CN105613293A - 4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法及其培养基 - Google Patents

4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法及其培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，该法选择4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌，采集萌芽条，先后经特定设计的初代诱导培养基和继代增殖培养基培养。实验表明，应用本发明可以提高芽器官繁殖系数，缩短芽器官继代增殖周期，增加有效芽数，从而降低4-松油醇型互叶白千层组培产业化育苗中的生产成本；由于外植体采自4-松油醇型互叶白千层优良单株，其组培苗保持了母本优良的遗传性状，使白千层种苗达到良种化和无性系化，可增加单位面积的生物量和产油量，提高白千层林分的经济效益和生态效益。

Description

4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法及其培养基
技术领域
本发明属于互叶白千层组织培养育苗技术领域，尤其涉及一种4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法及其培养基。
背景技术
互叶白千层(MelaleucaalternifoliaLinn)系桃金娘科(Myrtaceae)白千层(Melateuca)属植物，俗称茶树，常绿灌木至小乔木，原产于澳大利亚东部的昆士兰州和新南威尔士北部。由于互叶白千层枝叶中含有α-松油烯、桉叶素、γ-松油烯、4-松油醇等挥发性成分，长期以来作为香料植物在澳洲广为种植。不同生化类型的互叶白千层油价格差异大，用途也不同；4-松油醇型互叶白千层油，就是常说的茶树油，价值最高；桉叶素型互叶白千层油次之；其他两种类型利用价值不高，属淘汰产品。20世纪90年代初，由于认识到茶树油的重要商业价值，我国开始引进互叶白千层，陆续在广东、广西、福建、海南、云南、贵州等地大面积种植。
茶树油为无色至淡黄色透明油状液体，具有令人愉快的豆蔻气味，是公认的优良天然芳香剂、抗菌剂、防腐剂，2002年被收入欧洲和英国药典。当前，茶树油在农用杀菌剂、日用卫生制品、皮肤保健品、化妆品、食品香料、药品等行业中已开始广泛试用或应用。目前，国际上对茶树油的需要量极大，价格稳定，国内市场的需求量也在不断增长。种植和加工4-松油醇型互叶白千层已成为一个新兴产业，做为一个短平快的项目可帮助林农脱贫致富。此外，该树种还可用作绿化，因此其种植集经济效益、社会效益和生态效益于一身。
为满足茶树油市场需求，4-松油醇型互叶白千层的种植面积不断扩大，对优良种苗的迫切需求随之而来。互叶白千层种子小，发芽率仅10％，且产量低，难以满足生产的需要。同时，种子苗个体间遗传分化大，单株生物量，精油含量和成分参差不齐，从而制约了精油生产量的提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种增殖周期短、繁殖效果好、生产成本低的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法及其培养基，所得4-松油醇型互叶白千层组培苗遗传性状优良稳定。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：4-松油醇型互叶白千层组培培养基为初代诱导培养基，该培养基的配方为改良MS+6-BA2.5mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3000mg·L-1。
4-松油醇型互叶白千层组培培养基为继代增殖培养基，该培养基的配方为改良MS+6-BA1.5～2.0mg·L-1+NAA0.6～1.0mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3500mg·L-1。
改良MS培养基的组成为：
使用上述组培培养基的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，选择4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌，采集萌芽条，先后经初代诱导培养基和继代增殖培养基培养。
上述4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，包括以下步骤：
<1>优良单株的选择；
<2>初始芽的获取；
<3>芽器官的继代增殖培养。
步骤<1>按以下操作进行：选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到“茶树油”国际标准IS04730-2004。
步骤<2>按以下操作进行：在前一年的11月～12月，对选择出的优良单株进行伐桩或者环割促萌；当年采集萌芽条，去除叶片，剪切成3cm～6cm的小段，酒精、升汞消毒处理，而后无菌水冲洗，接种到初代诱导培养基上。
步骤<3>按以下操作进行：待初代芽长度≥1.5cm时，转入继代增殖培养；芽体转入继代增殖培养基后，平摊在培养基上，芽体部分压入培养基中。
初代诱导培养或继代增殖培养的培养条件为28～30℃，1500～2500LX，每天光照12～14h。
为满足对4-松油醇型互叶白千层优良种苗的需求以供给大规模栽培，发明人在优良单株选择的基础上，探索通过组培快繁生产大量遗传性状一致的4-松油醇型互叶白千层优质苗，克服了组培技术的关键环节——继代增殖，从而建立了一种4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，并研制了相应的组培培养基。该法选择4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌，采集萌芽条，先后经特定设计的初代诱导培养基和继代增殖培养基培养。实验表明，应用本发明可以提高芽器官繁殖系数(达5.7～7.4)，缩短芽器官继代增殖周期(仅需30d)，增加有效芽数(5.2～6.8个)，从而降低4-松油醇型互叶白千层组培产业化育苗中的生产成本；由于外植体采自4-松油醇型互叶白千层优良单株，其组培苗保持了母本优良的遗传性状，使白千层种苗达到良种化和无性系化，可增加单位面积的生物量和产油量，提高白千层林分的经济效益和生态效益。
具体实施方式
以下各例中，初代诱导培养或继代增殖培养的培养条件为28～30℃，1500～2500LX，每天光照12～14h。改良MS培养基的组成为：
实施例1
<1>优良单株的选择
选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到“茶树油”国际标准IS04730-2004，其4-松油醇含量＞35％，1，8-桉叶素含量＜5％。
<2>初始芽的获取
2.1、外植体的采集
在优良单株选出的基础上，在前一年的11月～12月，对选择出的4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌(割树周长的1/2)，割伤至韧皮部。萌芽条生长至30～40cm时，于晴天午后采集接种。
2.2、外植体消毒
将采回的枝条去除叶片后，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净，再用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，后用去离子水清洗3次，剪切成3cm～6cm的小段。用75％乙醇浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗3次后置于超净台，将0.1％HgCl2倒入装有外植体的瓶中，以浸泡的方式静置5min，用无菌水冲洗3次；然后再倒入0.1％HgCl2，以振荡的方式进行灭菌处理3min，最后用无菌水冲洗3次。
2.3、茎段的初始培养
将消毒好的茎段接种到初代诱导培养基上进行诱导培养。培养10d后腋芽开始萌动，培养30d芽高3～5cm时，把茎段剪下进行丛生芽诱导。经过30d的培养，每个外植体形成一个或多个无菌初始芽，用于互叶白千层芽器官继代增殖培养。
初代诱导培养基配方为改良MS+6-BA2.5mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3000mg·L-1。
<3>芽器官的继代增殖培养
待无菌初代芽长度≥1.5cm时，选取生长较健壮的转入继代增殖培养，初代芽长度＜1.5cm，则待其继续生长，待长度≥1.5cm再转入继代增殖培养；初代芽较长的，可剪切为几段，每段长度≥1.5cm；分段或者不分段的芽体转入继代增殖培养基后，均平摊在培养基上，芽体部分压入培养基中，以便其吸收营养；芽与芽之间不交叉，不重叠，以免先长起来的芽将上面的芽顶起，导致其吸收不到营养而死亡。
继代增殖培养基配方为改良MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.6mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3500mg·L-1。
经过30d培养，增殖系数达到5.7，有效芽5.2个(有效芽指高度≥1.0cm，生长健壮的芽)。
实施例2
<1>优良单株的选择
选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到“茶树油”国际标准IS04730-2004，其4-松油醇含量＞35％，1，8-桉叶素含量＜5％。
<2>初始芽的获取
2.1、外植体的采集
在优良单株选出的基础上，在前一年的11月～12月，对选择出的4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌(割树周长的2/3)，割伤至韧皮部。萌芽条生长至30～40cm时，于晴天午后采集接种。
2.2、外植体消毒
将采回的枝条去除叶片后，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净，再用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，后用去离子水清洗4次，剪切成3cm～6cm的小段。用75％乙醇浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗4次后置于超净台，将0.1％HgCl2倒入装有外植体的瓶中，以浸泡的方式静置6min，用无菌水冲洗4次；然后再倒入0.1％HgCl2，以振荡的方式进行灭菌处理4min，最后用无菌水冲洗4次。
2.3、茎段的初始培养
将消毒好的茎段接种到初代诱导培养基上进行诱导培养。培养10d后腋芽开始萌动，培养30d芽高3～5cm时，把茎段剪下进行丛生芽诱导。经过30d的培养，每个外植体形成一个或多个无菌初始芽，用于互叶白千层芽器官继代增殖培养。
初代诱导培养基配方为改良MS+6-BA2.5mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3000mg·L-1。
<3>芽器官的继代增殖培养
待无菌初代芽长度≥1.5cm时，选取生长较健壮的转入继代增殖培养，初代芽长度＜1.5cm，则待其继续生长，待长度≥1.5cm再转入继代增殖培养；初代芽较长的，可剪切为几段，每段长度≥1.5cm；分段或者不分段的芽体转入继代增殖培养基后，均平摊在培养基上，芽体部分压入培养基中，以便其吸收营养；芽与芽之间不交叉，不重叠，以免先长起来的芽将上面的芽顶起，导致其吸收不到营养而死亡。
继代增殖培养基配方为改良MS+6-BA1.75mg·L-1+NAA0.8mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3500mg·L-1。
经过30d培养，增殖系数达到6.6，有效芽6.0个(有效芽指高度≥1.0cm，生长健壮的芽)。
实施例3
<1>优良单株的选择
选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到“茶树油”国际标准IS04730-2004，其4-松油醇含量＞35％，1，8-桉叶素含量＜5％。
<2>初始芽的获取
2.1、外植体的采集
在优良单株选出的基础上，在前一年的11月～12月，对选择出的4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌(环割一整周)，割伤至韧皮部。萌芽条生长至30～40cm时，于晴天午后采集接种。
2.2、外植体消毒
将采回的枝条去除叶片后，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净，再用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，后用去离子水清洗5次，剪切成3cm～6cm的小段。用75％乙醇浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗5次后置于超净台，将0.1％HgCl2倒入装有外植体的瓶中，以浸泡的方式静置8min，用无菌水冲洗5次；然后再倒入0.1％HgCl2，以振荡的方式进行灭菌处理5min，最后用无菌水冲洗5次。
2.3、茎段的初始培养
将消毒好的茎段接种到初代诱导培养基上进行诱导培养。培养10d后腋芽开始萌动，培养30d芽高3～5cm时，把茎段剪下进行丛生芽诱导。经过30d的培养，每个外植体形成一个或多个无菌初始芽，用于互叶白千层芽器官继代增殖培养。
初代诱导培养基配方为改良MS+6-BA2.5mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3000mg·L-1。
<3>芽器官的继代增殖培养
待无菌初代芽长度≥1.5cm时，选取生长较健壮的转入继代增殖培养，初代芽长度＜1.5cm，则待其继续生长，待长度≥1.5cm再转入继代增殖培养；初代芽较长的，可剪切为几段，每段长度≥1.5cm；分段或者不分段的芽体转入继代增殖培养基后，均平摊在培养基上，芽体部分压入培养基中，以便其吸收营养；芽与芽之间不交叉，不重叠，以免先长起来的芽将上面的芽顶起，导致其吸收不到营养而死亡。
继代增殖培养基配方为改良MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA1.0mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3500mg·L-1。
经过30d培养，增殖系数达到7.4，有效芽6.8个(有效芽指高度≥1.0cm，生长健壮的芽)。
应用本发明4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，经过一代及以上代数继代增殖培养的芽器官的继代增殖剪切方式及继代增殖培养基、培养条件均与初代芽相同；其中，继代增殖芽体采用横卧、平铺的方式，操作较单芽直立插入更简单。以增殖为目的的继代增殖培养基可在一定范围内选择细胞分裂素较高，生长素较低的组合。而一边进行继代增殖一边还需进行单芽生根，可在一定范围内选择细胞分裂素较低，生长素较高的组合。

Claims (9)

1.一种4-松油醇型互叶白千层组培培养基，其特征在于为初代诱导培养基，该培养基的配方为改良MS+6-BA2.5mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3000mg·L-1。
2.一种4-松油醇型互叶白千层组培培养基，其特征在于为继代增殖培养基，该培养基的配方为改良MS+6-BA1.5～2.0mg·L-1+NAA0.6～1.0mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3500mg·L-1。
3.权利要求1或2所述4-松油醇型互叶白千层组培培养基，其特征在于所述改良MS培养基的组成为：
4.使用权利要求3所述组培培养基的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于选择4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌，采集萌芽条，先后经初代诱导培养基和继代增殖培养基培养。
5.根据权利要求4所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于包括以下步骤：
<1>优良单株的选择；
<2>初始芽的获取；
<3>芽器官的继代增殖培养。
6.根据权利要求5所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于步骤<1>按以下操作进行：选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到“茶树油”国际标准ISO4730-2004。
7.根据权利要求5所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于步骤<2>按以下操作进行：在前一年的11月～12月，对选择出的优良单株进行伐桩或者环割促萌；当年采集萌芽条，去除叶片，剪切成3cm～6cm的小段，酒精、升汞消毒处理，而后无菌水冲洗，接种到初代诱导培养基上。
8.根据权利要求5所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于步骤<3>按以下操作进行：待初代芽长度≥1.5cm时，转入继代增殖培养；芽体转入继代增殖培养基后，平摊在培养基上，芽体部分压入培养基中。
9.根据权利要求7或8所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于：所述初代诱导培养或继代增殖培养的培养条件为28～30℃，1500～2500LX，每天光照12～14h。
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Application publication date: 20160601

Assignee: Guangxi Baise Runcheng Agricultural Development Co.,Ltd.

Assignor: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION FORESTRY Research Institute

Contract record no.: X2022450000419

Denomination of invention: Tissue culture, subculture and culture medium of 4-terpineol type Melaleuca alternifolia

Granted publication date: 20180629

License type: Common License

Record date: 20221227