CN106244517B - 一种山葡萄体细胞胚及其培养方法、培养基及应用 - Google Patents

一种山葡萄体细胞胚及其培养方法、培养基及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种山葡萄体细胞胚及其培养方法、培养基及应用，属于葡萄组织培养技术领域。本发明通过对体细胞胚诱导培养基的碳源、通气量和氮源的选择和控制，在培养的过程中，使体细胞胚生长以及白藜芦醇合成的达到最佳状态，培养得到的体细胞胚具有较高含量的白藜芦醇，本发明的山葡萄体细胞胚的培养方法以及由此方法得到的体细胞胚为山葡萄细胞培养生产次生代谢产物白黎芦醇的工厂化生产和产业化开发提供材料和依据。

Description

一种山葡萄体细胞胚及其培养方法、培养基及应用
技术领域
本发明涉及葡萄组织培养技术领域，具体而言，涉及一种山葡萄体细胞胚及其培养方法、培养基及应用。
背景技术
山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)的次生代谢产物白黎芦醇具有防癌、保护心血管系统、抗菌、调节血脂等多种对人体有益的作用。现有提取白黎芦醇的技术主要以葡萄植株或葡萄果实为原料进行提取，但这种提取方式的原料受到季节以及生长周期的限制，不能保证提取工作的连贯性。因此，开发出了利用葡萄愈伤组织作为原料，提取其中含有的白藜芦醇，虽然克服了生长季节和周期的限制，但现有的培养方法培养得到的用作提取白藜芦醇原料的山葡萄愈伤组织中的白藜芦醇含量较低，限制了利用山葡萄愈伤组织培养物为原料提取白藜芦醇的工业化生产规模。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种山葡萄体细胞胚的培养方法，此培养方法采用组织培养技术对山葡萄外植体培养得到含有白藜芦醇的体细胞胚，并且通过该培养方法得到体细胞胚含有的白藜芦醇量较高。
本发明的第二目的在于提供一种用于培养山葡萄体细胞胚的培养基，该培养基能够诱导山葡萄胚性愈伤组织分化形成含有白藜芦醇的体细胞胚，且经该培养基培养得到体细胞胚中的白藜芦醇含量较高。
本发明的第三目的在于提供一种山葡萄体细胞胚，其由上述培养方法培养得到，其白藜芦醇含量较高，可用作提取白藜芦醇工业化生产中的原料。
本发明的第四目的在于提供山葡萄体细胞胚在制备白藜芦醇中的应用，以具有较高白藜芦醇含量的山葡萄体细胞胚用作提取白藜芦醇的原料，有利于实现白藜芦醇的大规模生产。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种山葡萄体细胞胚的培养方法，其包括：
取山葡萄外值体进行诱导培养，得到山葡萄胚性愈伤组织；
将所述山葡萄胚性愈伤组织接种至体细胞胚诱导培养基中，进行体细胞胚诱导培养，得到含白藜芦醇的体细胞胚；
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.45～0.52mg 6-BA、28～32g碳源以及0.4～0.6g氮源制成，体细胞胚诱导培养基pH为5.6～6.0，碳源是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种，氮源是选自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白以及脯氨酸中的任意一种。
一种用于培养山葡萄体细胞胚的培养基，其是由每升MS培养基中添加0.45～0.52mg 6-BA、28～32g碳源以及0.4～0.6g氮源制成的体细胞胚诱导培养基，体细胞胚诱导培养基pH为5.6～6.0，碳源是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种，氮源是选自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白以及脯氨酸中的任意一种。
一种山葡萄体细胞胚，其上述山葡萄体细胞胚的培养方法培养所得到。
上述山葡萄体细胞胚在制备白藜芦醇中的应用。
本发明提供的一种山葡萄体细胞胚及其培养方法、培养基及应用有益效果是：本发明的山葡萄体细胞胚的培养方法通过对体细胞胚诱导培养基的体系优化，调整体细胞胚诱导培养基中的6-BA浓度为0.45～0.52mg/L、碳源的浓度为28～32g/L、氮源的浓度为0.4～0.6g/L等影响因素以使山葡萄胚性愈伤组织在分化成体细胞胚的过程中产生最大量的白黎芦醇，并选用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种作为碳源和选用椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白以及脯氨酸中的任意一种作为氮源，进一步为体细胞胚的生长以及白藜芦醇合成的提供最佳碳源和氮源，以使得到的体细胞胚中的白藜芦醇含量最大化，进而为山葡萄细胞培养生产次生代谢产物白黎芦醇的工厂化生产和产业化开发提供材料和依据。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种山葡萄体细胞胚及其培养方法、培养基及应用进行具体说明。
一种山葡萄体细胞胚的培养方法，其包括以下步骤。
S1获取山葡萄胚性愈伤组织
取山葡萄外值体进行前诱导培养，以得到山葡萄胚性愈伤组织。
具体包括：
(1)将山葡萄外值体于预培养基上进行预培养，得到山葡萄愈伤组织。
其中，预培养基由每升MS培养基中添加1.8～2.1mg 6-BA、0.18～0.22mg NAA、28～32g蔗糖以及6.5～7.2g琼脂制成，预培养基的pH值为5.6～6.0。
优选地，预培养的条件是在温度为23～27℃条件下，黑暗培养28～30d。
优选地，山葡萄外值体为0.4～0.5cm长的山葡萄茎段。需要说明的是，山葡萄外值体还可以是山葡萄的根、叶等器官组织，并不限于山葡萄的茎。
(2)将山葡萄愈伤组织于胚性诱导培养基上进行胚性诱导培养，得到山葡萄胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基由每升MS培养基中添加0.45～0.52mg 6-BA、0.08～0.12mgNAA、28～32g蔗糖以及6.5～7.2g琼脂制成，胚性诱导培养基的pH为5.6～6.0。
优选地，胚性诱导培养的条件是：温度为23～27℃、光周期为15～17h、培养时间为28～30d。
山葡萄胚性愈伤组织质地较坚实，颜色有乳白色，表面具球形颗粒，其具有较强分化能力。
S2获取体细胞胚
(1)将山葡萄胚性愈伤组织接种至体细胞胚诱导培养基中，进行体细胞胚诱导培养，得到含白藜芦醇的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.45～0.52mg 6-BA、28～32g碳源以及0.4～0.6g氮源制成，体细胞胚诱导培养基的pH为5.6～6.0。其中，碳源是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种，氮源是选自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白以及脯氨酸中的任意一种。
优选地，进行体细胞胚诱导培养的条件是：温度为23～27℃、通气量为0.15～0.25vvm的条件下暗培养28～30d。
优选地，按质量体积比为10～15：1的比例(指每升体细胞胚诱导培养基中接种10～15g山葡萄胚性愈伤组织)将山葡萄胚性愈伤组织接种至体细胞胚诱导培养基中。
一种山葡萄体细胞胚，其由上述的山葡萄体细胞胚的培养方法培养所得到，该山葡萄体细胞胚具有较高含量的白藜芦醇。
上述山葡萄体细胞胚在在制备白藜芦醇中的应用，山葡萄体细胞胚具有较高含量的白藜芦醇，可用作提取白藜芦醇的原料。
由此，本发明所提供的山葡萄体细胞胚的培养方法，以山葡萄茎段为外植体，诱导出愈伤组织，以及进一步诱导产生胚性愈伤组织和体细胞胚，通过对不同接种量，以及体细胞胚诱导培养基的碳源、通气量和氮源的选择和控制，以使体细胞胚生长以及白藜芦醇合成的达到最佳状态，其对提高山葡萄组织培养物中的有效成分产率，筛选高产的细胞组织，实现白藜芦醇的大规模生产具有重要意义，同时为山葡萄细胞培养生产次生代谢产物白黎芦醇的工厂化生产和产业化开发提供材料和依据。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例以山葡萄左山一品种的嫩茎段作为山葡萄外值体，山葡萄嫩茎段取自中国农业科学院特产研究所的国家果树种质左家山葡萄资源圃。在其他的实施例中，山葡萄的品种并不限于左山一，可以是北冰红、左优红、双红、双丰或双优等品种。
本实施例的山葡萄体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的山葡萄嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3～4次。
(2)将山葡萄嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.5cm长的山葡萄茎段。
(3)将切好的山葡萄茎段接种至含有预培养基的三角瓶(容量为100ml，含30ml预培养基)中进行预培养，每个三角瓶中接种3个外植体，在温度为25℃的预培养条件下，暗培养28天，以诱导形成愈伤组织。
其中，预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加2.0mg 6-BA、0.2mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌(指在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下灭菌20min，以下述及高压灭菌的，其灭菌条件同此)，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，在温度为25℃，光周期16h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天，以诱导愈伤组织进一步形成胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加0.5mg 6-BA、0.1mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种10g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器(哈尔滨道外化玻站，气升式生物反应器，含2L体细胞胚诱导培养基)中，于温度为25℃，通气量为0.2vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养30天，以诱导形成含白藜芦醇的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.5mg 6-BA、30g蔗糖以及0.5g水解酪蛋白，pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。
实施例2
本实施例的山葡萄体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的山葡萄嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3～4次。
(2)将山葡萄嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.4cm长的山葡萄茎段即外值体。
(3)将切好的山葡萄茎段接种至含有预培养基的三角瓶中进行预培养，每个三角瓶中接种3个外值体，在温度为27℃下的预培养条件下，暗培养28天，以诱导形成愈伤组织。
其中，所用预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加2.0mg 6-BA、0.2mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，然后在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下高压灭菌20min，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，在温度为25℃，光周期15h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天，以诱导愈伤组织进一步形成胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加0.5mg 6-BA、0.1mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种12g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中，于温度为23℃，通气量为0.25vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养30天，以诱导形成含白藜芦醇的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.52mg 6-BA、30g山梨醇以及0.6g水解乳蛋白，pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。
实施例3
本实施例的山葡萄体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的山葡萄嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3～4次。
(2)将山葡萄嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.5cm长的山葡萄茎段即外值体。
(3)将切好的山葡萄茎段接种至含有预培养基的三角瓶中进行预培养，每个三角瓶中接种3个外值体，在温度为27℃下的预培养条件下，暗培养28天，以诱导形成愈伤组织。
其中，所用预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加2.0mg 6-BA、0.2mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，然后在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下高压灭菌20min，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，在温度为25℃，光周期16h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天，以诱导愈伤组织进一步形成胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加0.5mg 6-BA、0.1mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种10g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中，于温度为27℃，通气量为0.15vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养28天，以诱导形成含白藜芦醇的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.45mg 6-BA、30g蔗糖以及0.4g脯氨酸，pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。
实施例4
本实施例的山葡萄体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的山葡萄嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3～4次。
(2)将山葡萄嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.5cm长的山葡萄茎段即外值体。
(3)将切好的山葡萄茎段接种至含有预培养基的三角瓶中进行预培养，每个三角瓶中接种3个外值体，在温度为27℃下的预培养条件下，暗培养28天，以诱导形成愈伤组织。
其中，所用预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加2.0mg 6-BA、0.2mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，然后在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下高压灭菌20min，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，在温度为25℃，光周期17h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天，以诱导愈伤组织进一步形成胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加0.5mg 6-BA、0.1mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.6，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种15g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中，于温度为25℃，通气量为0.2vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养30天，以诱导形成含白藜芦醇的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.45mg 6-BA、32g乳糖以及0.6g酵母提取物，pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。
实施例5
本实施例的山葡萄体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的山葡萄嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3～4次。
(2)将山葡萄嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.4cm长的山葡萄茎段即外值体。
(3)将切好的山葡萄茎段接种至含有预培养基的三角瓶中进行预培养，每个三角瓶中接种3个外值体，在温度为27℃下的预培养条件下，暗培养28天，以诱导形成愈伤组织。
其中，所用预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加2.0mg 6-BA、0.2mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，然后在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下高压灭菌20min，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，在温度为25℃，光周期16h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天，以诱导愈伤组织进一步形成胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加0.5mg 6-BA、0.1mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种10g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中，于温度为25℃，通气量为0.2vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养30天，以诱导形成含白藜芦醇的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.5mg 6-BA、30g蔗糖以及0.5g椰汁，pH调节为6.0后，经高压灭菌，冷凝后制得。
对比例1
本对比例的山葡萄体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的山葡萄嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3～4次。
(2)将山葡萄嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.5cm长的山葡萄茎段即外值体。
(3)将切好的山葡萄茎段接种至含有预培养基的三角瓶(容量为100ml，含30ml预培养基)中进行预培养，诱导形成愈伤组织，每个三角瓶中接种3个外值体，在温度为25℃下的预培养条件下，暗培养28天。
其中，所用预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加2.0mg 6-BA、0.2mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，然后在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下高压灭菌20min，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，以诱导愈伤组织被进一步诱导形成胚性愈伤组织，在温度为25℃，光周期16h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加0.5mg 6-BA、0.1mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种30g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中，于温度为25℃，通气量为0.2vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养30天，以诱导形成含白藜芦醇的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.5mg 6-BA、pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。
对比例2
本对比例的山葡萄体细胞胚的培养方法的步骤与对比例1相同，不同之处在于：在本对比例的步骤(5)中，所用的体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.5mg 6-BA、30g蔗糖、0.5g水解酪蛋白以及7g琼脂，pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。也就是说本对比例的分化培养基是固体培养基。
实验例
制作标准曲线:
(1)称取标准品反式白藜芦苷1mg，置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解定溶，混匀制成200μg/ml标准储备液备用。分别吸取标准储备1.0ml稀释成100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml反式白藜芦苷标准对照液。按上述方法，分别制备顺式白藜芦苷、反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇标准对照液。
(2)进样(美国Aglient1200系列高效液相色谱仪)，进样量为20μl，梯度洗脱：A相(超纯水)、B相(乙腈)；梯度洗脱条件为：0-10min内B相从5％线形增至25％，10-20min线形增至40％，20-35min线形增至100％，35-36min降到5％，与检测器检测波长为306nm下检测反式白藜芦苷标准对照液的吸光值，以反式白藜芦苷标准对照液的浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制出反式白藜芦苷的标准曲线：y＝6.7731x+3.1397，R2＝0.9996。按上述方法，在检测波长为306nm下制得顺式白藜芦苷的标准曲线：y＝2.7824x+2.0667，R2＝0.9991；在检测波长为288nm下制得反式白藜芦醇的标准曲线：y＝6.241x+4.909，R2＝0.9996，在检测波长为288nm下顺式白藜芦醇的标准曲线：y＝2.740x+2.859，R2＝0.9997。
取上述实施例1-5、对比例1-2得到的体细胞胚，检测其中的白藜芦醇含量，检测方法如下：分别取1g体细胞胚鲜样加甲醇研磨，定容至5ml，进样(美国Aglient1200系列高效液相色谱仪)，梯度洗脱：A相(超纯水)、B相(乙腈)；梯度洗脱条件为：0-10min内B相从5％线形增至25％，10-20min线形增至40％，20-35min线形增至100％，35-36min降到5％，检测器检测波长为306nm和288nm，进样量为20μl。根据测得的吸光值代入相应的标准曲线，可分别测得样品中的反式白藜芦苷、顺式白藜芦苷、反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇的浓度c，代入计算公式Y＝(c×5)/1μg/g FW，可得到每g体细胞胚中的反式白藜芦苷、顺式白藜芦苷、反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇含量，另外，白藜芦醇总含量＝反式白藜芦苷+顺式白藜芦苷+反式白藜芦醇+顺式白藜芦醇。重复3次，结果以平均值表示，检测结果见表1。
表1.由实施例1-5以及对比例1-2得到的体细胞胚中的白藜芦醇含量
注：表中小写字母表示差异显著，p<0.05，单位为μg/g FW。
由表1可以得知，本发明实施例1-5的山葡萄体细胞胚的培养方法所得到体细胞胚中的白藜芦醇含量明显地高于对比例1-2，由此表明，采用本发明提供的山葡萄体细胞胚的培养方法，特别是体细胞胚诱导培养基的使用能够明显地促进白藜芦醇在体细胞胚中的合成，提高其含量。
另外，再按上述方法检测实施例1中各阶段的组织培养物即得到愈伤组织和胚性愈伤组织中的白藜芦醇总含量，结果见表2。
表2.实施例1中各阶段的组织培养物的白藜芦醇总含量
注：表中小写字母表示差异显著，p<0.05，单位为μg/g FW。
由表2可知，经过体细胞胚诱导培养后的得到体细胞胚中的白藜芦醇总含量明显高于愈伤组织和胚性愈伤组织中，进一步表明采用本发明提供的山葡萄体细胞胚的培养方法，特别是体细胞胚诱导培养基的使用能够明显地促进白藜芦醇在体细胞胚中的合成，提高其含量。
综上，本发明所提供的山葡萄体细胞胚的培养方法，以山葡萄茎段为外植体，诱导出愈伤组织，以及进一步诱导产生胚性愈伤组织和体细胞胚，通过对不同接种量，以及体细胞诱导培养基的碳源、通气量和氮源的选择和控制，以使体细胞胚生长以及白藜芦醇合成的达到最佳状态，其对提高山葡萄组织培养物中的有效成分产率，筛选高产的细胞组织，实现白藜芦醇的大规模生产具有重要意义，同时为山葡萄细胞培养生产次生代谢产物白黎芦醇的工厂化生产和产业化开发提供材料和依据。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种山葡萄体细胞胚的培养方法，其特征在于，其包括：
取山葡萄外值体进行前诱导培养，得到山葡萄胚性愈伤组织；
按质量体积比为10～15：1的比例，将所述山葡萄胚性愈伤组织接种至体细胞胚诱导培养基中，进行体细胞胚诱导培养，得到含白藜芦醇的体细胞胚；其中，所述体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.45～0.52mg 6-BA、28～32g碳源以及0.4～0.6g氮源制成，所述体细胞胚诱导培养基的pH为5.6～6.0，所述碳源是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种，所述氮源是选自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白以及脯氨酸中的任意一种；
所述体细胞胚诱导培养的条件是：温度为23～27℃、通气量为0.15～0.25vvm的条件下暗培养28～30d；
所述前诱导培养包括：将所述山葡萄外值体于预培养基上进行预培养，得到山葡萄愈伤组织；将所述山葡萄愈伤组织于胚性诱导培养基上进行胚性诱导培养，得到所述山葡萄胚性愈伤组织；
所述胚性诱导培养基由每升MS培养基中添加0.45～0.52mg 6-BA、0.08～0.12mg NAA、28～32g蔗糖以及6.5～7.2g琼脂制成，所述胚性诱导培养基的pH为5.6～6.0，所述预培养基由每升MS培养基中添加1.8～2.1mg 6-BA、0.18～0.22mg NAA、28～32g蔗糖以及6.5～7.2g琼脂制成，所述预培养基的pH为5.6～6.0；
所述预培养是在温度为23～27℃条件下，黑暗培养28～30d；所述胚性诱导培养的条件是：温度为23～27℃、光周期为15～17h、培养时间为28～30d。
2.根据权利要求1所述的山葡萄体细胞胚的培养方法，其特征在于，所述山葡萄外值体为0.4～0.5cm长的山葡萄茎段。
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