CN112243861A - 一种华盖木组培快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种华盖木组培快繁方法，属于植物组培技术领域。本发明以消毒的华盖木幼嫩的顶芽或侧芽为外植体，通过在特定的培养基上依次诱导、分化、增殖与生根一系列培养，成功繁殖华盖木完整植株，有效解决了华盖木组培快繁、引种驯化、保护及其科研、园林绿化上的开发利用问题，同时有效避免野生资源自然消失与灭亡，维持自然界中种群数量，在华盖木的迁地保护、近地保护和就地保护所需种苗方面具有积极作用。本方法诱导分化率58％，繁殖周期60天，增殖系数为3.6，生根率为81％，移栽成活率为86％以上，极大地提高了华盖木的繁殖数量与生长速率，为该物种的保护与繁育、引种驯化、保存和规模化生产供了技术支撑。

Description

一种华盖木组培快繁方法
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种华盖木组培快繁方法。
背景技术
华盖木(Manglietiastrum sinicum)隶属于木兰科华盖木属，常绿大乔木，高可达40米左右，胸径1.2米，是中国云南特有种，起源于1.4亿年前，是木兰科中最古老的单属种植物之一，因其树干挺直光滑，树冠巨大而得名。华盖木是地质时代第三、四纪遗留下来的古老孑遗树种，1999年被列为国家一级重点保护野生植物，被世界自然保护联盟(IUCN)全球红色名录列为极度濒危物种。是典型的极小种群野生植物。最早发现于云南省西畴县法斗乡，生于海拔1300～1500米的山沟常绿阔叶林中。由于分布范围狭窄，且数量稀少而被称为“植物中的大熊猫”。经过反复多次野外调查，目前仅存47株大树，华盖木结果量少，种子量不多，并存在结果大小年的情况，自然繁殖和更新都较为困难。
迄今为止，现有技术没有关于华盖木组培快繁和相关的生物技术方面的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种华盖木组培快繁方法，填补华盖木生物技术上的空白，同时解决华盖木在野外分布区域狭窄、种群数量稀少、种子苗量不足的问题。
本发明提供了一种华盖木组培快繁的方法，包括以下步骤：
1)将消毒的华盖木幼嫩的顶芽或侧芽作为外植体接种至诱导与分化培养基中诱导分化培养，得到萌发的节芽；
所述诱导与分化培养基为包含0.5～3.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；
2)将所述萌发的节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖继代材料；所述增殖与继代培养基为包含0～2.0mg/L 6-BA、0.1～1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；3)将所述增殖继代材料接种至壮苗与生根培养中培养，得到壮苗生根材料；所述壮苗与生根培养基为包含0.1～2.0mg/L IBA、0.1～2.0mg/LIAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；
4)将所述壮苗生根材料进行瓶苗移栽，得到华盖木植株。
优选的，所述诱导与分化培养基为包含2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。
优选的，所述增殖与继代培养基为包含1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。
优选的，所述壮苗与生根培养基为包含1.0mg/L IBA、1.0mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。
优选的，所述诱导分化培养、增殖继代培养或壮苗生根培养的条件如下：温度为23～30℃；培养周期为30～60d；
在培养期间进行光照；光暗周期比为10:14；所述光照的强度为1300～1800Lux。
优选的，步骤1)中所述消毒前先用洗涤液浸泡，经流水冲洗干净后进行外植体消毒；
所述消毒的方法是将所述外植体剪成长度1～1.5cm的带节小茎段，用体积浓度75％的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗3～4次后，再用质量浓度0.1％升汞溶液浸泡10min，无菌水清洗3～5次。
优选的，在所述瓶苗移栽前，包括是将壮苗生根材料提前一周置于大棚中炼苗。
优选的，移栽基质预先用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH至5.8。
优选的，所述大棚的温度为20～30℃，空气湿度为80％～85％，土壤湿度为40％～50％。
优选的，所述瓶苗移栽的基质为珍珠岩、腐殖土和生红土的混合物；
在所述混合物中，所述珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比为1：1：2。
本发明为解决其自然资源少，短时间内达到大量繁殖、保存和持续利用，填补华盖木在生物技术上的研究空白，提供一种华盖木组培快繁方法，将诱导与分化培养基合二为一，增殖与继代培养基合二为一，壮苗与生根培养基合二为一，培养方法简化，成苗容易，繁殖步骤简化，有效繁殖速率高，为保存和扩大华盖木种群，意义重大；同时通过华盖木组培快繁方法，高度保持了华盖木的遗传稳定性和一致性，为华盖木全面的开发和持续利用奠定了基础；此外利用特定的培养基和培养条件繁育的华盖木，60天诱导分化率58％，在60天内增殖系数为3.6以，生根率为81％以上，移栽成活率为86％以上，极大地提高了华盖木的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存、园林园艺及其科研价值的发挥利用提供了非常有效的繁殖方法。
附图说明
图1为本发明华盖木开花情况；
图2为本发明华盖木诱导培养情况；
图3为本发明华盖木繁殖培养情况；
图4为华盖木生根情况；
图5为华盖木生根苗情况。
具体实施方式
本发明提供了一种华盖木组培快繁的方法，包括以下步骤：
1)将消毒的华盖木幼嫩的顶芽或侧芽作为外植体接种至诱导与分化培养基中诱导分化培养，得到萌发的节芽；
所述诱导与分化培养基为包含0.5～3.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；
2)将所述萌发的节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖继代材料；所述增殖与继代培养基为包含0～2.0mg/L 6-BA、0.1～1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；3)将所述增殖继代材料接种至壮苗与生根培养中培养，得到壮苗生根材料；所述壮苗与生根培养基为包含0.1～2.0mg/L IBA、0.1～2.0mg/LIAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；4)将所述壮苗生根材料进行瓶苗移栽，得到华盖木植株。
本发明将消毒的华盖木幼嫩的顶芽或侧芽作为外植体接种至诱导与分化培养基中诱导分化培养，得到萌发的节芽；所述诱导与分化培养基为包含0.5～3.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8。
在本发明中，所述消毒的方法是将所述外植体剪成长度1～1.5cm的带节小茎段，用体积浓度75％的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗3～4次后，再用质量浓度0.1％升汞溶液浸泡10min，无菌水清洗3～5次。所述消毒前先用洗涤液浸泡，经流水冲洗干净后进行外植体消毒。本发明对所述洗涤液的种类不做特殊限制，采用本领域所熟知的洗涤液即可，例如肥皂水溶液、或洗洁精溶液等。
在本发明中，所述诱导与分化培养基优选为包含1.0～2.0mg/L 6-BA、1.0mg/LIAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，更优选为包含2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。所述诱导分化培养的条件优选如下：温度为23～30℃，更优选为25～28℃，最优选为25℃；培养周期为58～62d，更优选为60d；在培养期间进行光照；光暗周期比为10:14；所述光照的强度为1300～1800Lux，更优选为1500Lux。本发明以顶芽或侧芽为材料进行诱导分化培养，在所述诱导与分化培养基上培养后，诱导一周后，顶芽或侧芽开始萌发，经过一个培养周期得到萌发的节芽。实验证明，与采用其他种类和含量的生长调节剂制备的培养基相比，所述诱导与分化培养基诱导分化培养效果具有显著优势，诱导率达58％以上。所述接种优选将一个带节小茎段接种至一个培养瓶中。
得到萌发的节芽后，本发明将所述萌发的节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖继代材料；所述增殖与继代培养基为包含0～2.0mg/L 6-BA、0.1～1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；
在本发明中，所述增殖与继代培养基优选为包含0.5～2.0mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，更优选为包含1.0mg/L 6-BA、0.5mg/LIAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。所述增殖继代培养的条件优选如下：温度为23～30℃，更优选为24～28℃，最优选为25℃；培养周期为58～62d，更优选为60d。在培养期间进行光照；光暗周期比为10:14；所述光照的强度为1300～1800Lux，更优选为1500Lux。实验表明，与其他浓度的细胞分裂素和生长素制备的培养基相比，在所述增殖与继代培养基上增殖继代培养，生长速度最快，植株叶片伸展，培养60天后株高4.7cm，增殖系数为3.6，显著高于其他组。
得到增殖继代材料后，本发明将所述增殖继代材料接种至壮苗与生根培养中培养，得到壮苗生根材料；所述壮苗与生根培养基为包含0.1～2.0mg/L IBA、0.1～2.0mg/LIAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8。
在本发明中，所述壮苗与生根培养基优选为包含1.0mg/L IBA、1.0mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。所述壮苗生根培养的条件的条件优选如下：温度为23～30℃，更优选为24～28℃，最优选为25℃；培养周期为28～32d，更优选为30d。在培养期间进行光照；光暗周期比为10:14；所述光照的强度为1300～1800Lux，更优选为1500Lux。实验表明，与其他浓度IBA和IAA相比，经所述壮苗与生根培养基进行壮苗生根30天，具有显著优势，生根率达81％。
得到壮苗生根材料后，本发明将所述壮苗生根材料进行瓶苗移栽，得到华盖木植株。
在本发明中，在所述瓶苗移栽前，优选包括是将壮苗生根材料提前一周置于大棚中炼苗。移栽基质优选预先用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH至5.8。所述大棚的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；空气湿度优选为80％～85％，更优选85％；土壤湿度优选为40％～50％，更优选50％。
在本发明中，所述瓶苗移栽的基质优选为珍珠岩、腐殖土和生红土的混合物；在所述混合物中，所述珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比为1：1：2。30天后移栽成活率达到86％。
本发明提供的一种华盖木组培快繁的方法，有效解决了华盖木组培快繁、引种驯化、保护及其科研、园林绿化上的开发利用问题，同时有效避免野生资源自然消失与灭亡，维持自然界中种群数量，在华盖木的迁地保护、近地保护和就地保护所需种苗方面具有积极作用。
下面结合实施例对本发明提供的一种华盖木组培快繁方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
诱导分化培养基筛选方法
取华盖木的幼嫩顶芽和侧芽为外植体，用1％肥皂水浸泡10分钟，经流水冲洗干净后，拿到超净台上，剪成带单个节的茎段，用75％的酒精消毒10s，无菌水冲洗3遍后，用0.1％升汞溶液进行表面消毒10min，无菌水清洗3～5次，接种于准备好的华盖木诱导培养基中，每瓶1个节。
将消毒处理后的茎段分别接种在MS+3.0mg/l 6-BA+1.0mg/L IAA，MS+2.5mg/l 6-BA+1.0mg/L IAA，MS+2.0mg/l 6-BA+1.0mg/L IAA，MS+1.0mg/l 6-BA+1.0mg/L IAA，MS+0.5mg/l 6-BA+1.0mg/L IAA培养基上进行诱导分化培养，所述MS培养基还包括蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH值5.8。培养的温度为23～30℃，培养期间人工辅助光照，光照时间10小时，光强度为1500Lux。统计诱导率情况如下表1。
表1华盖木茎段诱导培养基筛选
Figure BDA0002745018850000061
对华盖木茎段诱导培养基进行筛选，结果表明，在MS+2.0mg/l 6-BA+1.0mg/L IAA培养基上，诱导率达到58％。
实施例2
增殖与继代培养基筛选方法
以MS培养基为增殖与继代激素筛选的基本培养基，细胞分裂素均为6-BA，浓度范围为(0mg/L，0.1mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，2mg/L，6个浓度梯度)，生长素均为IAA，浓度分别为(0.1mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，3个浓度梯度)，采用均匀设计法进行。培养温度为23～30℃，光照时间10小时，光强度为1500Lux。
结果见表2。
表2增殖与继代培养基激素筛选
Figure BDA0002745018850000071
由表2可知，MS培养基+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，培养周期60天，光强度为1500Lux，温度为23～30℃。统计每个繁殖体产生的侧芽和顶芽数量，芽节数量(包含顶芽)的平均值为3.6，植株叶片伸展，生长速度最快，株高4.7cm。
实施例3
壮苗生根培养基筛选方法
以MS培养基为壮苗与生根培养基激素筛选的基本培养基，IBA浓度范围为0.1mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，2mg/L 4个浓度梯度，IAA浓度分别为0.1mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L 4个浓度梯度，采用均匀设计法进行。培养温度为23～30℃，光照时间10小时，光强度为1500Lux。
结果见表3。
表3生根培养基激素筛选结果
Figure BDA0002745018850000072
由表3可知，MS培养基+1.0mg/L IAA+1.0mg/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，培养周期30天，生根率达81％。
实施例4
移栽基质的筛选方法
以珍珠岩、腐殖土、生红土及其结合作为移栽基质分别对实施例3制备的华盖木瓶苗的移栽，大棚温度为24℃，遮光度在80％，空气湿度82.5±2.5％，基质湿度45±5％。
表4栽培基质的筛选实验结果
Figure BDA0002745018850000081
实验④中三种基质配合，增加了基质疏松度和根部透气性，也为根部提供足够的营养，同时红土为土层深部土壤，带菌量较少，有利于无菌苗的生长。移栽30天后移栽成活率达到86％。
实施例5
一种华盖木组培快繁的方法
取华盖木2～3年生苗幼嫩顶芽为外植体，用1％肥皂水浸泡10分钟，经流水冲洗干净后，拿到超净台上，去叶，剪成1cm大小的带节小茎段，用75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3遍后，再用0.1％升汞溶液消毒10min，无菌水清洗5次，得到消毒后的带节小茎段。
将消毒后的带节小茎段接种于准备好的诱导与分化培养基中进行诱导分化培养，每瓶插1个节芽；诱导与分化培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，每天光照10小时，光照强度为1500Lux，温度为25℃，诱导一周后，顶芽或侧芽开始萌发，诱导60d，得到萌发的芽节，诱导率58％(见图2)；
将萌发的芽节接种至增殖与继代培养基上进行增殖继代培养，增殖与继代培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，温度为25℃，每天光照10小时，光强度为1500Lux，培养60天，得到增殖继代材料，植株高度达4.7cm，增殖系数为3.6(见图3)。
将制备的增殖继代单芽材料接种至壮苗与生根培养基上进行壮苗生根培养，壮苗与生根培养基为MS+1.0mg/L IBA+1.0mg/L IAA+蔗糖30g/L+琼脂5g/L，pH值5.8，培养期间每天光照10h，光照强度为1500Lux，温度为25℃，培养周期30天，得到华盖木生根瓶苗(见图4和图5)，生根率达81％。
将培养30天后的华盖木生根瓶苗先移至遮光率为80％大棚炼苗一周，基质为珍珠岩：腐殖土：生红土为1：1：2(体积比)的混合物，用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH至5.8，开瓶轻轻取出种苗，洗净根部的培养基，移栽至消毒过的基质中，及时喷水并覆盖塑料膜保湿，大棚温度为25℃，遮光度在80％，空气湿度82.5±2.5％，基质湿度45±5％。经统计移栽30天后，华盖木植株成活率为86％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种华盖木组培快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将消毒的华盖木幼嫩的顶芽或侧芽作为外植体接种至诱导与分化培养基中诱导分化培养，得到萌发的节芽；
所述诱导与分化培养基为包含0.5～3.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；
2)将所述萌发的节芽接种至增殖与继代培养基中增殖继代培养，得到增殖继代材料；所述增殖与继代培养基为包含0～2.0mg/L 6-BA、0.1～1.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；
3)将所述增殖继代材料接种至壮苗与生根培养中培养，得到壮苗生根材料；所述壮苗与生根培养基为包含0.1～2.0mg/L IBA、0.1～2.0mg/L IAA、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；
4)将所述壮苗生根材料进行瓶苗移栽，得到华盖木植株。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导与分化培养基为包含2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述增殖与继代培养基为包含1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述壮苗与生根培养基为包含1.0mg/L IBA、1.0mg/L IAA、蔗糖30g/L和琼脂5g/L的MS培养基，pH值为5.8。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导分化培养、增殖继代培养或壮苗生根培养的条件如下：温度为23～30℃；培养周期为30～60d；
在培养期间进行光照；光暗周期比为10:14；所述光照的强度为1300～1800Lux。
6.根据权利要求1～5任意一项所述方法，其特征在于，步骤1)中所述消毒前先用洗涤液浸泡，经流水冲洗干净后进行外植体消毒；
所述消毒的方法是将所述外植体剪成长度1～1.5cm的带节小茎段，用体积浓度75％的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗3～4次后，再用质量浓度0.1％升汞溶液浸泡10min，无菌水清洗3～5次。
7.根据权利要求1～5任意一项所述方法，其特征在于，在所述瓶苗移栽前，包括是将壮苗生根材料提前一周置于大棚中炼苗。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，移栽基质预先用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节pH至5.8。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述大棚的温度为20～30℃，空气湿度为80％～85％，基质湿度为40％～50％。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，所述移栽基质为珍珠岩、腐殖土和生红土的混合物；
在所述混合物中，所述珍珠岩、腐殖土和生红土的体积比为1：1：2。
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