CN111034616B - 西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法 - Google Patents

西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法，该方法是指：将除菌后的西兰花毛状根进行PCR检测基因rol B和rol C，选取存在rol B和rol C基因的毛状根作为原料，将该原料接种于含有甲硫氨酸的MS液体培养基中，经恒温振荡培养14~16d，再添加褪黑素溶液，培养18 d后检测毛状根生物量和增殖倍数，检测毛状根中萝卜硫苷及萝卜硫素含量、培养基中萝卜硫苷和萝卜硫素释放量即可。本发明既提高了毛状根的增殖能力和次生代谢物质的合成能力，又通过控制物理因素提高了毛状根中的次生代谢产物萝卜硫素和萝卜硫苷向培养基中的释放以及萝卜硫苷和萝卜硫素之间的转化率，降低了萝卜硫苷和萝卜硫素积累造成的反馈抑制效应。

Description

西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法
技术领域
本发明涉及西兰花毛状根培养体系，尤其涉及西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法。
背景技术
西兰花中的萝卜硫素是截至目前发现的天然抗癌物质中作用效力最强、效果最好的单一活性成分之一，其具有独特的防癌抗癌功效。黑芥子酶和萝卜硫苷位于不同细胞中。当植物受到外源机械损伤和病虫害时，黑芥子酶和萝卜硫苷接触发生反应后在特定条件下（pH 5~8）生成萝卜硫素。因此，大量合成萝卜硫苷以及促进萝卜硫苷向萝卜硫素转化有利于提高萝卜硫素产量。萝卜硫苷和萝卜硫素的累积易导致反馈抑制效应的发生，因此将二者释放到培养基中可缓解反馈抑制，同时促进二者在细胞内的合成。
利用离体器官毛状根规模化培养生产植物次生代谢物已在部分物种得以成功，西兰花毛状根培养也有报道。研究表明植物激素ABA、2,4-表油菜素内酯可以调节十字花科植物中硫苷的合成。褪黑素作为新的植物激素被广泛应用研究，目前还未有褪黑素用于毛状根培养体系的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种转化效率高的西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法。
为解决上述问题，本发明所述的西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法，其特征在于：将除菌后的西兰花毛状根进行PCR检测基因rol B和rol C，选取存在rol B和rol C基因的毛状根作为原料，按0.5 g/L的接种量将该原料接种于pH=6且浓度为0.1~0.5 mg/L的含有甲硫氨酸的MS液体培养基中，于25℃、110 r/min恒温振荡培养14~16d，再按20~60 μmol/L的用量添加浓度为10 mmol/L的褪黑素溶液，培养18 d后检测毛状根生物量和增殖倍数，检测毛状根中萝卜硫苷及萝卜硫素含量、培养基中萝卜硫苷和萝卜硫素释放量即可。
所述除菌后的西兰花毛状根是按下述步骤制得：
⑴将西兰花种子先用流水冲洗15min，然后在无菌环境下用体积浓度为75%的酒精消毒30 s，无菌水冲洗2次，最后用质量浓度为5 %的 NaClO消毒5 min，无菌水冲洗4次，即得消毒后的西兰花种子；
⑵将所述消毒后的西兰花种子按5颗/瓶的接种量接种于MS固体培养基上，于25℃光照培养15d，得到西兰花无菌苗；
⑶将所述西兰花无菌苗的叶片切成0.5cm2大小作为外植体，该外植体按一个培养皿15片的接种量置于盛有MS固体培养基的培养皿中，黑暗下25℃培养4d后，用YEB培养基活化好的发根农杆菌ATCC15834侵染5min，之后挑选伤口未发黑的叶片，按一个培养皿15片的接种量转接于诱导培养基上，25℃暗培养10d，得到毛状根；
⑷待所述毛状根生长至3~4cm，挑选乳白色的毛状根先按一个培养皿10根的接种量转接于除菌培养基上，每3天转接一次，连续转接除菌3次，再按一个培养皿5根的接种量转接至MS液体培养基中，于25℃、110r/min黑暗培养30 d，即得。
所述步骤⑶中诱导培养基是指在1L MS固体培养基中添加4 mL浓度为4.9 g/L的乙酰丁香酮溶液，混匀后即得。
所述步骤⑷中除菌培养基是指在1L MS固体培养基中添加38.4 mL浓度为6.5 g/L的羧苄青霉素二钠溶液，混匀后即得。
所述pH=6且浓度为0.1~0.5 mg/L的含有甲硫氨酸的MS液体培养基是指1L MS液体培养基中添加0.1~0.5 mg甲硫氨酸，混匀后即得。
本发明所述释放量是指毛状根中合成的萝卜硫苷及萝卜硫素释放到培养基中后，经过提取和HPLC法测定得到的二者的数值。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明添加了甲硫氨酸，由于甲硫氨酸可促进植物生长且是硫萝卜硫苷合成的前体物质，因此，可以有效提高毛状根生物量和萝卜硫苷、萝卜硫素的生物合成（参见表1）。
表1 甲硫氨酸对毛状根生物量以及培养体系中萝卜硫苷（GRA）和萝卜硫素（SFN）含量的影响
Figure 882194DEST_PATH_IMAGE001
注：毛状根接种量为0.5 g/mL，毛状根培养体系中培养基体积为300mL。
由表1可知随着甲硫氨酸浓度的增大，毛状根生物量和培养体系中萝卜硫苷和萝卜硫素含量呈先升高后降低趋势。这表明适宜浓度的甲硫氨酸对于植物的生长发育及次生代谢产物萝卜硫苷和萝卜硫素的形成具有促进作用。
2、本发明添加了适宜浓度的褪黑素，由于褪黑素具有良好的抗氧化能力，促进植物生长和植物中次生代谢物质的合成，因此，可以有效促进西兰花毛状根中次生代谢产物萝卜硫苷的合成。
表2 褪黑素对毛状根生物量以及培养体系中萝卜硫苷和萝卜硫素含量的影响
Figure 766973DEST_PATH_IMAGE002
由表2可知随着褪黑素浓度的增大，毛状根生物量和培养体系中萝卜硫苷和萝卜硫素含量呈先升高后降低趋势。
3、本发明通过适宜的摇床转速，使细胞受到机械损伤，不但导致芥子酶和萝卜硫苷接触发生反应，促进了萝卜硫素和萝卜硫苷向培养基中的释放量以及二者的转化率，而且降低了萝卜硫苷和萝卜硫素积累造成的反馈抑制效应。
表3 转速对毛状根生物量以及培养体系中萝卜硫苷和萝卜硫素含量的影响
Figure 34007DEST_PATH_IMAGE003
在悬浮培养体系中，转速的高低关系着培养物受到的剪切力大小以及体系内的营养分布。接种量为0.5 g/mL，于500mL三角瓶中加入培养基体积300mL。由表3随着转速的增大，毛状根的增长显著。在低转速培养时，培养物受到的剪切力过小，培养体系内不能进行良好的传质，营养分布不均，毛状根增长缓慢且适应期较长；当转速过高时，虽然体系内的营养分布均匀，但毛状根团受到剪切力过大，增殖受到影响，当转速升至110 r/min时毛状根生物量最大，且此时培养体系中萝卜硫苷含量及萝卜硫素含量最高。
4、植物的增殖能力和次生代谢合成能力在正常条件下是相反的。与现有的西兰毛状根培养体系相比，本发明以氨基酸进行前体饲喂，通过外源添加适宜浓度的生长调节物质（甲硫氨酸以及褪黑素）既提高了毛状根的增殖能力和次生代谢物质的合成能力，又通过控制物理因素（摇床转速）提高了毛状根中的次生代谢产物萝卜硫素和萝卜硫苷向培养基中的释放以及萝卜硫苷和萝卜硫素之间的转化率，降低了萝卜硫苷和萝卜硫素积累造成的反馈抑制效应。
具体实施方式
实施例1 西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法：
将除菌后的西兰花毛状根进行PCR检测基因rol B和rol C，选取存在rol B和rol C基因的毛状根作为原料，按0.5 g/L的接种量将该原料接种于pH=6且浓度为0.1 mg/L的含有甲硫氨酸的MS液体培养基中，于25℃、110 r/min恒温振荡培养14d，再按20 μmol/L的用量添加浓度为10 mmol/L的褪黑素溶液，培养18 d后检测到：每瓶（300mL）毛状根生物量4.5g干重，增殖倍数50.7，毛状根中萝卜硫苷及萝卜硫素含量分别为0.3 mg/g干重和0.1mg/g干重，培养基中萝卜硫苷和萝卜硫素含量分别为61.5 mg/瓶和7.3 mg/瓶。
其中：pH=6且浓度为0.1 mg/L的含有甲硫氨酸的MS液体培养基是指1L MS液体培养基中添加0.1 mg甲硫氨酸，混匀后即得。
除菌后的西兰花毛状根是按下述步骤制得：
⑴将西兰花种子先用流水冲洗15min，然后在无菌环境下用体积浓度为75%的酒精消毒30 s，无菌水冲洗2次，最后用质量浓度为5 %的 NaClO消毒5 min，无菌水冲洗4次，即得消毒后的西兰花种子。
⑵将消毒后的西兰花种子按5颗/瓶的接种量接种于MS固体培养基上，于25℃光照培养15d，得到西兰花无菌苗。
⑶将西兰花无菌苗的叶片切成0.5cm2大小作为外植体，该外植体按一个培养皿15片的接种量置于盛有MS固体培养基的培养皿中，黑暗下25℃培养4d后，用YEB培养基活化好的发根农杆菌ATCC15834侵染5min，之后挑选伤口未发黑的叶片，按一个培养皿15片的接种量转接于诱导培养基上，25℃暗培养7d，得到毛状根。
诱导培养基是指在1L MS固体培养基中添加4 mL浓度为4.9 g/L的乙酰丁香酮溶液，混匀后即得。
⑷待毛状根生长至3~4cm，挑选乳白色的毛状根先按一个培养皿10根的接种量转接于除菌培养基上除菌，每3天转接一次，连续转接除菌3次。再按一个培养皿5根的接种量转接至MS液体培养基中，于25℃、110r/min黑暗培养30 d，即得。
除菌培养基是指在1L MS固体培养基中添加38.4 mL浓度为6.5 g/L的羧苄青霉素二钠溶液，混匀后即得。
实施例2 西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法：将除菌后的西兰花毛状根进行PCR检测基因rol B和rol C，选取存在rol B和rol C基因的毛状根作为原料，按0.5 g/L的接种量将该原料接种于pH=6且浓度为0.5 mg/L的含有甲硫氨酸的MS液体培养基中，于25℃、110 r/min恒温振荡培养16d，再按60 μmol/L的用量添加浓度为10mmol/L的褪黑素溶液，培养18 d后检测到：每瓶（300mL）毛状根生物量为6.2 g干重，增殖倍数为70.4，毛状根中萝卜硫苷和萝卜硫素含量分别为0.2 mg/g干重和0.3 mg/g干重，培养基中萝卜硫苷和萝卜硫素含量分别为81.7 mg/瓶和9.5 mg/瓶。
其中：pH=6且浓度为0.5 mg/L的含有甲硫氨酸的MS液体培养基是指1L MS液体培养基中添加0.5 mg甲硫氨酸，混匀后即得。
除菌后的西兰花毛状根同实施例1。
实施例3 西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法：将除菌后的西兰花毛状根进行PCR检测基因rol B和rol C，选取存在rol B和rol C基因的毛状根作为原料，按0.5 g/L的接种量将该原料接种于pH=6且浓度为0.3 mg/L的含有甲硫氨酸的MS液体培养基中，于25℃、110 r/min恒温振荡培养15d，再按40 μmol/L的用量添加浓度为10mmol/L的褪黑素溶液，培养18 d后检测到：每瓶（300mL）毛状根生物量为3.4 g干重，增殖倍数为40.3，毛状根中萝卜硫苷及萝卜硫素含量分别为0.2 mg/g干重和0.2 mg/g干重，培养基中萝卜硫苷和萝卜硫素含量分别为47.2 mg/瓶和5.2 mg/瓶。
其中：pH=6且浓度为0.3 mg/L的含有甲硫氨酸的MS液体培养基是指1L MS液体培养基中添加0.3 mg甲硫氨酸，混匀后即得。
除菌后的西兰花毛状根同实施例1。
上述实施例1~3中，MS固体培养基的制备方法：量取蒸馏水0.32 L倒入刻度容器中，在2100 W电磁上加热至沸腾，加入5 g琼脂，快速搅拌使琼脂充分溶解后加入30 g蔗糖，依次量取20 mL大量母液（成分：1.65 g NH4NO3、1.9 g KNO3、0.17 g KH2PO4）、10 mL微量母液（成分：0.0223 g MnSO4·4H2O、0.0086 g ZnSO4.7H2O、0.0062 g H3BO3、0.00083 g KI、0.00025 g Na2MoO4·2H2O、0.000025 g CuSO4·5H2O、0.000025 g CoCl2.6H2O、）、10 mL有机母液（成分：0.0005 g烟酸、0.002 g甘氨酸、0.0004 g盐酸硫胺素、0.0005 g盐酸吡哆醇）、10 mL钙盐母液（成分：0.44 g CaCl2·2H2O）、10 mL镁盐母液（成分：0.37 g MgSO4·7H2O）和10 mL肌醇母液（成分：0.1 g 肌醇）加入500 mL烧杯中，将烧杯中的母液倒入容器中，用适量蒸馏水涮洗烧杯3次并倒入容器中，量取10 mL铁盐母液（成分：0.0278 gFeSO4.7H2O 和0.0373 g Na2-EDTA）倒入容器中，用蒸馏水定容至1L，用1 mol/L NaOH溶液调pH=6，于121℃灭菌20 min后即得。
MS液体培养制备方法同制备固体培养基，区别在于液体培养基不加琼脂。
YEB液体培养基的制备方法：量取 0.5 L蒸馏水倒入刻度容器中，在2100 W电磁上加热至沸腾，依次加入4 g MgSO4·7H2O、5 g牛肉膏和5 g蛋白胨，酵母浸粉1 g，搅拌充分溶解，加入蒸馏水定容至1L，用1 mol/L NaOH溶液调pH=7.4，于121℃灭菌20 min后即得。

Claims (5)

1.西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法，其特征在于：将除菌后的西兰花毛状根进行PCR检测基因rol B和rol C，选取存在rol B和rol C基因的毛状根作为原料，按0.5 g/L的接种量将该原料接种于pH=6且浓度为0.1~0.5 mg/L的含有甲硫氨酸的MS液体培养基中，于25℃、110 r/min恒温振荡培养14~16d，再按20~60 μmol/L的用量添加浓度为10 mmol/L的褪黑素溶液，培养18 d后检测毛状根生物量和增殖倍数，检测毛状根中萝卜硫苷及萝卜硫素含量、培养基中萝卜硫苷和萝卜硫素释放量即可。
2.如权利要求1所述的西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法，其特征在于：所述除菌后的西兰花毛状根是按下述步骤制得：
⑴将西兰花种子先用流水冲洗15min，然后在无菌环境下用体积浓度为75%的酒精消毒30 s，无菌水冲洗2次，最后用质量浓度为5 %的 NaClO消毒5 min，无菌水冲洗4次，即得消毒后的西兰花种子；
⑵将所述消毒后的西兰花种子按5颗/瓶的接种量接种于MS固体培养基上，于25℃光照培养15d，得到西兰花无菌苗；
⑶将所述西兰花无菌苗的叶片切成0.5cm2大小作为外植体，该外植体按一个培养皿15片的接种量置于盛有MS固体培养基的培养皿中，黑暗下25℃培养4d后，用YEB培养基活化好的发根农杆菌ATCC15834侵染5min，之后挑选伤口未发黑的叶片，按一个培养皿15片的接种量转接于诱导培养基上，25℃暗培养10d，得到毛状根；
⑷待所述毛状根生长至3~4cm，挑选乳白色的毛状根先按一个培养皿10根的接种量转接于除菌培养基上，每3天转接一次，连续转接除菌3次，再按一个培养皿5根的接种量转接至MS液体培养基中，于25℃、110r/min黑暗培养30 d，即得。
3.如权利要求2所述的西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法，其特征在于：所述步骤⑶中诱导培养基是指在1L MS固体培养基中添加4 mL浓度为4.9 g/L的乙酰丁香酮溶液，混匀后即得。
4.如权利要求2所述的西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法，其特征在于：所述步骤⑷中除菌培养基是指在1L MS固体培养基中添加38.4 mL浓度为6.5 g/L的羧苄青霉素二钠溶液，混匀后即得。
5.如权利要求1所述的西兰花毛状根高萝卜硫苷和萝卜硫素合成释放培养方法，其特征在于：所述pH=6且浓度为0.1~0.5 mg/L的含有甲硫氨酸的MS液体培养基是指1L MS液体培养基中添加0.1~0.5 mg甲硫氨酸，混匀后即得。
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