CN108841778B - 一种红豆杉细胞组织培养物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红豆杉细胞组织培养物的培养方法，具体地，将红豆杉种子用灭菌、清洗、浸泡、去种皮，接种在诱导培养基上，进行暗培养，待种子出芽后，培养成红豆杉植株；选取生长良好的红豆杉植株作为外植体；将外植体接种于培养基上，暗培养；之后转移至温度为25℃及28℃的培养室培养；选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织接种到继代培养基进行周期性的继代培养；之后，选取种子，将种子接种到继代培养基中，光培养，培养30～35天后收集，红豆杉细胞组织培养物。本发明提供的红豆杉细胞组织培养物其紫杉醇含量可以达到15‰‑17‰，并且红豆杉细胞组织在传代的过程中不褐化，产生紫杉醇的含量不降低，改变温度、光照等条件依然可以稳定生长。

Description

一种红豆杉细胞组织培养物
技术领域
本发明属于植物生物技术工程技术领域，具体涉及一种红豆杉细胞组织培养物的培养方法。
背景技术
红豆杉系红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)的一类乔木和灌木，全世界共11种，从欧亚大陆和北美的亚北极区到中美和东南亚的亚热带甚至热带地区均有分布。紫杉醇是一种二萜类生物碱，经临床证明对治疗卵巢癌、肺癌、结肠癌、转移性乳腺癌、黑色素瘤、白血病等多种癌症有特效，致使紫杉醇成为当前最热门的抗癌药物之一 。
目前紫杉醇主要从树皮中获取，来源极其有限，这不仅破坏了红豆杉资源和生态平衡，也根本无法满足人们对紫杉醇日益增长的需求。因此应用细胞培养的方法进行红豆杉的开发即可以满足临床对红豆杉药物的需求，也可以保护自然资源，维护生态环境。但在有关红豆杉组织培养的研究报道中，因存在许多问题极大地限制了其在实际生产中的应用，存在的问题有：在放大过程中不稳定，当放大培养到一定规模后有效成分的含量会降低；没有找到有效的筛选高产细胞系的手段等。
近几年，一些科研院所及学校，诱导出的红豆杉细胞系，虽具有较好的细胞生长特性及紫杉醇合成能力。但仍存在以下不足：（1）细胞紫杉醇含量低；（2）细胞对外在环境适应能力差；（3）细胞遗传稳定性差，传代次数增加后，发生退化、褐化等迹象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红豆杉细胞组织培养物的培养方法，培养获得的红豆杉细胞组织培养物的有效成分紫杉醇的含量高。对在外环境适应能力强，细胞遗传稳定性强，传代多次后不发生退化、褐化。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种红豆杉细胞组织培养物的培养方法，其包括以下步骤：
S1、将红豆杉种子用灭菌、清洗、浸泡、去种皮，接种在诱导培养基上，在25℃，暗培养，待种子出芽后，培养成红豆杉植株；
S2、选取生长良好的红豆杉植株作为外植体；将外植体接种于诱导培养基上，置于22℃，暗培养5-10天；之后转移至温度为25℃的培养室培养10～20天；最后转移至温度28℃的培养室培养10～15天，获得红豆杉愈伤组织；
S3、选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织接种到培养基进行周期性的继代培养，其培养条件为：培养温度为20～30℃，培养周期为35～40天；之后，选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织作为种子，将种子接种到培养基中，光培养，培养30～35天后收集，获得获得红豆杉细胞组织培养物。
如上所述的培养方法，优选地，在步骤S1中，所述灭菌为采用70～75%酒精浸泡25～30秒钟，再用质量浓度为1%的次氯酸钠溶液浸泡振荡灭菌10分钟；所述清洗用无菌水洗4～6次；所述浸泡为用浓度为0.2mg/L～1.0 mg/L的水杨酸溶液浸泡24小时。
如上所述的培养方法，优选地，在步骤S1中，所述浸泡之后还需使用质量浓度为1%的次氯酸钠溶液浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4～5次。
如上所述的培养方法，优选地，在步骤S2中，所述外植体接种于诱导培养基为在每30ml培养基中接种8～10块直径为0.5cm的外植体。
如上所述的培养方法，优选地，在步骤S3中，所述继代培养为以20重量份以g为单位的所述愈伤组织接种在1000体积份以ml为单位的培养基中。进一步地，所述种子接种到培养基为每30ml培养基中接种8块直径为0.8～1.0cm的愈伤组织。
如上所述的培养方法，优选地，在步骤S3中，2所述光培养条件为光照条件为3～6小时/天，白光，温度为22℃～28℃。
如上所述的培养方法，优选地，所述诱导培养基为含有浓度为0.2mg/L～1.0mg/L水杨酸的培养基。
如上所述的培养方法，优选地，所述培养基包括如下浓度的成分：2500 mg/L的硝酸钾，134mg/L的硫酸铵，170mg/L的磷酸二氢钾，250 mg/L的硫酸镁，150mg/L的氯化钙，0.83mg/L的碘化钾，6.2mg/L的硼酸，22.3mg/L的硫酸锰，2.0mg/L的硫酸锌，0.25mg/L的钼酸钠，0.025mg/L的硫酸铜，0.025mg/L的氯化钴，37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠，27.8mg/L的硫酸亚铁，100mg/L的肌醇，10mg/L的盐酸硫胺素，1.0mg/L的盐酸吡哆醇，0.1mg/L的烟酸。
本发明的有益效果在于：
本发明红豆杉细胞组织的培养方法具有以下的优点：
1、本发明红豆杉细胞中的紫杉醇含量为野生红豆杉植物的10-15倍。
2、本发明红豆杉细胞生长时间短，可以工业化生产。
3、本发明采用固态培养基诱导并培养红豆杉细胞，有效的解决了红豆杉细胞褐化的问题，并能稳定的提高红豆杉细胞中紫杉醇的有效含量。设备简单，成本低。
本发明与采用生物反应器大规模培养红豆杉比较，优点在于：不需要特殊设备，投入成本少，易于实现大量规模化生产。本发明研制的培养基适用天然红豆杉愈伤组织的培养，能促进其快速成长，并诱导紫杉醇的大量产生。
本发明提供的红豆杉细胞组织培养物的培养方法，利用东北红豆杉种子诱导出的细胞组织，其紫杉醇含量可以达到15‰-17‰，并且红豆杉细胞组织在传代的过程中不褐化，产生紫杉醇的含量不降低，改变温度、光照等条件依然可以稳定生长。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本发明红豆杉细胞组织的培养方法包括以下步骤：
1、取天然红豆杉的种子，用75%的酒精溶液浸泡30秒，用质量浓度为1%的次氯酸钠溶液浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4～5次；用含有水杨酸浓度为0.2mg/L～1.0mg/L的水溶液中浸泡24小时；浸泡24小时后，将种子再次使用1%的次氯酸钠溶液浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4～5次；在无菌条件下剥去种子外壳，撕去种子内膜，将去皮种子接种在配好的诱导培养基（含有水杨酸浓度为0.2mg/L～1.0mg/L的培养基）上，每40毫升培养基播种4粒种子；在25℃下，避光培养4～6天，待种子发芽后，培养成红豆杉植株，继续培养至红豆杉植株高5～8cm。
2、取无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽做外植体，在无菌条件下，用无菌手术剪刀和无菌镊子将无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽切成2-5mm长的小段，将外植体接种于诱导培养基上，每30ml诱导培养基中接种8～10块直径为0.5cm的外植体，将外植体放于22℃，暗培养5～10天；之后转移至温度为25℃的培养室培养10～20天；最后转移至温度28℃的培养室培养10～15天，获得红豆杉愈伤组织。
3、筛选高产细胞系，选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织进行周期性的继代培养，愈伤组织的培养条件为：20g的愈伤组织需要在1000ml的培养基培养，培养周期为35天，培养温度为23℃；至培养期，选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织作为种子，每30ml培养基中接种8块直径为0.8～1.0cm的种子，光培养，光照条件为3～6小时/天，白光，温度为22℃～28℃；培养30～35天后收集，低温35℃真空干燥获得红豆杉细胞组织培养物干品。
经测定，用此方法进行的大规模生产成本较低，培养物生长速率快，产量可达12～18克干重/ 月/ 升培养基；干品培养物中紫杉醇含量高，达培养物干重的15‰～17‰，并且培养物质量稳定。在相同的时间里，其生长的生物量远远大于自然条件下生长的红豆杉，前景广阔。
本发明中所用的培养基为经大量实验验证的培养基，最后筛选为适于红豆杉细胞组织物的培养，能使其快速生长，并能促进其紫杉醇含量的产生。其培养基的组分见表1。
表1培养基配方
Figure DEST_PATH_IMAGE001
诱导培养基为在培养基中添加有水杨酸0.2mg/L～1.0mg/L。
实施例2
将实施例1步骤3中获得的种子进行继续继代培养，按培养条件为培养温度为25℃，培养周期为35天；之后选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织接种到继代培养基进行周期性的继代培养为一代，培养60代后，愈伤组织没有发生退化、褐化，再继续进行光培养：光照条件为4小时/天，白光，温度为25℃；培养30天后收集，低温真空干燥。
经测定，产量未减少，且干品培养物中紫杉醇含量可达干重的15‰，说明本发明制备的红豆杉愈伤组织的细胞遗传稳定性强，适应外在环境强。

Claims (5)

1.一种红豆杉细胞组织培养物的培养方法，其特征在于，其包括以下步骤：
S1、将红豆杉种子灭菌、清洗、浸泡、去种皮，接种在诱导培养基上，在25℃，暗培养，待种子出芽后，培养成红豆杉植株；
所述灭菌为采用70～75%酒精浸泡25～30秒钟，再用质量浓度为1%的次氯酸钠溶液浸泡振荡灭菌10分钟；所述清洗用无菌水洗4～6次；所述浸泡为用浓度为0.2mg/L～1.0 mg/L的水杨酸溶液浸泡24小时；
用水杨酸溶液浸泡之后还需使用质量浓度为1%的次氯酸钠溶液再次浸泡振荡灭菌10分钟，用无菌水清洗4～5次；
S2、选取生长良好的红豆杉植株作为外植体；将外植体接种于诱导培养基上，置于22℃，暗培养5～10天；之后转移至温度为25℃的培养室培养10～20天；最后转移至温度28℃的培养室培养10～15天，获得红豆杉愈伤组织；
S3、选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织接种到培养基进行周期性的继代培养，其培养条件为：培养温度为20～30℃，培养周期为35～40天；之后，选取生长旺盛、无褐变、黄白色特征的愈伤组织作为种子，将种子接种到培养基中，光培养，培养30～35天后收集，获得红豆杉细胞组织培养物；
所述培养基包括如下浓度的成分：2500 mg/L的硝酸钾，134mg/L的硫酸铵，170mg/L的磷酸二氢钾，250 mg/L的硫酸镁，150mg/L的氯化钙，0.83mg/L的碘化钾，6.2mg/L的硼酸，22.3mg/L的硫酸锰，2.0mg/L的硫酸锌，0.25mg/L的钼酸钠，0.025mg/L的硫酸铜，0.025mg/L的氯化钴，37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠，27.8mg/L的硫酸亚铁，100mg/L的肌醇，10mg/L的盐酸硫胺素，1.0mg/L的盐酸吡哆醇，0.1mg/L的烟酸；
所述诱导培养基为加有浓度为0.2mg/L～1.0mg/L水杨酸的培养基。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在步骤S2中，所述外植体接种于诱导培养基为在每30ml诱导培养基中接种8～10块直径为0.5cm的外植体。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在步骤S3中，所述继代培养为以20重量份以g为单位的所述愈伤组织接种在1000体积份以ml为单位的培养基中。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在步骤S3中，所述种子接种到培养基为每30ml培养基中接种8块直径为0.8～1.0cm的愈伤组织。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤S3中，所述光培养的条件为3～6小时/天，白光，温度为22℃～28℃。
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