CN101560534A - 一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法，包括：依次经外植体的灭菌和灭菌程序及接种，愈伤组织的继代增殖，液体悬浮培养，20L容器鼓泡式通气悬浮培养以及紫杉醇合成调控程序。本发明利用不同种红豆杉细胞系进行组合培养的效果，通过四个综合调控程序，使红豆杉细胞培养合成紫杉醇的含量水平，能稳定在万分之3－4以上，其实际使用容量达到20L/单个体，培养物的紫杉醇含量达0.3－0.5mg/g·DW，固液比15－18％(W/V)，“比生物生长速率”7.2－8.4mg/g·d，生产周期20－25d/周，且操作步骤简单，成本低，适合于工业化大规模生产。

Description

一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法

技术领域

本发明属植物细胞工程紫杉醇的制备领域，特别是涉及一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法。

背景技术

20世纪70年代初，首次发现并提取到了新型抗癌药紫杉醇，此药源于生长在美国西海岸的一种红豆杉种，太平洋紫杉的枝叶、树皮中经临床试用后，发现对人类8种癌症的总治愈率达到35-38％，被誉为人类肿瘤病人的最后一道防线。但是紫杉醇在植物体内含量很低，仅万分之一至三左右，据此推测，治愈一位患者需砍掉27株，生长50年以上的红豆杉树。而红豆杉是地球第四期冰河期的孑遗植物，全球仅有零星分布，加上自然生长缓慢，用原生植株树皮为提取原料，显然会灭绝资源。人工合成的步骤多达30多道过程，得率极低，没有商业价值。90年代中期，试图用人工接种繁殖，人工种植企求解决原料来源，经10多年的实践，存在生长周期长(5年)，占地面积广(千亩以上)，就是连根拨起，其总量有限，只能满足百公斤晶品提取设备半个月的开工率。

法国公司用人工一次合成方法，利用紫杉醇两种前体物合成多烯紫杉烷药，效更好，价格也降至640元一克。但是这两种前体物也是通过榛的叶子中提取，其含量也仅万分之一左右。

应用现代生物技术进行大规模细胞培养被公认为颇有前途的方法。人们广泛地进行了探索、研究。经过10年以上的探索，由于种种的原因，迄今为止，全世界没有一家能研发成具工业化生产前景的规模或成功工艺。这方面的专利发明也不少；究其原因，要么是容器太小(升左右)，要么细胞系遗传稳定性差，不能连续使用，要么污染关存在缺陷；或是调控程序重复性差，有效成分含量低或不稳定损失利用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法，该方法利用不同种红豆杉细胞系进行组合培养的效果，通过四个综合调控程序，使红豆杉细胞培养合成紫杉醇的含量水平，能稳定在万分之3-4以上，其实际使用容量达到20L/单个体，培养物的紫杉醇含量达0.3-0.5mg/g·DW，固液比15-18％(W/V)，“比生物生长速率”7.2-8.4mg/g·d，生产周期20-25d/周，且操作步骤简单，成本低，适合于工业化大规模生产。

本发明的一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法，包括：

(1)外植体的灭菌和灭菌程序及接种

将红豆杉外植体用洗洁精与自来水混合液清洗，再用自来水冲洗直至无泡沫为止；然后将其灭菌，截取1～1.5cm叶柄，接种到诱导培养基上，移到24℃±1℃暗培养中，1～2天后取出未污染切断，35-45天后检查愈伤组织生长情况；

(2)愈伤组织的继代增殖

待上述愈伤组织长到黄豆大小时，将其从外植体上剥离下来，转移到上述诱导培养基，继续在24～26℃黑暗培养条件下增殖，每40天继代一次，经4-5次继代后得成熟愈伤组织；

(3)进入液体悬浮培养

将上述成熟愈伤组织接种到液体悬浮E培养基中进行悬浮培养，每7天继代一次，经2-3个月的继代培养至生长速率达5.7～8.4mg/g·d时，按接种率不小于7-10％，于24℃±1℃，自然室内光进行二级培养10--15天；

(4)进容器鼓泡式通气悬浮培养

按7-10％W/V的接种率接种到容器中，进行通气培养，经10-12天通气培养，其固液比达到15-18％；

(5)紫杉醇合成调控程序

第一调控程序：改变E培养基中的激素种类，把E培养基改为Eq即：B5+有机常规+细胞分裂素BA2mg/L+α-萘乙酸NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+麦芽糖15g/L，PH5.8；

第二调控程序：培养温度从24℃±1℃升高到27℃-30℃；

第三调控程序：紫杉醇培养容器中加入附加物：

KH2PO4      300mg/L

异亮氨酸    4mg/L

马尿酸      5mg/L

乙酸钠      140mg/L

柠檬酸铵    5mg/L

苯丙氨酸    33mg/L

Cud2·2h2o  2mg/L

麦芽糖      25mg/L；

第四调控程序：细胞组合培养：含量显示：mg/g·DW

步骤(1)中所述的红豆杉种为Media红豆杉、中国南方红豆杉Taxus mairei(Lemeeet Levl.)、粗榧Cephalotaxus sinensis(Rehd.et.Wiis)、东北红豆杉Taxus cuspidate Sieb.et Zucc.或云南红豆杉；

步骤(1)中所述的灭菌程序为50％乙醇浸润3-5秒→20％“84”液中7-8分钟→0.1％升汞液中12-15分钟→灭菌水冲洗几遍后，吸干水分；

步骤(1)和(2)中所述的诱导培养基为MS全量+有机常规+2，4-二氯苯氧乙酸2.4-D1.5-2.5mg/L+α-萘乙酸NAA0.5mg/L+蔗糖30-40g/L+琼脂粉5g/L，常规灭菌，灭菌前PH调到5.8；

步骤(3)中所述的液体悬浮E培养基为B5+有机常规+2，4-二氯苯氧乙酸2.4-D2mg/L+α-萘乙酸NAA 0.5-1mg/L+6-糠氨基嘌呤KT 1-1.5mg/L+腺嘌吟15mg/L+水解酪蛋白CH500mg/L+蔗糖40g/L，PH5.8。

本发明的生产紫杉醇的细胞培养组合；细胞正常增殖；紫杉醇调控程序；产业化容器装置(20升为单位，无限叠加成规模生产)，其污染影响控制在能连续生产范围之内。细胞系遗传稳定性保持2-3年，这已远远满足细胞更新系的培育时间。“比生物生长速率”7.2-8.4mg/g·d；远远超过5.7mg/g·d的起码要求。固液比达到15-18％；紫杉醇含量稳定在万分之五；(国内所有红豆杉树种中树皮内含量仅万分之一至三)，全生产周期为19天，单个容器年周转15-18次。据估算一个20m²房间内装载的容器生产的原来相当于860多亩地上生长了五年原料总量，加工提取率细胞高于树皮，效率更为明显。

众所周知，高等植物细胞具有“两个全能型”，即：植物细胞具有分化成完整植株的全能型和合成原生植株药用有效成分的全能型。不同遗传型(物种)合成不同成分的药用有效成分。迄今所有人工合成的各类药物成分几乎都能从不同的植物中找到完全相同的结构，且没有化学合成时的残留物(药用成分较为纯净)。

高等植物细胞通过遗传基因---一个基因产生一种蛋白质，而植物细胞生物酶(蛋白质的一种)能够在常温、常压条件下通过细胞生长增殖的代谢过程中产生生物代谢产物。紫杉醇是在红豆杉科、太平洋紫杉的树皮中被发现的，人们用人工合成方法生产这种化合物，但合成步骤有30多道，得率很低，投入的成本几十倍于产品，没有商业价值。

本发明基于上述原理，通过不同遗传型的红豆杉细胞、不同的附加成分及培养条件，目的就是增加、激活紫杉醇合成过程中的各种酶的含量和提高酶活性(效价)，这也是该发明具有实用价值所在，最终提高目的物-紫杉醇的含量，使其在不消耗自然资源、不占用大量土地、零排污的生物产业工程。

有益效果

本发明利用不同种红豆杉细胞系进行组合培养的效果，通过四个综合调控程序，使红豆杉细胞培养合成紫杉醇的含量水平，能稳定在万分之3-4以上，其实际使用容量达到20L/单个体，培养物的紫杉醇含量达0.3-0.5mg/g·DW，固液比15-18％(W/V)，“比生物生长速率”7.2-8.4mg/g·d，生产周期20-25d/周，且操作步骤简单，成本低，适合于工业化大规模生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

(一)外植体的准备和选择：

1、选择生长健康，无病虫害的隔年枝条作为外植体材料来源；

2、选择以下几个红豆杉种：

Media红豆杉

中国南方红豆杉  (Taxus mairei(Lemee et Levl.))

粗榧            (Cephalotaxus sinensis(Rehd.et.Wiis))

东北红豆杉      (Taxus cuspidate Sieb.et Zucc.)

云南红豆杉；

(二)愈伤组织的诱导：

1、培养基的选择

“MS”全量+有机常规+2，4-二氯苯氧乙酸2.4-D1.5-2.5mg/L+HVAA0.5mg/L+蔗糖30-40g/L+琼脂粉5g/L常规灭菌，灭菌前PH5.8，每升培养基分装成15-18个150ml三角瓶，铝铂纸封口(空瓶带封口，预先在180℃，2小时干燥灭菌)；

2、外植体的灭菌和灭菌程序及接种

采来的外植体，先用自来水常规冲洗，然后到超净工作台上，进入灭菌操作：50％乙醇浸润3-5秒，移入20％“84”液中7-8分钟，然后浸入到0.1％升汞液中12-15分钟，材料老嫩决定灭菌时间长短。灭菌后的外植体用无菌水冲掉药液，放到渗水无菌纸上吸干多余水分，用单面刀片切成1公分长切段，切去叶片只留一点叶柄，每瓶3段，呈三角形摆放，互不交叉，注明标记后，移入暗培养中，保持23℃-25℃暗培养中，隔天后检查污染情况，救出未污染的，35-45天后，初始愈伤组织开始生长扩增；

3、愈伤组织固体继代培养

初始愈伤组织长到黄豆大小时，及时剥离外植体，并在新华一号滤纸架桥的诱导培养基上，每瓶5-7堆，堆大小以小指甲为宜，过大过小都不利生长。40天继代一次，每次继代时挑选颗粒状，分散性好，手感坚硬的颗粒，淘汰软绵绵水渍状的愈伤组织，我们称为胫性愈伤组织。经4-5次继代后，愈伤组织增殖足够多，并且同步性好时，才能进入液体培养；

4、进入液体悬浮培养

液体悬浮培养基为(E培养基)B5+有机常规2，4-二氯苯氧乙酸2.4-D2mg/L+NAA0.5-1mg/L+KT1-1.5mg/L+腺嘌吟15mg/L+CH500mg/L+蔗糖40g/L，PH5.8；

将上述继代后的成熟愈伤组织，每个150ml三角瓶接种至少2g鲜种的，颗粒状，分散度好愈伤组织，倒入75ml上述液体培E养基，放到每分钟80转的回转式摇床，自然室内光强度，24℃±1℃，每7天继代一次，经过2-3个月的继代培养后，定期地测定其生长速率，接种率，固液比，细胞得干率等几个主要的技术参数；

直至达到5.7～8.4mg/g·d生长速率时，扩到500ml三角瓶中增殖，装液量到200ml线处，按种率不小于7XW/V/瓶，24℃±1℃，自然室内光。

液体培养基相同激素水平的B5基础培养基(编为E)与MS基本成分培养对于紫杉醇合成后效应来讲，B5优于MS，故从液体培养一开始，就在B5上对细胞系进行训化。

为了防止污染造成损失，每隔1个月左右，把最好的液培细胞系，返回到B5固体培养基上保存，这是必须的。

5、“比生物生长速率”(以下简称“生长速率”)的测定和、产业化细胞系选择：

生长速率＝收获鲜重-接种量÷培养基重(V)÷培养天数

以达到5.7mg/g·d以上时才能认为具产业化培养要求；

接种率＝接种细胞鲜重÷培养基(V/W)＝％

接种率达到10％以下，7％以上时，认定为该细胞系基本合适于液培养；

得干率＝收获鲜细胞烘干后重量÷鲜重＝％

达到8-9.4％被认为该细胞系具胚性细胞系，达不到则对后续紫杉醇合成基本无用；

固液比＝收获鲜细胞÷加入培养基量(V/W)＝％

达到15-18％被认为细胞系基本适应现有培养条件。

6、在获取上述参数后的培养系扩增：

根据150ml三角瓶中的继代接种率扩大到500ml三角瓶容量水平上，重复前述技术参数实验，达到上述四种技术的细胞系被认为具有鼓泡式大容量(21L)培养潜力的细胞系，培养基选择E培养基。

7、鼓泡式容器接种培养：

按500ml三角瓶中选择达到符合四项技术参数细胞系，在摇床上扩增到足够数量后，按500ml三角瓶7-10％的接种率，接种到20L按500ml鼓泡式容器中，进行通气培养。空气过滤器孔径用0.45μ，直径25mm，每瓶进气口和排气口各装一个，接5瓦气泵，每个泵带4个20L容器，接种率7～10％W/V；其中，20L容器最大装液量16升，12升为上述E培养基，4升为上述二级培养后500ml母瓶中的条件培养基(培养物在培养基中经过一个周期的培养后的老培养基，其中在原培养基的基础上又增加了培养物的生物酶和生物代谢产物)，生长10-15天后，其固液比达到15～18％，即证明细胞系符合产业化生产的基本要求。

进入紫杉醇合成调控程序；

8、二段培养，一次接种，紫杉醇含量达万分之4-5，综合调控培养：

第一调控程序：当细胞系在通气培养10-12天时，通过加入相同基本培养基，而把激素种类配比，作如下调正，去掉原来的2.4-D生长素，增加2mg/L的细胞分裂素“BA”；

第二调控程序：把通气容器存放在室内温度提高到29℃；

第三调控程序：在原培养容器中(原20L容器)添加如下浓度的附加物：

KH2PO4      300mg/L

异亮氨酸    4mg/L

马尿酸          5mg/L

乙酸钠          140mg/L

柠檬酸铵        5mg/L

苯丙氨酸        33mg/L

Cud2·2h2o      2mg/L

麦芽糖          25mg/L

第四调控程序：

细胞组合选择：用不同红豆杉种的细胞系，按单列组合排列，组成最佳组合，筛选最佳细胞组合来合成紫杉醇，其最终效果是前三个调控程序效益的总和，其成本不增加丝毫，我们成功的优势组合表：

胞系	028	Hb31	CR	TY	T1	TM-3
							028		未测	0.02179	0.0263	0.345	0.0199
Hb31			0.709※	未测	0.28859	0.1089
							CR				0.0713	未测	0.629※
TY					0.114	0.097
							T1						未测
TM-3

注：028＝Media 02年08月诱导的愈伤组织

Hb31＝西北红豆杉(材料取自中科院北京植物所)

CR＝粗榧(材料取自中科院北京植物所)

TY＝云南红豆杉

T1＝南方红豆杉(四川娥眉山)

TM-3＝Media 01年10月诱导的愈伤组织

从上述实验结果实例中，不同组合对合成紫杉醇的能力有显著差异，其中Hb31+CR、TM-3+CR两个组合含量最高达到万分之7和万分之6.2以上，T1与其他细胞系组合，紫杉醇含量均在万分之一以上，最好的T1+028组合含量达到万分之3.45。

以下是本发明中所涉及的培养基的具体成分列表：

Claims (6)

1.一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法，包括：

(1)外植体的灭菌和灭菌程序及接种

将红豆杉外植体用洗洁精与自来水混合液清洗，再用自来水冲洗直至无泡沫为止；然后将其进行灭菌程序，灭菌后截取1公分长切段，切去叶片只留叶柄，接种到诱导培养基上，移到24℃±1℃暗培养中，隔天后检查污染情况，救出未污染切断，35-45天后检查愈伤组织生产情况；

(2)愈伤组织的继代增殖

待上述愈伤组织长到黄豆大小时，将其从外植体上剥离下来，转移到上述诱导培养基上，继续在24～26℃黑暗培养增殖，每40天继代一次，经4-5次继代后得成熟愈伤组织；

(3)进入液体悬浮培养

将上述成熟愈伤组织接种到液体悬浮E培养基中进行悬浮培养，每7天继代一次，经2-3个月的继代培养至生长速率达5.7～8.4mg/g·d时，按接种率不小于7-10％，于24℃±1℃，自然室内光进行二级培养10-15天；

(4)进容器鼓泡式通气悬浮培养

按7-10％W/V的接种率接种到容器中，进行通气培养，经10-12天通气培养，其固液比达到15-18％；

(5)紫杉醇合成调控程序

第一调控程序：改变E培养基中的激素种类，把E培养基改为Eq即：B5+有机常规+细胞分裂素BA2mg/L+α-萘乙酸NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+麦芽糖15g/L，PH5.8；

第二调控程序：培养温度从24℃±1℃升高到27℃-30℃；

第三调控程序：紫杉醇培养容器中加入附加物：

KH2PO4      300mg/L

异亮氨酸    4mg/L

马尿酸      5mg/L

乙酸钠      140mg/L

柠檬酸铵    5mg/L

苯丙氨酸    33mg/L

Cud2·2h2o  2mg/L

麦芽糖      25mg/L；

第四调控程序：将红豆杉细胞进行组合培养。

2.根据权利要求1所述的一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的红豆杉种为Media红豆杉、中国南方红豆杉、粗榧、东北红豆杉或云南红豆杉。

3.根据权利要求1所述的一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的灭菌程序为50％乙醇浸润3-5秒→20％“84”液中7-8分钟→0.1％升汞液中12-15分钟→灭菌水冲洗几遍后，吸干水分。

4.根据权利要求1所述的一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法，其特征在于：步骤(1)和(2)中所述的诱导培养基为MS全量+有机常规+2，4-二氯苯氧乙酸2.4-D 1.5-2.5mg/L+α-萘乙酸NAA0.5mg/L+蔗糖30-40g/L+琼脂粉5g/L，常规灭菌，灭菌前PH调到5.8。

5.根据权利要求1所述的一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的液体悬浮E培养基为B5+2，4-二氯苯氧乙酸2.4-D2mg/L+α-萘乙酸NAA 0.5-1mg/L+6-糠氨基嘌呤KT 1-1.5mg/L+腺嘌吟15mg/L+水解酪蛋白CH500mg/L+蔗糖40g/L，PH5.8。

6.根据权利要求1所述的一种采用小型鼓泡式叠加容器细胞培养紫杉醇的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的红豆杉组合培养方案为：0.02179mg/g·DW的粗榧与MediaA、0.0263mg/g·DW的云南红豆杉与MediaA、0.345mg/g·DW的南方红豆杉与MediaA、0.0199mg/g·DW的MediaB与MediaA、0.709mg/g·DW的粗榧与西北红豆杉、0.28859mg/g·DW的南方红豆杉与西北红豆杉、0.1089mg/g·DW的MediaB与西北红豆杉、0.0713mg/g·DW的云南红豆杉与粗榧、0.6299mg/g·DW的MediaB与粗榧、0.114mg/g·DW的南方红豆杉与云南红豆杉或0.097mg/g·DW的MediaB与云南红豆杉，其中MediaA与MediaB分别表示不同批次的诱导遇上组织。