苗移至室外炼苗7～10d后取出，洗净小苗根部的培养基，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1：1的椰糠和腐殖土的基质中，覆盖薄膜保湿并遮荫70％，7d后逐渐去除保湿与遮荫物；
所述改良MS培养基是在MS培养基的基础上，调整大量元素的含量为原含量的1/2，其它成分不变。
2.根据权利要求1所述的盾叶秋海棠组织培养繁育方法，其特征在于：所述盾叶秋海棠外植体的消毒过程是：用0.1％HgCL2溶液，加入吐温-20 2～3滴，消毒灭菌8～12min，用无菌水冲洗3～5次，得到无菌外植体。
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