KR100413613B1 - 식물 조직 배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의대량 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조직 배양에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 식물체의 뿌리, 줄기, 잎 등의 조직을 배양하여 캘러스를 유기시키는 단계와,

상기 유기된 캘러스로부터 부정근을 발생시켜 게르마늄이 포함된 배지에서 증식시키는 단계와,

상기 증식시킨 부정근을 생물반응기 내에서 대량 배양하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조직 배양에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체 생산 방법에 관한 것이다.

이와 같은 방법에 의하면 생리 활성 물질로 알려진 게르마늄을 다량 함유한 식물체를 조직 배양에 의해 생산할 수 있고, 환경, 토양 및 농약 오염과는 무관한 무공해 식물체를 실험실 또는 공장에서 연중 생산할 수 있다.

Description

식물 조직 배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법{The method for mass production and proliferation of plants containing germanium by plant tissue culture}

게르마늄의 의학적인 효능이 처음 발견된 것은 1930년 프랑스와 스페인의 국경 지방인 Lourdes의 샘물이 여러가지 질병 치료에 큰 효과가 있다는 보고서가 발표된 이후 계속된 샘물의 성분 분석 결과 게르마늄의 함량이 매우 높다는 사실이 알려지면서부터이다. 그 후 체내에 잔류하지 않고 약리작용을 할 수 있는 유기 게르마늄에 대한 연구가 활발히 진행되어 인삼, 마늘, 영지, 명일엽 등과 같은 보양, 강장의 작용이 있는 약초에 비교적 많은 양의 유기 게르마늄이 함유되어 있다는 것이 밝혀졌고, 유기 게르마늄을 암, 간염, 류마치스 관절염, 피부질환, 노화 등과 같은 난치성 성인병 치료에 이용하려는 연구가 계속되고 있다.

1967년 닥터 가주히코 아사이는 생체 결합 게르마늄인 Ge-132를 합성하는데 성공하였으며, 임상학적 연구에서 항암효과, 각종 바이러스 감염 치료와 류마티스성 질환, 노인성 골다공증 치료 효과, 중금속 해독 작용 등의 약리효과가 밝혀지고 있으며 이외에도 세포내 산소 공급 증진, 혈액의 정화, 암세포를 직접 공격하는NK(Natural killer) 세포와 macrophage의 활성화, 면역 체계에 중요한 역할을 하며 강력한 항암인자인 인터페론의 분비 유도, cytoxic T-lymphocyte의 생산 조절 등의 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

또한 게르마늄이 DNA 내에서 자유전자의 전위와 방향성을 유지시켜주고 DNA의 electron conductivity와 hole conductivity를 조절하며 이들 conductivity는 유전자 발현에 대한 정보의 ON/OFF에 참여한다는 주장도 나오고 있다.

이와 같은 유기 게르마늄을 섭취 이용할 수 있는 방법으로써 국내 특허 공개번호 특2000-0024029의 유기 게르마늄을 함유한 더덕 생산 기술, 등록번호 특0159834의 유기 게르마늄 콩나물 재배 방법, 등록번호 특1996-0016184의 유기 게르마늄(Ge-132)을 다량 함유하는 농산물 재배 방법 등과 같이 목적하는 대상물의 재배시 토양, 재배수 등에 게르마늄을 첨가하여 대상물이 게르마늄을 함유하게 하는 방법에 관한 내용이 특허화 되어있으며 효모나 미생물을 이용하여 무기 게르마늄을 유기 게르마늄으로 대량 생산하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이와 같은 유기 게르마늄은 인삼, 영지버섯, 구기자, 생강, 마늘 등과 같이 건강식품으로 흔히 섭취하는 한약재, 자연식물 등에 함유되어 있는 것으로 알려지고 있지만 고가의 약용 식물들을 기후에 장애를 받지 않고 연중 대량 생산을 하기 위한 방법의 개발은 미흡한 실정이며 또한 조직배양기법을 통하여 얻은 다양한 조직(부정근, 캘러스, 모상근)에 게르마늄을 처리하여 식물체내 게르마늄의 함량을 증가시키는 방법의 개발은 전무한 실정이다.

본 발명은 상기의 사항들을 고려하여 안출한 것으로서, 본 발명의 목적은 식물체의 조직배양기법을 통하여 얻은 다양한 조직(캘러스, 부정근, 모상근)에 게르마늄을 처리하여 식물체의 생장에 영향을 주지 않는 범위 내에서 식물체내 게르마늄의 함량을 증가시킴으로써 게르마늄을 다량 함유한 다양한 약용 식물과 식용 식물체의 대량 생산을 가능하게 하는 식물조직배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법을 제공하는 데 있다.

이와 같은 목적을 달성하기 위해서 본 발명에 따른 식물조직배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법은 식물체의 뿌리, 줄기, 잎 등의 조직을 배양하여 캘러스를 유기시키는 단계와,

상기 유기된 캘러스로부터 부정근을 발생시켜 게르마늄이 포함된 배지에서 증식시키는 단계와,

상기 증식시킨 부정근을 생물반응기 내에서 대량 배양하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것으로서, 생리 활성 물질로 알려진 게르마늄을 다량 함유한 식물체를 조직 배양에 의해 생산할 수 있고, 환경, 토양 및 농약 오염과는 무관한 무공해 식물체를 실험실 또는 공장에서 연중 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 사용되는 유기 게르마늄은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였고 무기 게르마늄 역시 일반적으로 유통되는 제품을구입하여 사용하였으며, 식물체로서는 인삼, 장뢰삼, 산삼, 시호, 지황, 오갈피 등의 약용 식물과 마늘, 홍화, 레드비트 등의 식용 식물체에 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 구체적인 기술 내용은 다음과 같다.

식물체를 멸균 소독한 후 2∼3㎟의 절편으로 한 다음 2, 4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid), Pichloram, NAA(naphthalemeacetic acid) 각각을 1.0∼10.0㎎/L의 양으로 첨가한 MS(Murashige-Skoog) 배지에 접종하고 캘러스를 유도한다. 그 중 2, 4-D와 Pichloram, NAA 각각을 2.0㎎/L로 첨가하였을 경우 가장 바람직한 것으로 나타났다.

상기 유도된 캘러스를 생장 조절제로서 2,4-D를 0.1∼5.0㎎/L 첨가한 MS 배지에서 증식시킨 다음 2∼4주 간격으로 계대 배양하면서 IBA와 NAA중 1종을 1.0∼5.0㎎/L 양으로 첨가한 MS 배지에 옮겨 주며 부정근을 형성시킨다.

이 때 캘러스 증식을 위해 사용되는 배지로서 MS 배지 외에 SH(Schenk and Hildebrandt) 배지, B5(Gamborg) 배지, LP(Quorin and lepoivre) 배지, White 배지 등을 사용하여 배양하였을 경우, 효과는 거의 비슷하였으나 배양 기간에 따라 차이를 나타내었으며 이 중 MS 배지와 3/4 SH 배지에서 가장 바람직한 결과를 얻을 수 있었다. 또한 캘러스 생장에 영향을 미치는 생장조절제로서 NAA 또는 IBA를 각각 1.0∼5.0㎎/L로 첨가하는 경우도 바람직한 결과를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

상기 형성된 부정근을 유기 게르마늄 10∼120mg/L과 무기 게르마늄 10∼120mg/L중 어느 하나를 첨가한 MS 배지에서 무기물 농도 1/2∼3/4, pH 5.7∼6.0, 당농도 3∼5%, 온도 18∼24℃의 조건으로 증식시킨 다음 배양 절편체를포함하여 새로 형성된 측근을 무작위로 1∼2㎝로 절단하여 공기 부양형 풍선형 생물반응기에 접종한다.

상기 생물 반응기에 접종한 부정근을, 온도 22℃, 공기주입량 0.05∼0.3vvm로 하고 설탕 3%를 첨가한 MS 배지에 생장 조절제로서 BSAA(benzo [b] selenienyl acetic acid), IBA, NAA 중 1종을 1.0∼10.0㎎/L의 양으로 첨가하여 pH 6.0에서 배양한다.

이 때 2주 간격으로 공기 주입량을 증가시켜 뿌리의 엉김 현상을 방지해주는 것이 바람직하며 전체 생산량 감소를 방지하기 위해 생물반응기내에서의 부정근 배양 2주후 부정근을 재접종해 주는 것이 바람직하다.

이와 같이 배양이 완료된 부정근을 20∼50ton 규모까지의 더 큰 생물반응기로 단계적으로 스케일 업하여 대량 생산을 가능하게 할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1] 부정근 증식의 최적 조건 선정 실험

캘러스로부터 부정근을 형성시킨 다음 이들 조직을 최단기간 내에 최대 증식되도록 조건을 갖추어 주는 것이 가장 효율적이고 생산비도 절감할 수 있는 방법이므로 다음과 같이 최적 조건을 규명하기 위한 실험을 실시하였다.

IBA 2.0㎎/L가 첨가된 MS 배지 30㎖를 일회용 페트리디쉬에 분주한 후 산삼의 캘러스에서 유래된 부정근을 평균 10㎜ 길이로 잘라 30개씩 접종하였다.

배지의 무기물 농도를 1배, 1/2배, 3/4배로 하여 실험을 실시하였으며, 배지의 pH는 4.0, 5.0, 5.5, 5.7, 6.0, 6.5로 각각 구분하였고 배지의 당 농도는 0%,1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%로 구분하였으며 배양온도는 15℃, 18℃, 20℃, 22℃, 24℃, 26℃로 구분하여 증식 상황을 관찰하였다.

상기 실험 결과 무기물 농도 1/2∼3/4, 배지 pH 5.7∼6.0, 배지의 당 농도 3∼5%, 배양 온도 18∼24℃의 범위가 부정근 증식의 최적 조건인 것으로 나타났다.

[실시예 2] 생장조절제 첨가가 부정근 증식에 미치는 영향

MS 배지에 당을 3% 첨가하고 pH를 6.0으로 고정시킨 후 오옥신으로 IBA, NAA, BSAA 각각을 각각 1㎎/L, 2㎎/L, 3㎎/L, 5㎎/L씩 첨가하여 기본 배지를 만들고 이들 기본 배지를 1L 삼각 플라스크, 5L 생물 반응기에 각각 분주한 다음 산삼과 재배삼의 뿌리(평균 1.0㎝ 길이)를 접종하여 4주 후에 생장량을 조사하여 그 결과를 표 1에 나타내었다.

표 1에서 알 수 있듯이 생장조절제를 처리하지 않은 배지에서는 2배 미만의 증가를 보이는데 비해서 IBA, NAA가 첨가된 배지에서는 5배 이상의 생체중 증가를 보였는데 2∼3㎎/L에서 가장 효과적인 결과를 나타내어 적정 농도임을 알 수 있었다. 한편 새로 합성된 오옥신인 BSAA를 첨가했을 경우에는 생체중이 현저히 증가하였고 그 적정 농도도 역시 2∼3㎎/L임을 알 수 있었다.

재배삼과 산삼의 생체중을 비교해 보면 생물반응기내에서는 재배삼, 산삼간의 증식율에 차이를 나타내지 않았고 생장 양상도 비슷하여 구별이 쉽지 않았다.

따라서 생물반응기내에서 부정근을 대량 증식하기 위해서는 NAA, IBA, BSAA와 같은 생장조절제의 첨가하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다.

[실시예 3] 접종 방법이 부정근의 증식에 미치는 영향

생물 반응기에 식물체의 부정근을 배양할 때 부정근의 조제 방법이 뿌리 증식에 미치는 영향을 규명하기 위하여 인삼의 부정근을 BSAA 2㎎/L가 첨가된 MS 배지에 무절단 배양법, 절편체를 제외하고 측근만 배양하는 방법, 절편체 및 측근의 구분 없이 부정근의 길이를 1∼2㎝로 절단하여 배양하는 방법으로 구분하여 4주간 배양한 다음 그 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2의 결과에서 보듯이 절편체 배양에서 형성된 측근을 절편체와 함께 새로운 배지에 이식하였을 경우 측근의 발생이 이루어지지 않아 생체중 증가가 이루어지지 않았고 갈변화 현상이 발생하였다. 반면에 원래 절편체를 제거하고 형성된 측근만 절단하여 배양하였을 경우 측근 발생수와 생체중이 증가하였으나 접종하는데시간이 오래 걸려 효과적인 방법은 되지 못하였다.

그러나 배양 절편체를 포함하여 새로 형성된 측근을 무작위로 1∼2㎝ 정도 절단하여 새로운 배지에 접종하였을 때의 증식율이 15배 이상으로 나타나 생체중의 증가에 가장 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 절편체 및 측근의 구분 없이 부정근의 길이를 1∼2㎝로 절단하여 접종하는 것이 바람직하다.

[실시예 4] 생물반응기 형태가 부정근 증식에 미치는 영향

대량 증식을 목적으로 생물반응기를 이용하여 배양을 실시할 경우 생물반응기의 형태에 따른 부정근의 증식 결과를 관찰하기 위해 파일럿 규모인 500ℓ, 1000ℓ의 공기 부양형 풍선형 생물반응기와 500ℓ, 1000ℓ의 공기 부양형 드럼형 생물반응기를 비교하여 배양 40일 후 생체중 증가에 미치는 효과를 비교하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.

이 때 본 실시예에 사용되는 재료는 산삼의 부정근을 이용하였으며, 배양실의 온도는 22℃로 고정하였고 생물반응기 내 공기 주입량은 0.05∼0.3vvm으로 하였으며, 배지는 설탕 3%를 첨가한 MS 배지를 사용하였고 생장 조절제로서 BSAA 2.0㎎/L를 첨가하였고 pH는 6.0으로 조절하였다.

표 3의 결과에서 알 수 있듯이 전반적으로 드럼형보다는 공기 부양형 풍선형이 생체중 및 건물중 증가에 효과적이었는데 두 형태 모두 배양 시일이 경과함에 때라 부정근의 엉킴 현상이 발생하였으므로 2주 간격으로 공기 주입량을 증가시켜 뿌리의 엉킴 현상을 방지해주는 것이 바람직하며, 배양 4주 후 발생하는 부정근의 부유 현상으로 인한 전체 생산량 감소를 방지하기 위해서는 배양 2주 후 재접종(약 1kg) 해주는 것이 바람직하다.

또한 50ℓ, 100ℓ 규모의 씨드배양기 및 20∼50ton 규모의 배양기를 가동하기 위한 전단계 배양기인 1∼3ton 규모의 스케일업 배양기 안에는 모터를 이용한 칼날을 부착하여 더 큰 배양기로 옮기기 전 형성된 부정근을 상기 실시예 3의 방법으로 2∼3㎝ 길이로 절단한 후 옮겨 주는 것이 바람직하다.

[실시예 5] 식물체의 유기 게르마늄 흡수 실험

유기 게르마늄의 식물체내의 흡수성을 파악하기 위하여 인삼 부정근을 접종하여 유기 게르마늄을 5L 생물반응기에 각각 0, 10, 30, 60, 90, 120㎎/L로 처리하여 5주간 배양한 후 증류수로 충분히 수세하여 50℃ 열풍 건조기로 건조한 다음 유기 게르마늄 함량을 분석하여 그 결과를 표 4에 나타내었다.

또한 시간에 따른 유기 게르마늄의 식물체내의 흡수성을 조사하기 위하여 30㎎/L의 농도에서 0, 1, 3, 5, 7, 9일 간격으로 부정근과 배양액을 채취하여 수세와 건조 과정을 거쳐 각각 유기 게르마늄 함량을 조사하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.

유기 게르마늄 함량의 분석은 배양 인삼과 배양액에 10ml의 황산을 첨가하여 280℃의 가열판에서 2시간 동안 산분해한 다음, 이와 같이 얻어진 용액을 ICP(Inductively Coupled Plasma Spectrophotometer)로 측정하였다.

표 4의 결과에서 알 수 있듯이 유기 게르마늄 처리시 첨가한 유기 게르마늄의 농도가 증가됨에 따라 생체중과 건물중이 증가한다는 것을 알 수 있었고 유기 게르마늄의 농도 120㎎/L까지는 농도에 상관없이 생장을 촉진하였다.

또한 식물체내 유기 게르마늄 함량도 배양 기간동안 일정하게 증가되었으며 유기 게르마늄의 함량은 배양 식물체의 건물 g당 3075㎍까지 축적되었다.

또한 표 5의 결과에서 보듯이 유기 게르마늄의 흡수는 배양 초기부터 활발히 이루어져 꾸준히 지속되는 것으로 보여진다. 따라서 본 발명에 따른 유기 게르마늄의 계속적인 추가 공급은 식물체내 게르마늄의 함량을 일정량 증가시킬 수 있다고 사료된다.

[실시예 6] 식물체의 무기 게르마늄 흡수 실험

무기 게르마늄의 식물체내의 흡수성을 파악하기 위하여 인삼 부정근을 접종하여 무기 게르마늄을 5L 생물반응기에 각각 0, 10, 30, 60, 90, 120㎎/L로 처리하여 5주간 배양한 후 증류수로 충분히 수세하여 50℃ 열풍 건조기로 건조한 다음 무기 게르마늄 함량을 분석하여 그 결과를 표 6에 나타내었다.

무기 게르마늄 함량의 분석도 유기 게르마늄 함량 분석 방법과 동일한 방법으로 측정하였다.

표 6의 결과에서 알 수 있듯이 무기 게르마늄 처리시 첨가한 무기 게르마늄의 농도가 증가됨에 따라 생체중과 건물중이 증가한다는 것을 알 수 있었고 무기 게르마늄의 농도 120㎎/L까지는 농도에 상관없이 생장을 촉진하였다.

또한 식물체내 무기 게르마늄 함량도 배양 기간동안 일정하게 증가되었으며 무기 게르마늄의 함량은 배양 식물체의 건물 g당 2794㎍까지 축적되었다.

한편 본 발명에 따른 식물 조직 배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법은 상기 실시예의 인삼, 산삼, 장뢰삼 외에도 시호, 지황, 오갈피 등의 약용 식물체와 마늘, 홍화, 레드비트 등의 식용식물체를 대상으로 캘러스, 부정근, 모상근을 유도하여 실시하여도 동일한 효과를 얻을 수 있다.

이상에서 본 바와 같이 본 발명에 따른 식물 조직 배양법에 의한 유기 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법은 조직 배양에 의해 유도된 캘러스, 부정근, 모상근의 증식 배지에 게르마늄을 첨가시켜 게르마늄을 다량 함유한 식물체를 생산할 수 있고, 또한 이와 같이 게르마늄이 함유된 식물체를 바이오메스의 생산 능력도 높고 취급하기도 편리하며 건물중을 증가시켜 생산할 수 있는 획기적인 대량 생산 방법임을 확인할 수 있었다.

상기한 바와 같이 이루어지는 본 발명에 의하면, 식물체의 생물반응기 배양을 위한 증식 조건 중 적정 배지, 배지의 pH, 당농도, 배양 온도, 생장조절제의 종류 등과 같은 최적 증식 조건을 확립하고, 부정근의 접종 방법의 단순화 및 증식율과 생산성이 높은 생물반응기 형태를 확립하는 동시에 게르마늄을 배지에 첨가하여 생장에 영향을 주지 않으면서 식물체내 게르마늄 흡수량을 증가시킬 수 있는 배지내 적정 게르마늄 첨가 농도를 확립함에 따라 기후 및 환경 조건에 영향을 받지 않고 게르마늄을 다량 함유한 고부가가치의 약용식물체 및 식용 식물체를 년중 생산할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

Claims (5)

1. 식물체를 멸균 소독한 후 2∼3㎟의 절편으로 한 다음 2, 4-D(2,4-dichlorophenoxy aceticacid), Pichloram, NAA(naphthalemeacetic acid) 각각을 1.0∼10.0㎎/L의 양으로 첨가한 MS(Murashige-Skoog) 배지에 접종하고 캘러스를 유도하는 단계와,

   상기 유도된 캘러스를 2,4-D 0.1∼5.0㎎/L를 첨가한 MS 배지에서 증식시킨 다음 2∼4주 간격으로 계대 배양하면서 IBA, NAA중 어느 하나를 1.0∼5.0㎎/L의 양으로 첨가한 MS 배지에 옮겨 주며 부정근을 형성시키는 단계와,

   상기 형성된 부정근을 유기 게르마늄 10∼120㎎/L과 무기 게르마늄 10∼120㎎/L 중 어느 하나를 첨가한 MS 배지에서 증식시키는 단계와,

   상기 증식시킨 부정근을 공기 부양형 풍선형 생물반응기에 접종하여 설탕 3%를 첨가한 MS 배지에 생장조절제로서 BSAA(benzo [b] selenienyl acetic acid) 1.0∼10.0㎎/L, IBA 1.0∼10.0㎎/L, NAA 1.0∼10.0㎎/L중 어느 하나를 첨가하여 배양하는 단계와,

   상기 배양된 부정근을 더 큰 용량의 생물반응기로 스케일 업하여 대량 생산하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 식물 조직 배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 형성된 부정근의 증식 조건은 무기물 농도는 1/2∼3/4, pH 5.7∼6.0, 당농도 3∼5%, 온도 18∼24℃인 것을 특징으로 하는 식물 조직 배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 증식시킨 부정근을 생물반응기에 접종하는 방법은 배양 절편체를 포함하여 새로 형성된 측근을 무작위로 1∼2㎝로 절단하여 접종하는 것을 특징으로 하는 식물 조직 배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법.
4. 제 1항 또는 제 3항에 있어서,

   상기 생물반응기내의 부정근 배양 조건은 온도 22℃, 공기주입량 0.05∼0.3vvm, pH 6.0인 것을 특징으로 하는 식물 조직 배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법.
5. 제 1항에 있어서,

   상기 부정근 배양 2주후 부정근을 재접종하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 조직 배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산 방법.