CN108064689A

CN108064689A - 一种观叶秋海棠的组织培养方法

Info

Publication number: CN108064689A
Application number: CN201710669138.4A
Authority: CN
Inventors: 高尚; 尧森; 马建华; 朱晓菲; 王小辉; 沈香兰
Original assignee: Sichuan Qicai Forestry Industry Development Co Ltd
Current assignee: Sichuan Lide Seedling Technology Co ltd
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2017-08-08
Publication date: 2018-05-25
Anticipated expiration: 2037-08-08
Also published as: CN108064689B

Abstract

本发明公开一种观叶秋海棠的组织培养方法，包括以下步骤：预处理：取观叶秋海棠经幼嫩叶片剪切、灭菌处理、清洗，得到消毒灭菌后的外植体；初代培养：将消毒灭菌后的外植体接种于第一培养基进行初代培养，得到初代丛生芽；诱导培养：将初代丛生芽接种到第二培养基进行诱导培养，得到生根苗；增殖培养：将生根苗的叶片为母本剪切后，接种到第一培养基进行培养，得到继代丛生芽；将继代丛生芽接种到第二培养基进行培养，得到壮苗；炼苗移栽：将壮苗进行炼苗，移栽，得到观叶秋海棠驯化苗。组织培养方法提高了观叶秋海棠炼苗成活率，培育周期短、繁殖系数高，组织培养流程简便，不受季节限制。

Description

一种观叶秋海棠的组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物无性繁殖技术领域，具体涉及一种观叶秋海棠的组织培养方法。

背景技术

观叶秋海棠(Begonia)原产于热带或亚热带地区，为多年生常绿草本植物，品种繁多，各具特色。观叶秋海棠因其叶形优美，叶色绚丽，近年来盛行作为观叶植物，用于室内梅花。目前，观叶秋海棠以叶插繁殖为主，但是繁殖受季节限制且繁殖效率较低，远不能满足国内对种苗的需求。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了一种观叶秋海棠的组织培养方法；所述组织培养方法提高了观叶秋海棠炼苗成活率，培育周期短、繁殖系数高，组织培养流程简便，省时省力，不受季节限制。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种观叶秋海棠的组织培养方法，包括以下步骤：

预处理：取观叶秋海棠经幼嫩叶片剪切、灭菌处理、清洗，得到消毒灭菌后的外植体；

初代培养：将所述消毒灭菌后的外植体接种于第一培养基进行初代培养，得到初代丛生芽；所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.2～3mg/L KT、0.05～2mg/LNAA、0.02～1.5mg/L 2,4-D、10～30g/L蔗糖、6～10g/L琼脂；

诱导培养：将所述初代丛生芽接种到第二培养基进行诱导培养，得到生根苗；所述第二培养基为1/2MS基本固体培养基；

增殖培养：将所述生根苗的叶片为母本剪切后，接种到第一培养基进行培养，得到继代丛生芽；将所述继代丛生芽接种到第二培养基进行培养，得到壮苗；

炼苗移栽：将所述壮苗进行炼苗，移栽，得到观叶秋海棠驯化苗。

优选的，所述观叶秋海棠经幼嫩叶片为观叶秋海棠叶插后28～32d的新叶。优选的，根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5～2mg/L KT、0.1～1mg/L NAA、0.1～1mg/L 2,4-D、10～30g/L蔗糖、6～10g/L琼脂。

优选的，所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.1mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、8g/L琼脂。

优选的，所述初代培养、所述诱导培养和所述增殖培养过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h。

优选的，所述炼苗移栽过程培养温度为24～26℃，培养湿度为60～80％。

优选的，所述第一培养基和所述第二培养基的pH值为6.0～6.5。优选的，所述灭菌处理为升汞灭菌处理。

优选的，所述灭菌处理为升汞灭菌处理2～3min。

优选的，所述预处理过程具体为：取观叶秋海棠经幼嫩叶片剪切成方块，升汞灭菌处理2～3min，无菌水清洗3～5遍，得到消毒灭菌后的外植体。

优选的，所述炼苗移栽过程具体为：将所述生根苗至于大棚中，经闭瓶炼苗，开瓶炼苗后，移栽进苗床中培养，得到观叶秋海棠驯化苗。

优选的，所述苗床的基质包括：草炭和蛭石，所述草炭和所述蛭石体积比为7:3。

优选的，所述大棚为荫棚。

优选的，闭瓶炼苗时间为2d。

优选的，开瓶炼苗时间为3d。

本申请与现有技术相比，其详细说明如下：

本发明提供的组织培养方法繁殖观叶秋海棠，能快速获得遗传性状一致的壮苗，为进一步开展品种改良奠定基础。初代培养过程，分化率高，得到的平均初代丛生芽株高高；诱导培养过程得到的生根苗生根数多，根长长，得到的生根苗株高高；增殖培养过程，得到的壮苗株高高。

利用本发明提供的组织培养方法培繁殖观叶秋海棠，只需使用两种培养基，采用第一培养基进行初代培养，得到初代丛生芽；采用第二培养基对初代丛生芽进行诱导培养，得到生根苗；生根苗的叶片为母本剪切后采用第一培养基进行前期增殖培养，得到继代丛生芽，采用第二培养基继代丛生芽进行进一步增殖培养，得到壮苗，繁殖时间短，繁殖系数高，繁殖系数最高可达到20，提高了观叶秋海棠繁殖效率。培养流程简便，操作简易，省时省力，成本低；此外，第二培养基为1/2MS基本固体培养基，无需额外加入蔗糖，节约成本的同时降低污染率，有较好经济效益。

本发明提供的组织培养方法采用的是观叶秋海棠经幼嫩叶片作为外植体，观叶秋海棠经幼嫩叶片为观叶秋海棠叶插后28～32d的新叶，外植体污染率在5％以下，污染率低，有较好经济效益；适用于多种观叶秋海棠品种的培养，为具有广谱性组织培养方法。。

本发明提供的组织培养方法，壮苗生长健壮，炼苗移栽后得到的观叶秋海棠驯化苗移栽后，成活率高，可达90％以上；灭菌处理为升汞灭菌处理2～3min，操作简便。

本发明提供的组织培养方法，不受季节气候变化、自然灾害的影响，全年可生产。能够良好的保持优良品系的特征特性，可以直接应用于实际生产，具有较好经济效益、社会效益和生态效益。

附图说明

图1示出了本发明实施例1中初代培养过程初代丛生芽的情况；

图2示出了本发明实施例1中诱导培养过程生根苗的根系的情况；

图3示出了本发明实施例1中增殖培养过程壮苗前期的情况；

图4示出了本发明实施例1中增殖培养过程壮苗后期的情况。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供了一种观叶秋海棠的组织培养方法，包括以下步骤：

按照本发明，优选的，所述观叶秋海棠经幼嫩叶片为观叶秋海棠叶插后28～32d的新叶。

按照本发明，根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5～2mg/L KT、0.1～1mg/L NAA、0.1～1mg/L2,4-D、10～30g/L蔗糖、6～10g/L琼脂。优选的，所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/LKT、0.2mg/L NAA、0.1mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、8g/L琼脂。

按照本发明，优选的，所述初代培养、所述诱导培养和所述增殖培养过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h。优选的，所述炼苗移栽过程培养温度为24～26℃，培养湿度为60～80％。优选的，所述第一培养基和所述第二培养基的pH值为6.0～6.5。

按照本发明，优选的，所述灭菌处理为升汞灭菌处理。优选的，所述灭菌处理为升汞灭菌处理2～3min。

按照本发明，优选的，所述预处理过程具体为：取观叶秋海棠经幼嫩叶片剪切成方块，升汞灭菌处理2～3min，无菌水清洗3～5遍，得到消毒灭菌后的外植体。

按照本发明，优选的，所述炼苗移栽过程具体为：将所述生根苗至于大棚中，经闭瓶炼苗，开瓶炼苗后，移栽进苗床中培养，得到观叶秋海棠驯化苗。优选的，所述苗床的基质包括：草炭和蛭石，所述草炭和所述蛭石体积比为7:3。优选的，所述大棚为荫棚。优选的，闭瓶炼苗时间为2d。优选的，开瓶炼苗时间为3d。

实施例1

本发明所述的观叶秋海棠的组织培养方法，包括以下步骤：

预处理：取观叶秋海棠经幼嫩叶片剪切成1cm*1cm方块，升汞灭菌处理2～3min，无菌水清洗3～5遍，得到消毒灭菌后的外植体；所述观叶秋海棠经幼嫩叶片为观叶秋海叶插后30d的新叶；

初代培养：将所述消毒灭菌后的外植体接种于第一培养基进行初代培养，得到初代丛生芽；所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.1mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；所述初代丛生芽如图1所示

诱导培养：将所述初代丛生芽接种到第二培养基进行诱导培养，得到生根苗；所述第二培养基为1/2MS基本固体培养基；所述生根苗的根系如图2所示；

增殖培养：将所述生根苗的叶片为母本剪切成1cm*1cm方块后，接种到第一培养基进行培养，得到继代丛生芽；将所述继代丛生芽接种到第二培养基进行培养，得到壮苗；所述壮苗前期如图3所示，所述壮苗后期如图4所示；

炼苗移栽：将所述生根苗至于大棚中，经闭瓶炼苗，开瓶炼苗后，移栽进苗床中培养，得到观叶秋海棠驯化苗。

其中，所述初代培养、所述诱导培养和所述增殖培养过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h。所述炼苗移栽过程培养温度为24～26℃，培养湿度为60～80％。所述苗床的基质包括：草炭和蛭石，所述草炭和所述蛭石体积比为7:3。所述大棚为荫棚。

本实施例中，初代培养过程中，初代培养时间为20～25天。诱导培养过程中，诱导培养得到生根苗的时间为10～15天；每株生根苗平均根数为15～20根，根长为8～12cm，生根苗株高为3～4cm。增殖培养过程，得到的壮苗株高为4～8cm，增殖培养时间为20～25天，增殖系数为20。

实施例2

本发明和实施例1的区别仅在于：所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.2mg/L KT、0.05mg/L NAA、0.02mg/L 2,4-D、10g/L蔗糖、6g/L琼脂。

本实施例中，初代培养过程中，初代培养时间为30～35天。诱导培养过程中，诱导培养得到生根苗的时间为30～35天；每株生根苗平均根数为10～14根，根长为6～10cm，生根苗株高为2～3cm。增殖培养过程，得到的壮苗株高为3～6cm，增殖培养时间为30～35天，增殖系数为8。

实施例3

本发明和实施例1的区别仅在于：所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5mg/L KT、0.1mg/L NAA、0.1mg/L 2,4-D、20g/L蔗糖、7g/L琼脂。

本实施例中，初代培养过程中，初代培养时间为20～25天。诱导培养过程中，诱导培养得到生根苗的时间为20～25天；每株生根苗平均根数为14～18根，根长为8～12cm，生根苗株高为3～4cm。增殖培养过程，得到的壮苗株高为4～7cm，增殖培养时间为25～30天，增殖系数为10。

实施例4

本发明和实施例1的区别仅在于：所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充2mg/L KT、1mg/L NAA、1mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、8g/L琼脂。

本实施例中，初代培养过程中，初代培养时间为20～25天。诱导培养过程中，诱导培养得到生根苗的时间为20～25天；每株生根苗平均根数为14～18根，根长为8～12cm，生根苗株高为3～4cm。增殖培养过程，得到的壮苗株高为4～8cm，增殖培养时间为25～30天，增殖系数为15。

实施例5

本发明和实施例1的区别仅在于：所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充3mg/L KT、3mg/L NAA、1.5mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、10g/L琼脂。

本实施例中，初代培养过程中，初代培养时间为20～25天。诱导培养过程中，诱导培养得到生根苗的时间为30～35天；每株生根苗平均根数为14～16根，根长为8～12cm，生根苗株高为3～4cm。增殖培养过程，得到的壮苗株高为4～7cm，增殖培养时间为25～30天，增殖系数为12。

实施例6

第一培养基中生长激素浓度对初代丛生芽生长的影响

取观叶秋海棠经幼嫩叶片剪切成1cm*1cm方块，升汞灭菌处理2～3min，无菌水清洗3～5遍，得到消毒灭菌后的外植体；取生长情况一致的消毒灭菌后的外植体若干，接种于第一培养基进行初代培养，得到初代丛生芽；所述初代培养过程，培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h；第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充KT、NAA、2,4-D、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，根据生长激素浓度进行分组，观察并记录第一培养基中消毒灭菌后的外植体的培养情况，具体分组及培养结果见表1。

表1

上表可以看出，第一培养基补充补充0.5～2mg/L KT、0.1～1mg/L NAA、0.1～1mg/L 2,4-D时，外植体分化率较高，平均初代丛生芽株高也较高，为第一培养基的较适合的生长激素组成条件；第一培养基补充1.5mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.1mg/L 2,4-D时，外植体分化率高，平均初代丛生芽株高也最高，为第一培养基的最适合的生长激素组成条件。

实施例7

第一培养基中生长激素浓度对继代丛生芽生长的影响

取观叶秋海棠经幼嫩叶片剪切成1cm*1cm方块，升汞灭菌处理2～3min，无菌水清洗3～5遍，得到消毒灭菌后的外植体；取消毒灭菌后的外植体，接种于第一培养基进行初代培养，得到初代丛生芽；所述初代培养过程，培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h；初代培养的第一培养基采用MS基本培养基，补充1.5mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.1mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、8g/L琼脂；将所述初代丛生芽接种到第二培养基进行诱导培养，得到生根苗；所述第二培养基为1/2MS基本固体培养基。

取生长情况一致的生根苗若干叶片为母本剪切成1cm*1cm方块，接种到第一培养基进行培养，得到继代丛生芽；此时，第一培养基采用MS基本培养基，补充KT、NAA、2,4-D、30g/L蔗糖；根据生长激素浓度进行分组，观察并记录第一培养基中生根苗的培养情况，具体分组及培养结果见表2。

表2

上表可以看出，第一培养基补充补充0.5～2mg/L KT、0.1～1mg/L NAA、0.1～1mg/L 2,4-D时，分化率较高，平均继代丛生芽株高也较高，为第一培养基的较适合的生长激素组成条件；第一培养基补充1.5mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.1mg/L2,4-D时，分化率高，平均继代丛生芽株高也最高，为第一培养基的最适合的生长激素组成条件。

实施例8

对照组

采用叶插繁殖观叶秋海棠苗木，首先要对苗圃进行疏松，并配上肥料，然后将观叶秋海棠处理成可以扦插的母本，将母本扦插到苗圃上。后期对其进行光照、施肥等工序得到幼苗。

将上述实施例1～5得到的观叶秋海棠驯化苗和对照组得到的幼苗进行移栽，移栽后以常规水肥方式管理直至出圃。移栽后30天测量成活率，所得结果将表4。

表4

苗本	成活率(％)
		实施例1	94
实施例2	75
		实施例3	80
实施例4	85
		实施例5	85
对照组	42

从上表可以看出，本发明组织培养方法得到的观叶秋海棠驯化苗成活率高，为90％以上。相对于叶插繁殖观叶秋海棠，提高了成活率。

本发明中，培养基成分解释：

MS基本培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。

1/2MS基本固体培养基为MS基本培养基中，大量元素减半，其余不变形成的培养基。

KT为激动素是一种非天然的细胞分裂素，化学名称为6-糖基氨基嘌呤(或N6-呋喃甲基腺嘌呤),除具有细胞分裂的作用外，还具有延缓离体叶片和切花衰老，诱导芽分裂和发育及增加气孔开度的作用。

NAA为萘乙酸，是一种植物生长激素，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组织培养，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。

2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，作为植物生长调节剂可促进植物生根，调节细胞生长。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种观叶秋海棠的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

初代培养：将所述消毒灭菌后的外植体接种于第一培养基进行初代培养，得到初代丛生芽；所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.2～3mg/L KT、0.05～2mg/L NAA、0.02～1.5mg/L 2,4-D、10～30g/L蔗糖、6～10g/L琼脂；

诱导培养：将所述初代丛生芽接种到第二培养基进行诱导培养，得到生根苗；所述第二培养基为1/2MS基本固体培养；

2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充0.5～2mg/L KT、0.1～1mg/L NAA、0.1～1mg/L 2,4-D、10～30g/L蔗糖、6～10g/L琼脂。

3.根据权利要求2所述的组织培养方法，其特征在于，所述第一培养基的组成为：MS基本培养基，补充1.5mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.1mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖、8g/L琼脂。

4.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述初代培养、所述诱导培养和所述增殖培养过程培养温度为22～24℃，培养湿度为65～75％，光暗周期为12h/12h。

5.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述炼苗移栽过程培养温度为24～26℃，培养湿度为60～80％。

6.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述第一培养基和所述第二培养基的pH值为6.0～6.5。

7.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述预处理过程具体为：取观叶秋海棠经幼嫩叶片剪切成方块，升汞灭菌处理2～3min，无菌水清洗3～5遍，得到消毒灭菌后的外植体。

8.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述炼苗移栽过程具体为：将所述生根苗至于大棚中，经闭瓶炼苗，开瓶炼苗后，移栽进苗床中培养，得到观叶秋海棠驯化苗。

9.根据权利要求6所述的组织培养方法，其特征在于，所述苗床的基质包括：草炭和蛭石，所述草炭和所述蛭石体积比为7:3。

10.根据权利要求6所述的组织培养方法，其特征在于，所述大棚为荫棚。