CN110547194A - 紫花三叉白芨的种子组培快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫花三叉白芨的种子组培快速繁殖方法，依次包括以下步骤：1)、取材：选用白芨植株上结的成熟蒴果内的种子；2)、种子的诱导萌发与分化：将种子接种到种子萌发分化培养基上进行培养，直至种子萌发并分化形成有两片小叶的幼苗；3)、生根壮苗：将幼苗转接于生根壮苗培养基上进行培养，直至培养获得同时满足以下条件的小苗：高度≥4.0cm、基部有直径≥0.4cm的假鳞茎、长出长度≥3cm的根至少2条；4)、移栽：将所得小苗进行移栽。采用本发明的方法可以快速简便地获得大量低成本的白芨组培种苗。

Description

紫花三叉白芨的种子组培快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法。

背景技术

白芨(Bletilla striata Reichb)是多年生草本地生兰科白芨属植物，具有极高的药用价值、观赏价值和经济价值。白芨以干燥块茎入药，具有止血、抗菌和抗肿瘤的作用，近年来白芨已成为云南白药、快胃片、白芨颗粒、白芨糖浆等30多种中成药的主要原料，医药上还用于胃镜检查的保护剂，手术止血剂等。随着研究的不断深入，白芨的用途不再局限于医药领域，还成为化工用品的原料。白芨在美容方面具有奇特功效，有“美白仙子”的美誉，白芨面膜、白芨祛痘霜、白芨牙膏、白芨香皂相继开发。工业上将白芨用作染布的黏合剂、高级卷烟烟条黏合剂、高级陶瓷、橡胶制品中。白芨的种子非常细小且无胚乳，需与真菌共生才能萌发，白芨自然繁殖力低，加上长期采挖，使得野生白芨资源日渐枯竭，成为濒危植物，被列为国家重点保护的野生药材品种。

随着白芨利用价值价值不断被开发，市场对其需求量也逐渐上升，但由于传统的无性繁殖方式繁殖系数低，成本过高，无法满足大面积栽培种苗需要，目前组培苗已经成为当前白芨种植的主要种苗来源。

目前现有的白芨的培育方法，有以下几种方法：

1、《紫花白芨组织培养技术研究》：为建立白芨种子高效实用的组织培养技术体系，以紫花大种白芨成熟未开裂蒴果为外植体，进行组培快繁技术研究。结果表明：外植体表面清洁后，在5％次氯酸钠溶液中浸泡15min，之后将种子接种于萌发培养基，配方为MS+6-BA1.0mg/L。种子萌发并形成绿色原球茎即可转入幼苗营养生长培养基，配方为MS+6-BA2.0mg·/L+NAA0.5mg/L。幼苗生长到3cm以上时，接入生根培养基中，配方为1/2MS+6-BA0.1mg/L+NAA 0.5mg/L。待其根系长度达到1cm后，可进行炼苗移栽。

2、《白芨组培快速繁殖体系研究》：以白芨种子为材料，在不同液体培养基中进行无菌播种，通过调节光照时长和pH来筛选白芨种子萌发的最佳条件。利用组织培养方法对白芨进行愈伤组织诱导，并对愈伤组织进行抗褐化和再分化研究。白芨最佳液体快速繁殖条件为MS液体培养基，12h光照时长，pH值5.8～6.5；诱导培养基为MS+1.0mg·L^-1 6-BA+1.5mg·L^-1 2.4-D，增殖培养基为MS+1.0mg·L^-1 6-BA+1.5mg·L^-1 2.4-D+15mg·L^-1抗坏血酸，分化培养基为MS+0.1mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-1 6-BA，生根培养基为MS+0.8mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-1 6-BA，有机添加物对白芨有促进作用。

3、《白芨组培快繁试验研究》：以白芨种子作为试验材料，通过不同的培养基处理，试验研究了白芨的组培快繁技术。试验结果表明：①不同基本培养基对白芨种子萌发的影响，在诱导白芨种子萌发时，低盐的1/2MS作为种子萌发的基本培养基，更有力于种子萌发。而在白芨进行丛芽增殖的时候，富含更多盐分的MS则更加适合，能够提供更多的养分；②不同的植物激素对白芨组培的影响，不同的外源激素及不同的浓度对白芨组培各阶段的影响均不同，种子萌发最好用NAA1mg/L、丛芽增殖培养较适宜6-BA1.0mg/L+NAA0.15mg/L、壮苗生根较适宜NAA0.5mg/L。

诱导白芨种子萌发培养基：1/2MS 2.47g/L+NAA1mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L；

白芨丛芽增殖培养基：MS 4.74g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.15mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L；

壮苗生根培养基：1/2MS 2.47g/L+NAA0.5mg/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L。

4、《白芨种子无菌萌发及其无性繁殖体系的研究》：为实现白芨的快速繁殖和工厂化生产，以白芨的成熟蒴果为材料，在MS、1/2MS添加6-BA的培养基上进行无菌播种。将种子萌发后形成的原球茎接种到不同培养基上进行扩增繁殖，建立白芨无性繁殖体系。结果表明：种子萌发最佳培养基为培养基1/2MS+6-BA1.0mg/L，它能有效提高萌发率，促进原球茎的生长；无性繁殖最佳培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L。此体系的建立有助于白芨的相关研究和产业化。

5、《白芨种子的无菌萌发过程观察和组培快繁研究》：以白芨种子为培养材料，对白芨种子无菌非共生萌发过程中原球茎发育进行了研究；并以白芨组培苗的原球茎和叶片为外植体，进行白芨组织培养快速繁殖技术研究。结果表明：在白芨的种子发育过程中，种胚发育成幼苗有2种方式，1种是小球体经原球茎发育成小苗；第2种是小球体伸长成根状茎后发育成小苗。组培苗的原球茎经切割后在诱导培养基上培养，可产生增殖分化，形成丛芽。原球茎诱导的最适培养基为1/2MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L,增殖倍数为2.71。以叶片为外植体，未获得组培苗。

6、《白芨无菌小苗一步成苗培养基优化》：为提高白芨组织培养效率，以白芨种子播种的无菌小苗为外植体，无菌小苗一步成苗的最佳培养基配方是1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+50g/L香蕉泥。

7、《白芨无菌播种快繁体系的建立》：通过试验筛选出白芨种子萌发、丛生芽增殖、壮苗生根3个阶段的最佳配方，建立起一套白芨无菌播种快繁体系。结果表明，白芨种子萌发的最佳培养基配方为MS+1.0mg/LNAA+8％土豆+2％蔗糖+0.6％琼脂；当添加NAA的浓度为0.5mg/L，6-BA的浓度为2.0mg/L时，白芨丛生芽增殖率达到最高；白芨壮苗生根的适宜培养基为MS+0.5mg/LIBA+0.5mg/L NAA+8％香蕉+2％蔗糖+0.6％琼脂+0.5g/L活性炭。

但，上述方法均存在工艺繁琐、繁殖效果不佳等缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法，采用本发明的方法可以快速简便地获得大量低成本的白芨组培种苗。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种紫花三叉白芨的种子组培快速繁殖方法，依次包括以下步骤：

1)、取材：

选用白芨植株上结的成熟蒴果内的种子；

具体为：选用生长健壮的白芨植株上结的果龄150天以上且未开裂的成熟蒴果内的种子；

2)、种子的诱导萌发与分化：

将种子接种(均匀接种)到种子萌发分化培养基上进行培养；

培养条件为：

每天14小时光照，光照强度30～40μmol m^-2·s^-1，温度为(25±1)℃；10小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行，直至种子萌发并分化形成有两片小叶的幼苗(无根幼苗)；

整个步骤2)的种子萌发分化培养时间约40～45天；

3)、生根壮苗：

将步骤2)所得的幼苗(无根幼苗)转接于生根壮苗培养基上进行培养；

培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmolm^-2s^-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；直至培养获得同时满足以下条件的小苗：高度≥4.0cm(一般为4.0～5.0cm高)、基部有直径≥0.4cm(一般约为0.4～0.5cm左右)的假鳞茎、长出长度≥3cm的根至少2条；

所述小苗为可出瓶种植种苗；

4)、移栽：

将步骤3)所得小苗进行移栽。

作为本发明的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法的改进，步骤2)中的种子萌发分化培养基为：MS+NAA0.95～1.05mg/L+蔗糖5～20g/L+琼脂5～8g/L+活性炭0.3～0.7g/L，pH为5.5～6。

该种子萌发分化培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基为基础，分别加入NAA、蔗糖、琼脂、活性炭均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的MS基本培养基中加入0.95～1.05mg的NAA、5～20g的蔗糖、5～8g的琼脂、0.3～0.7g的活性炭。

作为本发明的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法的进一步改进，步骤2)中的种子萌发分化培养基为：MS+NAA1.0mg/L+蔗糖10g/L+琼脂6g/L+活性炭0.5g/L，pH为5.8。

作为本发明的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法的进一步改进，步骤3)中的生根壮苗培养基为MS+6-BA0.3～0.7mg/L+NAA0.3～0.7mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂5～8g/L+活性炭0.3～0.7g/L，pH为5.5～6。

作为本发明的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法的进一步改进，步骤3)中的生根壮苗培养基为：MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+活性炭0.5g/L，pH为5.8。

作为本发明的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法的进一步改进，步骤4)为：

首先将所得可出瓶种植的种苗同培养容器转移至遮阴大棚(拟驯化移栽的遮阴大棚)中炼苗5～7天；

然后打开瓶盖，在生根壮苗培养基表面浇水，令生根壮苗培养基含水量为10±1％(体积％)，于遮阴大棚中放置2～3天后，将种苗基部的生根壮苗培养基(特指该生根壮苗培养基内的琼脂)洗净，浸入0.5％(质量％)的多菌灵水溶液中1小时，晾干至根系发白；

最后将种苗移栽于混合基质中，于遮阴大棚中进行培养；

所述遮阴大棚的透光率为(60±5)％，遮阴大棚内温度为20～28℃，相对湿度为80±5％；

所述混合基质为椰糠、育苗基质和珍珠岩按照1:1:1的体积比混合获得。

作为本发明的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法的进一步改进，步骤1)为：成熟蒴果经清洗、消毒(为常规的清洗、消毒)后，切除其首尾两端各0.3～0.7cm后纵向剖开，取出种子。

在本发明中：MS为MS培养基，NAA为萘乙酸，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤。

本发明与现有技术相比，具有如下技术优势：

1、相对于现有技术的种子萌发、分化过程的分开进行，在本发明中，种子萌发和分化在同一种培养基上进行，相对节省人力物力；且本发明的萌发分化培养基中激素种类单一，不需要添加外源有机物，蔗糖浓度低，培养基制备简单，可有效降低组培苗生产成本。

本发明中，种子萌发分化形成小苗，省略了常规的丛生芽增殖过程。

2、目前现有的生根壮苗培养大多都是在幼苗增殖基础上进行的，幼苗在增殖过程中同时生长，转入生根壮苗培养基中的幼苗需要2-3cm的高度。而本发明中，种子萌发并分化形成有两片小叶的幼苗(无根幼苗)时；该幼苗的高度仅仅约为0.5cm，就可直接转入生根壮苗培养基中进行培养，生根和生长过程同时进行，无须再转接，一步成苗，且生根壮苗培养基中未添加有机添加物。

3、本发明利用白芨种子进行种苗生产，播种后，只需要转接一次，繁殖速度快，操作简单简便，节省人力、物力，便于工厂化生产。

4、减少了培养基的种类：种子萌发、分化过程采用同一种培养基。

综上所述，本发明的紫花三叉白芨种子组培快速繁殖法，白芨种子量大，培养基制作简便，组培苗生产成本低，可以在相对较短周期内生产大量遗传背景相同、长势一致的优质种苗(种子)，而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗，尤其适用于白芨工厂化育苗。使用本发明同时可以有效地保护白芨这一珍稀野生植物资源、减少私挖滥采、形成可持续利用和合理开发相互协调的良性循环。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是人工授粉所结的白芨蒴果；

图2是实施例1中种子萌发分化形成的幼苗；

图3是实施例1中于生根壮苗培养基中培养的拟移栽的幼苗(生根壮苗培养基为MS+NAA0.4mg/L+6-BA0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+0.5g/L活性炭，pH为5.8)；

图4是对比例3、对比例4、实施例1以及对比例5于不同蔗糖浓度的生根壮苗培养基上培养的幼苗对比图；

图5是实施例1中正在育苗盘中驯化的种苗；

图6是实施例1中移栽后生长一个月的种苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、一种紫花三叉白芨的种子组培快速繁殖方法，依次进行以下步骤：

1)、取材：

取生长健壮的白芨植株上人工授粉所结的成熟蒴果(果龄150天以上，且未开裂)，如图1所示，将其置于1％(体积％)洗洁精溶液中摇洗10min，再取出蒴果用自来水冲洗干净(直至无洗洁精残留)，沥干(不再滴水为止)备用。

将上述洗净、沥干的蒴果经常规消毒(即先用75％酒精浸泡处理2min，无菌水冲洗后，用0.1％升汞溶液灭菌10min，无菌水冲洗3～5次后，用无菌滤纸吸干水分)后，切除首尾两端各0.5cm后纵向剖开，取出种子。

2)、种子的诱导萌发与分化：

将种子均匀接种到种子萌发分化培养基上培养。

培养条件为：每天14小时光照，光照强度30～40μmol m^-2·s^-1，温度为(25±1)℃；10小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行。

种子萌发分化培养基为：MS+NAA1.0mg/L+蔗糖10g/L+琼脂6g/L+活性炭0.5g/L，pH为5.8。

约10天左右，种子萌发变绿形成原球茎。约20天左右，该原球茎于同一种子萌发分化培养基中再分化形成幼苗；种子萌发分化率高达99％，分化速度快且幼苗整齐(如图2所示)；

继续培养，直至形成具有两片小叶的幼苗(无根幼苗)；此时无根幼苗的高度约为0.5cm。

整个步骤2)的种子萌发分化培养时间约40～45天。

3)、生根壮苗：

将步骤2)所得的幼苗(无根幼苗)转接于生根壮苗培养基上进行培养；

培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m^-2·s^-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；

生根壮苗培养基为：MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+活性炭0.5g/L，pH为5.8。

约10天小苗开始生根，生根率为100％；约40天后幼苗基部开始膨大，形成假鳞茎；

继续培养，直至培养获得同时满足以下条件的小苗：高度约为4.0～5.0cm、基部有直径约为0.5cm左右的假鳞茎、有短根2-3条，根的长度约为3-4cm；如图5所示；苗粗壮，该小苗为可出瓶种植的种苗；

整个步骤3)的培养时间约90～100天。

本发明白芨从无菌播种到成苗可移栽约需要130～145天。

4)、移栽：

将步骤3)所得的小苗(种苗)进行移栽，具体依次进行如下步骤：

首先将所得可出瓶种植的种苗同培养容器转移至拟驯化移栽的遮阴大棚中炼苗5～7天，温度为20～28℃；

然后打开瓶盖，在生根壮苗培养基表面浇一层水(令生根壮苗培养基含水量为10％，体积％)，于遮阴大棚中(温度为20～28℃)放置2～3天后，将种苗基部的生根壮苗培养基(特指该生根壮苗培养基内的琼脂)洗净；再将种苗基部浸入浓度为0.5％的多菌灵水溶液中浸泡1小时，然后晾干至根系发白；

再将种苗移栽于椰糠：育苗基质：珍珠岩＝1:1:1(体积比)的混合基质中，于遮阴大棚中进行培养，培养温度为20～28℃。育苗基质为常规的育苗基质，例如可选用泥炭。

在整个移栽过程中，控制遮阴大棚内相对湿度保持80％左右，透光率为60％。

移栽后生长一个月的种苗如图6所示，其移栽成活率可达95％以上。

实施例2、将实施例1步骤2)的种子萌发分化培养基中的蔗糖浓度由“10g/L”改为“20g/L”，其余等同于实施例1。

步骤2)培养约40～45天，得到可以进行生根壮苗的小苗-----具有两片小叶的无根幼苗，种子萌发率可达98％。

实施例3、将实施例1步骤2)的种子萌发分化培养基中的蔗糖浓度由“10g/L”改为“30g/L”(培养基中蔗糖常用浓度)，其余等同于实施例1。

步骤2)培养约40～45天，得到可以进行生根壮苗的小苗-----具有两片小叶的无根幼苗，种子萌发率可达98％。

根据上述实施例1～实施例3的对比，可得知：在本发明中，较低浓度(10g/L)的蔗糖已经足够满足种子萌发需要。

实施例4、将实施例1步骤3)生根壮苗培养基中的6-BA浓度由“0.4mg/L”改为“0.45mg/L”，其余等同于实施例1。

步骤3)的培养结果为：约10天左右小苗开始生根，生根率为100％。约40天后幼苗基部开始膨大形成假鳞茎。

90-100天后获得可出瓶种植的苗，苗粗壮，苗高4-5cm，基部有直径0.5cm左右大小的假鳞茎，有短根2-3条，根的长度约为3-4cm。

对比例1、将实施例1步骤2)中的种子萌发分化培养基的基本培养基由“MS”更改为“1/2MS”，即，种子萌发分化培养基为：1/2MS+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+0.5g/L活性炭，pH为5.8，其余等同于实施例1。

种子萌发分化结果为：种子萌发分化率只有75％，且分化形成具有两片小叶的无根幼苗后生长缓慢，幼苗基部多毛。

对比例2、将实施例1步骤2)中的种子萌发分化培养基中蔗糖浓度由10g/L改为不添加蔗糖(即，蔗糖浓度为0)，其余等同于实施例1。

种子萌发分化结果为：种子可正常萌发分化，但是分化形成的幼苗发育迟缓，后期停止生长；无法实现有效繁殖。

对比例3、将实施例1步骤3)中的生根壮苗培养基中蔗糖浓度改为由30g/L改为10g/L，其余等同于实施例1。

如图3，生根壮苗结果为：幼苗生长速度明显缓慢，培养3.5个月后，幼苗只有1～2cm高，生长缓慢。

对比例4、将实施例1步骤3)中的生根壮苗培养基中蔗糖浓度改为由30g/L改为20g/L，其余等同于实施例1。

如图3，生根壮苗结果为：幼苗生长速度明显缓慢，培养3.5个月后，幼苗只有2-3cm高，生长缓慢。

对比例5、将实施例1步骤3)中的生根壮苗培养基中蔗糖浓度改为由30g/L改为40g/L，其余等同于实施例1。

如图3，生根壮苗结果为：幼苗生长速度明显缓慢，培养3.5个月后，幼苗只有2-3cm高，生长缓慢。

对比例6、将实施例1步骤3)中的生根壮苗培养基中的“6-BA0.4mg/L+NAA0.4mg/L”改成“6-BA0.7mg/L+NAA0.7mg/L”，其余等同于实施例1。该方式下的幼苗生长速度不及实施例1；培养3.5个月后，也不能达到4.0cm。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.紫花三叉白芨的种子组培快速繁殖方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、取材：

选用白芨植株上结的成熟蒴果内的种子；

2)、种子的诱导萌发与分化：

将种子接种到种子萌发分化培养基上进行培养；

培养条件为：

每天14小时光照，光照强度30～40μmol m^-2·s^-1，温度为(25±1)℃；10小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行，直至种子萌发并分化形成有两片小叶的幼苗；

3)、生根壮苗：

将步骤2)所得的幼苗转接于生根壮苗培养基上进行培养；

培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmolm^-2s^-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；直至培养获得同时满足以下条件的小苗：高度≥4.0cm、基部有直径≥0.4cm的假鳞茎、长出长度≥3cm的根至少2条；

所述小苗为可出瓶种植种苗；

4)、移栽：

将步骤3)所得小苗进行移栽。

2.根据权利要求1所述的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法，其特征是所述步骤2)中的种子萌发分化培养基为：MS+NAA0.95～1.05mg/L+蔗糖5～20g/L+琼脂5～8g/L+活性炭0.3～0.7g/L，pH为5.5～6。

3.根据权利要求2所述的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法，其特征是所述步骤2)中的种子萌发分化培养基为：MS+NAA1.0 mg/L+蔗糖10g/L+琼脂6g/L+活性炭0.5g/L，pH为5.8。

4.根据权利要求1～3任一所述的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法，其特征是：步骤3)中的生根壮苗培养基为MS+6-BA0.3～0.7mg/L+NAA0.3～0.7mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂5～8g/L+活性炭0.3～0.7g/L，pH为5.5～6。

5.根据权利要求4所述的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法，其特征是：步骤3)中的生根壮苗培养基为：MS+6-BA0.4mg/L+NAA0.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+活性炭0.5g/L，pH为5.8。

6.根据权利要求1～5任一所述的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法，其特征是：所述步骤4)为：

首先将所得可出瓶种植的种苗同培养容器转移至遮阴大棚中炼苗5～7天；

然后打开瓶盖，在生根壮苗培养基表面浇水，令生根壮苗培养基含水量为(10±1)％，于遮阴大棚中放置2～3天后，将种苗基部的生根壮苗培养基洗净，浸入0.5％的多菌灵水溶液中1小时，晾干至根系发白；

最后将种苗移栽于混合基质中，于遮阴大棚中进行培养；

所述遮阴大棚的透光率为(60±5)％，遮阴大棚内温度为20～28℃，相对湿度为80±5％；

所述混合基质为椰糠、育苗基质和珍珠岩按照1:1:1的体积比混合获得。

7.根据权利要求6所述的紫花三叉白芨的组培快速繁殖方法，其特征是：所述步骤1)为：成熟蒴果经清洗、消毒后，切除其首尾两端各0.3～0.7cm后纵向剖开，取出种子。