CN102191214A

CN102191214A - 一种产白藜芦醇细胞的制备方法及其专用悬浮培养基

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Publication number: CN102191214A
Application number: CN 201010122050
Authority: CN
Inventors: 李绍华; 刘�文; 王立军; 吴本红; 范培格; 段伟; 刘春艳
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Fujian Sanan Sino Science Photobiotech Co Ltd
Priority date: 2010-03-10
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2030-03-10
Also published as: CN102191214B

Abstract

本发明公开了一种产白藜芦醇细胞的制备方法及其专用悬浮培养基，本发明的专用悬浮培养基是在B5基本培养液或NN₁₉₆₉培养液中添加如下物质得到的培养基：酸水解酪蛋白、NAA、KT、BA和碳源；其中酸水解酪蛋白的终浓度为0.015-0.030g/100ml、NAA的终浓度为0.01-1.00mg/L、KT的终浓度为0.1-2.00mg/L、BA的终浓度为0.05-1.00mg/L。本发明将外植体先诱导愈伤组织；再将愈伤组织转入增殖培养基中培养；然后利用紫外线照射的诱导方法确定高产白藜芦醇的葡萄基因型。然后再确定高产白藜芦醇的器官类型。最后通过悬浮培养，大量扩繁细胞并诱导处理，最终获得高产白藜芦醇细胞。

Description

一种产白藜芦醇细胞的制备方法及其专用悬浮培养基

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种产白藜芦醇细胞的制备方法及其专用培养基。

背景技术

白藜芦醇(Resveratrol，Res)，化学名为3，5，4’-三羟基1，2-二苯乙烯(3，5，4′-trihydroxystilbene)，是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。研究发现，Res可有效抑制血小板的凝集及心血管的异常收缩，降低血脂水平从而起到预防心血管疾病的作用；Res因其抗诱变，抑制与癌症相关的酶活性等作用被视为抑制和治疗癌症的有效药物之一；此外，Res在抗氧化，消除人体自由基，抗病原微生物以及预防老年痴呆症等方面也发挥重要作用，并可广泛地应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域。目前世界上有十余个国家和地区在开发Res原料及其制剂，全球的年生产能力约为50-60t，而市场的年需求量可达100t。而且，随着Res在医药、保健品、化妆品及食品添加剂等领域的进一步的开发和应用，市场需求量会迅速扩大。因此，对Res的研究开发既具有可观的经济前景，又具有良好的社会效益。

人类摄取Res目前主要有两种途径，直接食用葡萄和葡萄加工品，二是服用以葡萄、落花生以及中药材植物为原料制取的Res药片及相关保健品。葡萄是人类栽培面积最大的果树树种之一，种质资源极其丰富，且本身Res含量也相对较高，因此，葡萄及葡萄加工品被认为是人类食品中Res的最主要来源。尽管葡萄种质资源丰富，但自然条件下不同葡萄种质间Res含量差异很大，仅有极少数杂交种含量极高。除此之外，同一葡萄属植物的不同器官间Res含量差异较大，在自然条件下，葡萄果皮、种子和果穗轴都含有较高的Res，叶片中含量较低，而枝条、芽、花、果肉和果汁中的含量极少。目前，仅仅以大面积栽培品种葡萄果实为原料，Res人工提取的效率低，成本将会很高，而采用含量极高的品种为原料进行提取，产量低且受到气候条件的严格限制，而以提取Res为目标栽培自然条件下高Res含量的种质，其经济效益也受到很大的限制。

随着植物细胞培养工程技术的发展，人们选择不同的培养方式，改变影响细胞培养的物理化学因素等，可以大大加快植物细胞的生长，提高目的物质的含量，并且不受地理、季节和气候条件的限制，节省野生植物和土地资源，具有生长周期短，经济效益显著等优点。迄今为止，人们已经对1000多种植物进行了细胞培养方面的研究，利用该技术至少能够生产上百种次生代谢物质，而能够实现工业化生产的只有人参、黄连、长春花、紫草等少数几种。

目前关于葡萄细胞培养的研究，主要集中在细胞培养筛选突变体、原生质体培养及基因转化等方面，由于技术上的原因，仅有花色素可以利用葡萄细胞培养的方法进行小规模生产，而围绕Res大量生产展开的工作仅在实验水平。尽管利用葡萄细胞培养研究Res已有报道，但多数学者采用转基因的方法提高细胞中Res的含量，但这种通过转基因技术得到的Res能否正常用于食品及医药工业一直饱受争议。所以，建立一种成熟，纯天然的葡萄高产细胞体系是解决大量生产Res和食品安全之间矛盾有着重要的意义。

目前为止，国内外关于从自然条件下高产Res葡萄基因型及组织器官来着手进行高产Res细胞生产的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种悬浮培养基。

本发明提供的悬浮培养基，是在B₅基本培养液或NN₁₉₆₉培养液中添加如下物质得到的培养基：酸水解酪蛋白、NAA、BA和碳源；

所述悬浮培养基中，酸水解酪蛋白的终浓度为0.015-0.030g/100ml、NAA的终浓度为0.01-1.00mg/L、BA的终浓度为0.05-1.00mg/L以及碳源的终浓度是2-4g/100ml；

所述B₅基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；

所述NN₁₉₆₉培养液的溶质是水、溶质如表1所示。

表1.B₅和NN₁₉₆₉基本培养液的溶质

上述碳源可以是蔗糖或葡萄糖，优选是蔗糖。

所述悬浮培养基中，酸水解酪蛋白、NAA、BA和碳源的终浓度是如下1)或2)或3)：

1)酸水解酪蛋白的终浓度为0.015-0.025g/100ml、NAA的终浓度为0.01-0.1mg/L、BA的终浓度为0.05-0.1mg/L以及碳源的终浓度是2-4g/100ml；

2)酸水解酪蛋白的终浓度为0.025-0.03g/100ml、NAA的终浓度为0.1-1.00mg/L、BA的终浓度为0.1-1.0mg/L以及碳源的终浓度是2-4g/100ml；

3)酸水解酪蛋白的终浓度为0.025g/100ml、NAA的终浓度为0.1mg/L、BA的终浓度为0.1mg/L以及碳源的终浓度是3g/100ml。

本发明的另一目的在于提供一种制备产白藜芦醇细胞的方法。

本发明提供的制备产白藜芦醇细胞的方法，包括以下步骤：

1)将葡萄外植体置于愈伤组织的诱导培养基中培养，得到愈伤组织；

2)将步骤1)中得到的愈伤组织转入增殖培养基中培养，获得愈伤组织；

3)将步骤2)中获得的愈伤组织在上述的悬浮培养基中悬浮培养，得到含有愈伤组织的培养液；

4)往步骤3)中的含有愈伤组织的培养液中加入甲基茉莉酸进行诱导处理，得到产白藜芦醇细胞。

上述外植体可以是叶片、种子或果皮，所述外植体优选是叶片。

上述叶片选自‘植168’、‘贝达’、‘酶露辄’或‘京秀’品种；所述叶片优选来自‘植168’或‘贝达’品种。

上述诱导培养基是在B₅基本培养液或NN₁₉₆₉培养液中添加蔗糖、2，4-D、BA和凝胶剂得到的培养基；

所述诱导培养基中蔗糖的终浓度为3g/100ml、2，4-D的终浓度为0.05-2.00mg/L、BA的终浓度为0.05-1.00mg/L；

所述B₅基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；

所述NN₁₉₆₉培养液的溶质是水、溶质如表1所示。

上述凝胶剂可以是琼脂，具体用量以能够使培养基形成固体培养基为准(大约的用量是5～7g/L)。

上述增殖培养基是在B₅基本培养液或NN₁₉₆₉培养液中添加蔗糖、酸水解酪蛋白、2，4-D、KT、BA和凝胶剂得到的培养基；

所述增殖培养基中蔗糖的终浓度为3g/100ml、酸水解酪蛋白的终浓度为0.015g/100ml-0.030g/100ml、2，4-D的终浓度为0.01-1.00mg/L、KT的终浓度为0.1-2.00mg/L、BA的终浓度为0.05-1.00mg/L；

所述B₅基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；

所述NN₁₉₆₉培养液的溶质是水、溶质如表1所示。

上述凝胶剂可以是琼脂，具体用量以能够使培养基形成固体培养基为准。

上述悬浮培养的条件是：摇床转速110-130rmp，温度25±2℃，培养周期是14天。

上述加入甲基茉莉酸进行诱导处理是在上述悬浮培养第7天进行。

所述甲基茉莉酸的浓度是0-50μmol.L^-1(不包括0)，优选是0.5-50μmol·L^-1，更优选是5.0μmol·L^-1。

上述诱导处理的时间可为2-10天，优选是2天。

在诱导处理2天后可以开始采收得到产白藜芦醇细胞。

任一上述的方法所得到的产白藜芦醇细胞也属于本发明的保护范围之内。

实验证明：‘贝达’和‘植168’的品种的叶片是适合生产白藜芦醇的。采用本

发明的技术方案，单位愈伤组织的白藜芦醇产量可高达31.45μg·g^-1·Fw。

本发明以自然条件下白藜芦醇含量有显著差别的不同葡萄基因型叶片为外植体，经过消毒处理，接种于培养基上诱导愈伤组织，愈伤组织形成后再接入愈伤增殖培养基。利用紫外线照射的诱导方法，确定高产白藜芦醇的葡萄基因型。以高产白藜芦醇葡萄品种的不同组织器官为材料，诱导愈伤组织并增殖后，用紫外线照射的方法诱导愈伤组织，再确定高产白藜芦醇的器官类型。通过悬浮培养，大量扩繁细胞并诱导处理，最终获得高产白藜芦醇细胞。本发明高效天然，在不依赖转基因技术的条件下获得大量高白藜芦醇含量的葡萄细胞，对于保护资源及人体健康具有重要的意义。

本发明的以高合成Res的葡萄基因型和组织器官为目标材料，具有直接、快速、稳定、高产的优点。在不依赖于转基因技术的条件下，保证了得到的Res产品的安全性，对于保护资源，维护人体健康具有重要的意义。本发明还具有方法简单，容易实施的特点。

附图说明

图1为本发明的贝达叶片愈伤组织15天诱导图。

图2为本发明的贝达种子愈伤组织15天诱导图。

图3为本发明的贝达果皮愈伤组织20天诱导图

图4为本发明的贝达叶片来源愈伤组织转接增殖图。

图5为本发明贝达叶片来源愈伤组织悬浮培养前生长图。

图6为本发明的贝达叶片来源愈伤组织悬浮培养图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明中的葡萄品种‘贝达’、‘酶露辄’和‘京秀’可购自兴龙苗木园艺场。本发明中的葡萄品种‘植168’是中科院植物研究所自己培育的葡萄品种。

实施例1中的诱导培养基的各组分给出的形式如下：B₅+蔗糖3g/100ml+2，4-D 0.1mg/L+BA0.1mg/L。该诱导培养基表示：在B₅基本培养液中添加蔗糖、2，4-D、BA和凝胶剂得到的培养基；该诱导培养基中蔗糖的终浓度为3g/100ml、2，4-D的终浓度为0.05-2.00mg/L、BA的终浓度为0.05-1.00mg/L；所述B₅基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；该凝胶剂可以是琼脂，具体用量以能够使培养基形成固体培养基为准。

本发明中的所有以该形式表示的培养基的解释同上。其中悬浮培养基中不加凝胶剂，是液体培养基；诱导培养基和增值培养基均是固体培养基。

实施例1、筛选葡萄基因型和组织型

一、筛选葡萄基因型

1、愈伤组织的诱导

将不同品种的葡萄(‘植168’、‘贝达’、‘酶露辄’和‘京秀’)的叶片用2％(体积百分比)的洗涤灵仔细清洗表面5分钟，流水冲洗不少于30min，70％(体积百分比)的酒精消毒30sec，无菌水冲洗3遍，0.1％的升汞消毒1min，无菌水冲洗3～5遍。

将消毒后的材料剪成50mm²的小块作为外植体，接种于诱导培养基上进行愈伤组织诱导。诱导培养基成分为B₅+蔗糖3g/100ml+2，4-D 0.1mg/L+BA0.1mg/L。材料在25±2℃及黑暗条件下培养30天。

2、愈伤组织的增殖

愈伤组织形成后，将新鲜的愈伤组织转入增殖培养基，培养基成分为：B₅+3g/100ml蔗糖+0.025g/100ml酸水解酪蛋白+2，4-D 0.01mg/L+KT 1.00mg/L+BA0.01mg/L。培养温度为25±2℃，培养周期为30天。

3、紫外照射筛选

待愈伤组织增殖生长稳定后(每个培养周期的第15天)，选择新鲜松脆的愈伤组织，在无菌条件下，用镊子轻轻压成薄层。在无菌系统中用型号为ZW30S26W，输出功率30W的紫外灯关在距离愈伤组织厘米处照射处理5～20min，完成照射后将材料再次转入增殖培养基，每隔2h取样检测Res，直至72h。其中提取Res的方法如下：样品用研钵加液氮磨成粉末后，转移至离心管中，加入15mL的浸提液(纯甲醇和纯乙酸乙酯的混合液(1/1，体积百分比))，室温下避光放置。浸提48h后12,000×g条件下离心10min，收集上清液。在离心后的沉淀物中再次加入提取液浸提，如此重复2～3次。最后收集所有的浸提液，在旋转蒸发仪(N-1001D-WD，理化，日本)下，40℃真空干燥。用2mL 95％甲醇溶解样品，用0.45μm的一次性滤器过滤，然后进行高效液相色谱检测。

HPLC检测条件是：芪类物质采用美国Dionex公司的高效液相色谱系统进行测定，包括Dionex P680泵，Dionex TCC-100柱温箱，Dionex PDA-100检测器。Kromasil-100(4μm粒径，250mm×4.6mm)的反相C18色谱柱(Tracer Analitica，Barcelona，Spain)；C18Nova Pack保护柱(Waters，USA)。梯度洗脱：A相为水溶液，B相为乙腈，洗脱程序见表2。柱温：30℃，进样量为5μL。流速：1.0mL·min^-1。同时设定两个检测波长，分别为285nm和306nm。

表2 梯度洗脱程序

	0-45min	45-48min	48-50min	50min
					A相(％)	95	53	95	95
B相(％)	5	47	5	5

Trans-Res(反式白藜芦醇)的标样购自于美国Sigma公司，trans-piceid(反式白藜芦醇苷)标样购自中国药品生物制品检验所。精确称取一定量的trans-Res和trans-piceid标样，色谱纯甲醇溶解，配成一定浓度的标准品混合溶液。Cis-Res(顺式白藜芦醇)和cis-piceid(顺式白藜芦醇苷)的对照品溶液用紫外灯对trans-Res和trans-piceid混合标样溶液进行照射处理，由trans-Res和trans-piceid转化成相应的cis-Res和cis-piceid。以残留的trans-Res和trans-piceid计算其转化率，最后得到可知浓度的含有四种标准品的混合标样溶液。

4、结果

在72小时内，每隔2小时取样并测定愈伤处理愈伤组织中白藜芦醇的含量，结果显示，在处理后第48小时是白藜芦醇合成量最高的点，四个品种在处理后48h时，叶片来源的愈伤组织中白藜芦醇的含量如表3所示：‘贝达’的品种的葡萄是高产白藜芦醇的品种。

表3.不同基因型葡萄经处理后的白藜芦醇的产量(单位是μg·g^-1·Fw)

	UV-C	未处理
			‘植168’	38.6	3.9
‘贝达’	32.5	2.8
			‘酶露辄’	16.0	2.4
‘京秀’	12.0	0.3

二、筛选葡萄组织型

1、愈伤组织的诱导

将步骤一确定的‘贝达’品种的叶片、种子和果皮三种组织进行愈伤组织的诱导。其中叶片和种子的愈伤组织的诱导与步骤一中的步骤1的方法相同；而果皮的愈伤组织的诱导步骤如下：

采用生长良好的葡萄果实，2％(体积百分比)的洗涤灵清洗表面后用流动的自来水冲洗果实表面6-8小时，0.5％～1.0％的次氯酸钠消毒30sec，无菌水冲洗3～5遍。将消毒后的葡萄果皮剪成50mm²的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤组织诱导。果皮诱导培养基成分为B₅+2g/100ml蔗糖+2，4-D 0.1mg/L+NAA6.00mg/L+BA0.1mg/L。材料在25±2℃及黑暗条件下培养30天。

其中，贝达叶片愈伤组织15天诱导图如图1所示，贝达种子愈伤组织15天诱导图如图2所示，贝达果皮愈伤组织20天诱导图如图3所示。

2、愈伤组织的增殖

愈伤组织的增殖步骤与步骤一的步骤2相同。其中贝达叶片来源愈伤组织转接增殖图如图4所示。

3、紫外照射筛选

紫外照射筛选步骤与步骤一的步骤3相同。

在72小时内，每隔2小时取样并测定愈伤处理愈伤组织中白藜芦醇的含量，结果显示，在处理后第48小时是白藜芦醇合成量最高的点，三个组织器官在处理后48h时，愈伤组织中白藜芦醇的含量如表4所示：‘贝达’的品种的叶片是适合生产白藜芦醇的。

表4.不同组织经处理后的白藜芦醇的产量(单位是μg·g^-1·Fw)

	UV-C	未处理
			叶片	32.5	2.8
外果皮	29.7	3.5
			种子	11.7	3.2

实施例2、产白藜芦醇细胞的制备及其检测

甲基茉莉酸(MeJA)添加的方法：MeJA购于美国Sigma公司，用纯乙醇将母液按梯度分别稀释成1.5、15.0、150mmol·L^-1的工作液，灭菌的微孔滤膜(0.22μm)过滤，4℃保存备用。于培养周期(液体悬浮培养的培养周期是14天)的第7d，在无菌条件下，向葡萄细胞悬浮培养体系中添加MeJA工作液。

一、产白藜芦醇细胞的制备

1、愈伤组织的诱导

将‘贝达’的品种的叶片进行愈伤组织的诱导。诱导的方法与实施例1的步骤一的步骤1的区别在于诱导培养基换成了B₅+3g/100ml蔗糖+2，4-D 0.05mg/L+BA 0.05mg/L，其余步骤完全相同。

2、愈伤组织的增殖

愈伤组织的增殖的方法与实施例1的步骤一的步骤2的区别在于增殖培养基换成了NN₁₉₆₉+3g/100ml蔗糖+0.015g/100ml酸水解酪蛋白+2，4-D 0.01mg/L+KT 0.1mg/L+BA 0.05mg/L，其余步骤完全相同。

3、愈伤组织的悬浮培养

将步骤2得到的增殖过的愈伤组织进行悬浮培养，贝达叶片来源愈伤组织悬浮培养前生长图如图5所示。贝达叶片来源愈伤组织悬浮培养时图片如图6所示。悬浮培养的步骤如下：选择色泽鲜亮，生长旺盛，松脆的愈伤组织，无菌条件下在培养皿中将其轻轻压散，每10g愈伤材料接种到不含琼脂的40ml基本培养基NN₁₉₆₉+3g/100ml蔗糖+0.015g/100ml酸水解酪蛋白+NAA 0.01mg/L+BA 0.05mg/L中进行液体培养。每两周更换一次新鲜培养基，其中新旧培养液比率是1∶5，培养条件为：摇床转速110rmp，温度25±2℃。于培养周期(14天)的第7d，在无菌条件下，向葡萄细胞悬浮培养体系中添加MeJA工作液，使培养基中MeJA终浓度5μmol·L^-1。诱导处理2天后进行离心(转速10000转)，得到产白藜芦醇的细胞以及细胞培养液。

二、检测

收集本实施例的步骤一的步骤3得到的细胞，然后检测Res的量，其中检测细胞Res的方法与实施例1的步骤3提供的方法相同。

收集本实施例的步骤一的步骤3得到的细胞培养液，然后检测Res的量，其中检测Res的方法与上述检测细胞Res的方法的区别在于浸提液由乙酸乙酯和甲酸的混合液换成了单独的纯乙酸乙酯。

实验重复3次，检测发现经5μmol·L^-1的MeJA处理后，单位愈伤组织的白藜芦醇产量是31.4560μg·g^-1·Fw。

实施例3、产白藜芦醇细胞的制备及其检测

一、产白藜芦醇细胞的制备

1、愈伤组织的诱导

本步骤与实施例2的步骤一的步骤1的区别在于诱导培养基为B₅+3g/100ml蔗糖+2，4-D 0.10mg/L+BA 0.1mg/L，其余步骤完全相同。

2、愈伤组织的增殖

本步骤与实施例2的步骤一的步骤2的区别在于增殖培养基为B₅+3g/100ml蔗糖+0.025g/100ml酸水解酪蛋白+2，4-D 0.01mg/L+KT 1.00mg/L+BA 0.01mg/L其余步骤完全相同。

3、愈伤组织的悬浮培养

将步骤2得到的增殖过的愈伤组织进行悬浮培养，悬浮培养的步骤如下：选择色泽鲜亮，生长旺盛，松脆的愈伤组织，无菌条件下在培养皿中将其轻轻压散，每10g愈伤材料接种到不含琼脂的40ml基本培养基B₅+3g/100ml蔗糖+0.025g/100ml酸水解酪蛋白+NAA 0.1mg/L+BA 0.1mg/L中进行液体培养。每两周更换一次新鲜培养基，其中新旧培养液比率是1∶5，培养条件为：摇床转速110rmp，温度25±2℃。于培养周期(14天)的第7d，在无菌条件下，向葡萄细胞悬浮培养体系中添加MeJA工作液，使培养基中MeJA终浓度分别为0、0.5、5、50μmol·L^-1。诱导处理2天后进行离心(转速10000转)，得到产白藜芦醇的细胞以及细胞培养液。

二、检测

按照实施例2的步骤二提供的方法对本实施例的步骤一的步骤3得到的细胞和细胞培养液进行Res的量的检测。

实验重复3次，结果如表5所示：5.0μmol·L^-1MeJA诱导下，产白藜芦醇达31.45±4.2μg·g^-1·Fw。对于芪类物质的产量，MeJA的添加存在着明显的浓度效应，过高过低均不利于芪类物质的积累。浓度过低，诱导效果极其微弱，而浓度过高，对细胞的生长毒害严重，抑制芪类物质的积累。而5.0μmol·L^-1MeJA并未对悬浮体系产生毒害作用，且处在迅速生长期的葡萄细胞可以有效的感受并传递这种诱导信号。

表5.不同甲基茉莉酸浓度处理后的白藜芦醇的产量(单位是μg·g^-1·Fw)

不同甲基茉莉酸浓度(μmol·L^-1)	0	0.5	5.0	50.0
					单位愈伤组织的白藜芦醇产量(μg·g^-1·Fw)(平均值±标准差)	8.86±1.32	14.55±2.42	31.45±4.2	17.17±3.6

实施例4、产白藜芦醇细胞的制备及其检测

一、产白藜芦醇细胞的制备

1、愈伤组织的诱导

本步骤与实施例2的步骤一的步骤1的区别在于诱导培养基为B₅+3g/100ml蔗糖+2，4-D 2.00mg/L+BA 1.00mg/L其余步骤完全相同。

2、愈伤组织的增殖

本步骤与实施例2的步骤一的步骤2的区别在于增殖培养基为B₅+3g/100ml蔗糖+0.030g/100ml酸水解酪蛋白+2，4-D 1.00mg/L+KT 2.00mg/L+BA 1.00mg/L，其余步骤完全相同。

3、愈伤组织的悬浮培养将步骤2得到的增殖过的愈伤组织进行悬浮培养，悬浮培养的步骤如下：选择色泽鲜亮，生长旺盛，松脆的愈伤组织，无菌条件下在培养皿中将其轻轻压散，每10g愈伤材料接种到不含琼脂的40ml基本培养基B₅+3g/100ml蔗糖+0.03g/100ml酸水解酪蛋白+NAA 1.00mg/L+BA 1.00mg/L中进行液体培养。每两周更换一次新鲜培养基，其中新旧培养液比率是1∶5，培养条件为：摇床转速110rmp，温度25±2℃。于培养周期的第7d，在无菌条件下，向葡萄细胞悬浮培养体系中添加MeJA工作液，使培养基中MeJA终浓度5μmol·L^-1。诱导处理2天后进行离心(转速10000转)，得到产白藜芦醇的细胞以及细胞培养液。

二、检测

Claims

1.一种产白藜芦醇细胞的悬浮培养基，它是在B₅基本培养液或NN₁₉₆₉培养液中添加如下物质得到的培养基：酸水解酪蛋白、NAA、BA和碳源；

所述B₅基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；

所述NN₁₉₆₉培养液的溶质是水、溶质如表1所示。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述碳源是蔗糖或葡萄糖。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述悬浮培养基中，酸水解酪蛋白、NAA、BA和碳源的终浓度是如下1)或2)或3)：

3)酸水解酪蛋白的终浓度为0.025g/100ml、NAA的终浓度为0.1mg/L、BA的终浓度为0.1mg/L以及碳源是终浓度是3g/100ml。

4.一种制备产白藜芦醇细胞的方法，包括以下步骤：

3)将步骤2)中获得的愈伤组织在权利要求1-3任一所述的悬浮培养基中悬浮培养，得到含有愈伤组织的培养液；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述外植体是叶片、种子或果皮；所述外植体优选是叶片。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述叶片选自‘植168’、‘贝达’、‘酶露辄’或‘京秀’品种；所述叶片优选来自‘植168’或‘贝达’品种。

7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于：所述诱导培养基是在B₅基本培养液或NN₁₉₆₉培养液中添加蔗糖、2，4-D、BA和凝胶剂得到的培养基；

所述B₅基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；

所述NN₁₉₆₉培养液的溶质是水、溶质如表1所示。

8.根据权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于：所述增殖培养基是在B₅基本培养液或NN₁₉₆₉培养液中添加蔗糖、酸水解酪蛋白、2，4-D、KT、BA和凝胶剂得到的培养基；

所述B₅基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；

所述NN₁₉₆₉培养液的溶质是水、溶质如表1所示。

9.根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于：所述悬浮培养的条件是：摇床转速110-130rmp，温度25±2℃，培养周期是14天。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述加入甲基茉莉酸进行诱导处理是在所述悬浮培养的第7天进行；所述甲基茉莉酸的浓度是0-50μmol·L^-1(不包括0)，优选是0.5-50μmol·L^-1，更优选是5.0μmol·L^-1；所述诱导处理时间为2天。