CN106754629B - 一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用 - Google Patents

一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106754629B
CN106754629B CN201611106501.3A CN201611106501A CN106754629B CN 106754629 B CN106754629 B CN 106754629B CN 201611106501 A CN201611106501 A CN 201611106501A CN 106754629 B CN106754629 B CN 106754629B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
medium
culture medium
schisandra chinensis
somatic embryo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611106501.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106754629A (zh
Inventor
孙丹
艾军
秦洪艳
许培磊
赵滢
刘迎雪
王振兴
杨义明
范书田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Original Assignee
Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS filed Critical Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority to CN201611106501.3A priority Critical patent/CN106754629B/zh
Publication of CN106754629A publication Critical patent/CN106754629A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106754629B publication Critical patent/CN106754629B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08H6/00—Macromolecular compounds derived from lignin, e.g. tannins, humic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/74—Undefined extracts from fungi, e.g. yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用，属于五味子组织培养技术领域。本发明通过对体细胞胚诱导培养基的碳源、通气量和氮源的选择和控制，在培养的过程中，使体细胞胚生长以及木质素合成的达到最佳状态，培养得到的体细胞胚具有较高含量的木质素，本发明的五味子体细胞胚的培养方法以及由此方法得到的体细胞胚为五味子细胞培养生产次生代谢产物木质素的工厂化生产和产业化开发提供材料和依据。

Description

一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用
技术领域
本发明涉及五味子组织培养技术领域，具体而言，涉及一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用。
背景技术
五味子主产于吉林、辽宁、黑龙江、河北、山西、陕西、宁夏等北方各省的山区、半山区。五味子为常用中药之一，始载于《神农本草经》，列为上品。五味子的有效成分是木质素成分,已从五味子科植物中分离出23个联苯环辛二烯木质素类化合物,其中起主要作用的是五味子甲素、乙素、丙素、醇甲、醇乙、醋甲、醋乙、五味子酚，中医认为它具有收敛固涩、益气生津、被肾宁心的功能。近年医药学研究表明，五味子有抗疲劳、抗氧化、抗衰老、抗低温等作用，对治疗肝炎、急性肠道炎、神经衰弱、潜在克山病有一定疗效。五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)的次生代谢产物木质素是工业生产中的主要原料之一，其具有广泛的应用价值。但现有的通过直接利用五味子果实直接提取木质素的技术容易受季节以及生长周期的限制，不利于木质素工业化生产，另外现有的通过组织培养方法培养得到的用作提取木质素原料的五味子愈伤组织中的木质素含量较低，不能起到促进利用五味子愈伤组织培养物为原料提取木质素的工业化生产规模的作用。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种五味子体细胞胚的培养方法，此培养方法采用组织培养技术对五味子外植体培养得到含有木质素的体细胞胚，并且通过该培养方法得到体细胞胚含有的木质素量较高。
本发明的第二目的在于提供一种用于培养五味子体细胞胚的培养基，该培养基能够诱导五味子胚性愈伤组织分化形成含有木质素的体细胞胚，且经该培养基培养得到体细胞胚中的木质素含量较高。
本发明的第三目的在于提供一种五味子体细胞胚，其由上述培养方法培养得到，其木质素含量较高，可用作提取木质素工业化生产中的原料。
本发明的第四目的在于提供五味子体细胞胚在制备木质素中的应用，以具有较高木质素含量的五味子体细胞胚用作提取木质素的原料，有利于实现木质素的大规模生产。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种五味子体细胞胚的培养方法，其包括：
取五味子外植体进行诱导培养，得到五味子胚性愈伤组织；
将所述五味子胚性愈伤组织接种至体细胞胚诱导培养基中，进行体细胞胚诱导培养，得到含木质素的体细胞胚；
其中，体细胞胚诱导培养基由每升1/2MS培养基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源制成，体细胞胚诱导培养基pH为5.6-6.0，碳源是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种，氮源是选自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一种。
一种用于培养五味子体细胞胚的培养基，其是由每升MS培养基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源制成的体细胞胚诱导培养基，体细胞胚诱导培养基pH为5.6-6.0，碳源是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种，氮源是选自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一种。
一种五味子体细胞胚，其上述五味子体细胞胚的培养方法培养所得到。
上述五味子体细胞胚在制备木质素中的应用。
本发明提供的一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用有益效果是：本发明的五味子体细胞胚的培养方法通过对体细胞胚诱导培养基的体系优化，调整体细胞胚诱导培养基中的BA浓度为0.45-0.52mg/L、碳源的浓度为28-32g/L、氮源的浓度为0.4-0.6g/L等影响因素以使五味子胚性愈伤组织在分化成体细胞胚的过程中产生最大量的木质素，并选用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种作为碳源和选用椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一种作为氮源，进一步为体细胞胚的生长以及木质素合成的提供最佳碳源和氮源，以使得到的体细胞胚中的木质素含量最大化，进而为五味子细胞培养生产次生代谢产物木质素的工厂化生产和产业化开发提供材料和依据。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用进行具体说明。
一种五味子体细胞胚的培养方法，其包括以下步骤。
S1获取五味子胚性愈伤组织
取五味子外植体进行前诱导培养，以得到五味子胚性愈伤组织。
具体包括：
(1)将五味子外植体于预培养基上进行预培养，得到五味子愈伤组织。
其中，预培养基由每升MS培养基中添加2.8-3.2mg 2,4-D、0.18-0.22mg TDZ、28-32g蔗糖、6.8-7.2g琼脂制成，预培养基的pH值为5.6-6.0。
优选地，预培养的条件是在温度为23-27℃条件下，黑暗培养28-30d。
优选地，五味子外植体为0.4-0.5cm长的五味子茎段。需要说明的是，五味子外植体还可以是五味子的根、叶等器官组织，并不限于五味子的茎。
(2)将五味子愈伤组织于胚性诱导培养基上进行胚性诱导培养，得到五味子胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基由每升MS培养基中添加0.8-1.2mg TDZ、0.018-0.22mg ZT、28-32g蔗糖、6.8-7.2g琼脂制成，胚性诱导培养基的pH为5.6-6.0。
优选地，胚性诱导培养的条件是：温度为23-27℃、光周期为15-17h、培养时间为28-30d。
S2获取体细胞胚
(1)将五味子胚性愈伤组织接种至体细胞胚诱导培养基中，进行体细胞胚诱导培养，得到含木质素的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升1/2MS培养基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源制成，体细胞胚诱导培养基的pH为5.6-6.0。其中，碳源是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种，氮源是选自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白以及中的任意一种。
优选地，进行体细胞胚诱导培养的条件是：温度为23-27℃、通气量为0.15-0.25vvm的条件下暗培养28-30d。
优选地，按质量体积比为10-15：1的比例(指每升体细胞胚诱导培养基中接种10-15g五味子胚性愈伤组织)将五味子胚性愈伤组织接种至体细胞胚诱导培养基中。
一种五味子体细胞胚，其由上述的五味子体细胞胚的培养方法培养所得到，该五味子体细胞胚具有较高含量的木质素。
上述五味子体细胞胚在在制备木质素中的应用，五味子体细胞胚具有较高含量的木质素，可用作提取木质素的原料。
由此，本发明所提供的五味子体细胞胚的培养方法，以五味子茎段为外植体，诱导出愈伤组织，以及进一步诱导产生胚性愈伤组织和体细胞胚，通过对不同接种量，以及体细胞胚诱导培养基的碳源、通气量和氮源的选择和控制，以使体细胞胚生长以及木质素合成的达到最佳状态，其对提高五味子组织培养物中的有效成分产率，筛选高产的细胞组织，实现木质素的大规模生产具有重要意义，同时为五味子细胞培养生产次生代谢产物木质素的工厂化生产和产业化开发提供材料和依据。
需要说明的是，本发明中的2,4-D是2，4－二氯苯氧乙酸；BA是6-苄氨基腺嘌呤；TDZ是噻苯隆；ZT是玉米素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例以五味子嫣红品种的嫩茎段作为五味子外植体，五味子嫩茎段取自中国农业科学院特产研究所的国家果树种质资源圃。
本实施例的五味子体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的五味子嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3-4次。
(2)将五味子嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.5cm长的五味子茎段。
(3)将切好的五味子茎段接种至含有预培养基的三角瓶(容量为100ml，含30ml预培养基)中进行预培养，每个三角瓶中接种3个外植体，在温度为25℃的预培养条件下，暗培养28天，以诱导形成愈伤组织。
其中，预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌(指在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下灭菌20min，以下述及高压灭菌的，其灭菌条件同此)，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，在温度为25℃，光周期16h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天，以诱导愈伤组织进一步形成胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种20g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器(哈尔滨道外化玻站，气升式生物反应器，含2L体细胞胚诱导培养基)中，于温度为25℃，通气量为0.2vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养30天，以诱导形成含木质素的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升1/2MS培养基中添加0.5mgBA、30g蔗糖以及0.5g水解酪蛋白，pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。
实施例2
本实施例的五味子体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的五味子嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3-4次。
(2)将五味子嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.4cm长的五味子茎段即外植体。
(3)将切好的五味子茎段接种至含有预培养基的三角瓶中进行预培养，每个三角瓶中接种3个外植体，在温度为27℃下的预培养条件下，暗培养28天，以诱导形成愈伤组织。
其中，所用预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加3.2mg 2,4-D、0.18mg TDZ、32g蔗糖、6.8g琼脂，pH调节为5.8，然后在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下高压灭菌20min，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，在温度为25℃，光周期15h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天，以诱导愈伤组织进一步形成胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加1.2mg TDZ、0.22mg ZT、28g蔗糖、7.2g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种20g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中，于温度为23℃，通气量为0.25vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养30天，以诱导形成含木质素的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升1/2MS培养基中添加0.52mgBA、30g山梨醇以及0.6g水解乳蛋白，pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。
实施例3
本实施例的五味子体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的五味子嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3-4次。
(2)将五味子嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.5cm长的五味子茎段即外植体。
(3)将切好的五味子茎段接种至含有预培养基的三角瓶中进行预培养，每个三角瓶中接种3个外植体，在温度为27℃下的预培养条件下，暗培养28天，以诱导形成愈伤组织。
其中，所用预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加2.8mg 2,4-D、0.22mg TDZ、28g蔗糖、7.2g琼脂，pH调节为5.8，然后在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下高压灭菌20min，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，在温度为25℃，光周期16h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天，以诱导愈伤组织进一步形成胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加0.5mg BA、0.1mg NAA、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种30g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中，于温度为27℃，通气量为0.15vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养28天，以诱导形成含木质素的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.45mg BA、30g蔗糖以及0.4g椰汁，pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。
实施例4
本实施例的五味子体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的五味子嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3-4次。
(2)将五味子嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.5cm长的五味子茎段即外植体。
(3)将切好的五味子茎段接种至含有预培养基的三角瓶中进行预培养，每个三角瓶中接种3个外植体，在温度为27℃下的预培养条件下，暗培养28天，以诱导形成愈伤组织。
其中，所用预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g琼脂，pH调节为5.8，然后在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下高压灭菌20min，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，在温度为25℃，光周期17h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天，以诱导愈伤组织进一步形成胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g琼脂，pH调节为5.6，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种15g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中，于温度为25℃，通气量为0.2vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养30天，以诱导形成含木质素的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.45mg BA、32g乳糖以及0.6g酵母提取物，pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。
实施例5
本实施例的五味子体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的五味子嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3-4次。
(2)将五味子嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.4cm长的五味子茎段即外植体。
(3)将切好的五味子茎段接种至含有预培养基的三角瓶中进行预培养，每个三角瓶中接种3个外植体，在温度为27℃下的预培养条件下，暗培养28天，以诱导形成愈伤组织。
其中，所用预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g琼脂，pH调节为5.8，然后在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下高压灭菌20min，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，在温度为25℃，光周期16h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天，以诱导愈伤组织进一步形成胚性愈伤组织。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g琼脂、30g蔗糖以及7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种30g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中，于温度为25℃，通气量为0.2vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养30天，以诱导形成含木质素的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.5mg BA、30g蔗糖以及0.5g椰汁，pH调节为6.0后，经高压灭菌，冷凝后制得。
对比例1
本对比例的五味子体细胞胚的培养方法包括如下步骤：
(1)将取好的五味子嫩茎段用自来水冲洗4h，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒30s，倒出酒精，用0.1％升汞消毒5min，再用无菌水冲洗3-4次。
(2)将五味子嫩茎段放入培养皿中，用镊子及刀片在无菌条件下切成约0.5cm长的五味子茎段即外植体。
(3)将切好的五味子茎段接种至含有预培养基的三角瓶(容量为100ml，含30ml预培养基)中进行预培养，诱导形成愈伤组织，每个三角瓶中接种3个外植体，在温度为25℃下的预培养条件下，暗培养28天。
其中，所用预培养基按如下方法制得：以MS培养基为基础培养基，按每升MS培养基中添加3.0mg 2,4-D、0.2mg TDZ、30g蔗糖、7g琼脂，pH调节为5.8，然后在温度为121℃，压力为1.2kg/cm的条件下高压灭菌20min，冷凝后制得。
(4)预培养结束后，将形成的愈伤组织切成约为0.3cm×0.3cm的小块，然后转移至胚性诱导培养基中进行胚性诱导培养，以诱导愈伤组织被进一步诱导形成胚性愈伤组织，在温度为25℃，光周期16h(光照强度为30μmol·m–2·s–1)的胚性诱导培养条件下，培养28天。
其中，胚性诱导培养基是以每升MS培养基中添加1mg TDZ、0.2mg ZT、30g蔗糖、7g琼脂，pH调节为5.8，经高压灭菌，冷凝后制得。
(5)胚性诱导培养结束后，按每升体细胞胚诱导培养基接种35g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中，于温度为25℃，通气量为0.2vvm的体细胞胚诱导培养条件下，暗培养30天，以诱导形成含木质素的体细胞胚。
其中，体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.5mg BA、pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得，该体细胞胚诱导培养基未加入本发明所要求保护的碳源和氮源。
对比例2
本对比例的五味子体细胞胚的培养方法的步骤与对比例1相同，不同之处在于：在本对比例的步骤(5)中，按每升体细胞胚诱导培养基接种35g胚性愈伤组织的比例，将胚性愈伤组织接种至含有体细胞胚诱导培养基的生物反应器中；所用的体细胞胚诱导培养基由每升MS培养基中添加0.5mg BA、35g蔗糖以及0.3g椰汁，pH调节为5.8后，经高压灭菌，冷凝后制得。
实验例
制作标准曲线:
(1)称取标准品五味子醇甲1mg，置于5ml容量瓶中，用甲醇溶解定溶，混匀制成200μg/ml标准储备液备用。分别吸取标准储备1.0ml稀释成100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml五味子醇甲标准对照液。按上述方法，分别制备五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素标准对照液。
(2)进样(美国Aglient1200系列高效液相色谱仪)，进样量为20μl，梯度洗脱：A相(超纯水)、B相(甲醇)；梯度洗脱条件为：0-15min内B相从30％线形降至57％，15-38min线形增至80％，35-40min降到57％，40-45min降到30％，与检测器检测波长为254nm下检测五味子醇甲标准对照液的吸光值，以五味子醇甲标准对照液的浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制出五味子醇甲的标准曲线：y＝1421.1x-40.917，R2＝0.9997。
按上述方法，制得五味子醇乙的标准曲线：y＝1327.7x-26.492，R2＝0.9997；制得五味子酯甲的标准曲线：y＝952.77x-30.041，R2＝0.9999，制得五味子甲素的标准曲线：y＝1602.5x-32.046，R2＝0.9999，制得五味子乙素的标准曲线：y＝1440.3x-65.537，R2＝0.9994，制得五味子丙素的标准曲线：y＝1216.1x-27.549，R2＝0.9999。
取上述实施例1-5、对比例1-2得到的体细胞胚，检测其中的木质素含量，检测方法如下：分别取1g体细胞胚鲜样加甲醇研磨，定容至5ml，进样(美国Aglient1200系列高效液相色谱仪)，梯度洗脱：A相(超纯水)、B相(甲醇)；梯度洗脱条件为：0-15min内B相从30％线形降至57％，15-38min线形增至80％，35-40min降到57％，40-45min降到30％，检测器检测波长为254nm，进样量为20μl。根据测得的吸光值代入相应的标准曲线，可分别测得样品中的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的浓度c，代入计算公式Y＝(c×5)/1×100％，可得到每g体细胞胚中的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素含量，另外，木质素总含量＝五味子醇甲+五味子醇乙+五味子酯甲+五味子甲素+五味子乙素+五味子丙素。重复3次，结果以平均值表示，检测结果见表1。
表1.由实施例1-5以及对比例1-2得到的体细胞胚中的木质素含量
注：表中小写字母表示差异显著，p<0.05，单位为％。
由表1可以得知，本发明实施例1-5的五味子体细胞胚的培养方法所得到体细胞胚中的木质素含量明显地高于对比例1-2，由于对比例1中的体细胞胚诱导培养基没有加入本发明所要求保护的碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种)和氮源(椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一种)，所以导致对比例1得到的体细胞胚中的木质素含量低于实施例1-5，另外，虽然对比例2所用的体细胞胚诱导培养基加入有本发明所要求保护的碳源(35g蔗糖)和氮源(0.3g椰汁)，但其所用碳源和氮源的加入量并不在本发明所要求的碳源(28-32g)和氮源(0.4-06g)保护范围内，导致对比例2得到的体细胞胚中的木质素含量仍然低于实施例1-5。由此表明，采用本发明提供的五味子体细胞胚的培养方法，特别是含碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种)和氮源(椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白、水解乳蛋白以及脯氨酸中的任意一种)的体细胞胚诱导培养基的使用能够明显地促进木质素在体细胞胚中的合成，提高其含量。
另外，再按上述检测方法检测实施例1中各阶段的组织培养物即得到愈伤组织和胚性愈伤组织中的木质素总含量，结果见表2。
表2.实施例1中各阶段的组织培养物的木质素总含量
注：表中小写字母表示差异显著，p<0.05，单位为％，“-”代表未检出。
由表2可知，经过体细胞胚诱导培养后的得到体细胞胚中的木质素总含量明显高于愈伤组织和胚性愈伤组织中，进一步表明采用本发明提供的五味子体细胞胚的培养方法，特别是体细胞胚诱导培养基的使用能够明显地促进木质素在体细胞胚中的合成，提高其含量。
综上，本发明所提供的五味子体细胞胚的培养方法，以五味子茎段为外植体，诱导出愈伤组织，以及进一步诱导产生胚性愈伤组织和体细胞胚，通过对不同接种量，以及体细胞诱导培养基的碳源、通气量和氮源的选择和控制，以使体细胞胚生长以及木质素合成的达到最佳状态，其对提高五味子组织培养物中的有效成分产率，筛选高产的细胞组织，实现木质素的大规模生产具有重要意义，同时为五味子细胞培养生产次生代谢产物木质素的工厂化生产和产业化开发提供材料和依据。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种五味子体细胞胚的培养方法，其特征在于，其包括：
取五味子外植体进行前诱导培养，得到五味子胚性愈伤组织；
将所述五味子胚性愈伤组织接种至体细胞胚诱导培养基中，进行体细胞胚诱导培养，得到含木质素的体细胞胚；
其中，所述体细胞胚诱导培养基由每升1/2 MS培养基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源制成，所述体细胞胚诱导培养基的pH为5.6-6.0，所述碳源是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种，所述氮源是选自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的五味子体细胞胚的培养方法，其特征在于，所述体细胞胚诱导培养的条件是：温度为23-27℃、通气量为0.15-0.25vvm的条件下暗培养28-30d。
3.根据权利要求1所述的五味子体细胞胚的培养方法，其特征在于，所述前诱导培养包括：
将所述五味子外植体于预培养基上进行预培养，得到五味子愈伤组织；
将所述五味子愈伤组织于胚性诱导培养基上进行胚性诱导培养，得到所述五味子胚性愈伤组织。
4.根据权利要求3所述的五味子体细胞胚的培养方法，其特征在于，所述胚性诱导培养基由每升MS培养基中添加0.8-1.2mg TDZ、0.018-0.22mg ZT、28-32g蔗糖、6.8-7.2g琼脂制成，所述胚性诱导培养基的pH为5.6-6.0，所述预培养基由每升MS培养基中添加2.8-3.2mg2,4-D、0.18-0.22mg TDZ、28-32g蔗糖、6.8-7.2g琼脂制成，所述预培养基的pH为5.6-6.0。
5.根据权利要求4所述的五味子体细胞胚的培养方法，其特征在于，所述预培养是在温度为23-27℃条件下，黑暗培养28-30d；所述胚性诱导培养的条件是：温度为23-27℃、光周期为15-17h、培养时间为28-30d。
6.根据权利要求1所述的五味子体细胞胚的培养方法，其特征在于，按质量体积比为10-15：1的比例，将所述五味子胚性愈伤组织接种至所述体细胞胚诱导培养基中。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的五味子体细胞胚的培养方法，其特征在于，所述五味子外植体为0.4-0.5cm长的五味子茎段。
8.一种用于培养五味子体细胞胚的培养基，其特征在于，其是由每升1/2 MS培养基中添加0.45-0.52mg BA、28-32g碳源以及0.4-0.6g氮源制成的体细胞胚诱导培养基，所述体细胞胚诱导培养基的pH为5.6-6.0，所述碳源是选自葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖以及山梨醇中的任意一种，所述氮源是选自椰汁、酵母提取物、水解酪蛋白以及水解乳蛋白中的任意一种。
CN201611106501.3A 2016-12-05 2016-12-05 一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用 Active CN106754629B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611106501.3A CN106754629B (zh) 2016-12-05 2016-12-05 一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611106501.3A CN106754629B (zh) 2016-12-05 2016-12-05 一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106754629A CN106754629A (zh) 2017-05-31
CN106754629B true CN106754629B (zh) 2019-12-20

Family

ID=58874340

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611106501.3A Active CN106754629B (zh) 2016-12-05 2016-12-05 一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106754629B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111557240A (zh) * 2020-04-24 2020-08-21 中国科学院昆明植物研究所 一种厚朴胚性细胞快速繁殖的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1737128A (zh) * 2005-08-12 2006-02-22 中国林业科学研究院林业研究所 通过体胚发生途径建立五叶地锦高频再生体系的方法
CN1915002A (zh) * 2006-09-04 2007-02-21 中国科学院植物研究所 诱导落叶松属植物胚性愈伤组织的方法及其专用培养基
CN101904302A (zh) * 2010-07-13 2010-12-08 沈阳农业大学 一种药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1737128A (zh) * 2005-08-12 2006-02-22 中国林业科学研究院林业研究所 通过体胚发生途径建立五叶地锦高频再生体系的方法
CN1915002A (zh) * 2006-09-04 2007-02-21 中国科学院植物研究所 诱导落叶松属植物胚性愈伤组织的方法及其专用培养基
CN101904302A (zh) * 2010-07-13 2010-12-08 沈阳农业大学 一种药用植物北五味子体细胞胚发生和植株再生方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
甘草毛状根培养体系研究;谢丽琼等;《食品工业科技》;20110531(第5期);第200-205页 *
葡萄体细胞胚的诱导及保存;王雅梅等;《农业工程学报》;20040731;第20卷;第30-33页 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111557240A (zh) * 2020-04-24 2020-08-21 中国科学院昆明植物研究所 一种厚朴胚性细胞快速繁殖的方法
CN111557240B (zh) * 2020-04-24 2022-03-22 中国科学院昆明植物研究所 一种厚朴胚性细胞快速繁殖的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106754629A (zh) 2017-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105886405B (zh) 铁皮石斛内生真菌及其应用
CN110982868B (zh) 一种提高灵芝三萜含量的共培养方法及应用
CN110004066B (zh) 一种神秘灵芝新菌种及其人工栽培方法和应用
CN113564212A (zh) 一种利用微生物发酵法提取杜仲叶多糖的方法
CN106754629B (zh) 一种五味子体细胞胚及其培养方法、培养基及应用
CN111642400A (zh) 一种江西铅山红芽芋多倍体包埋诱导的方法
CN109722390B (zh) 一种猴头杜鹃菌根真菌菌株dps-a的分离纯化及其接种应用方法
CN105331548B (zh) 一种紫丁香蘑菌株及其液体菌种与制备方法
CN104893978B (zh) 一株雨生红球藻enn71及其培养方法与应用
CN104372034B (zh) 一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法
TWI422680B (zh) 用以培養牛樟芝子實體之培養基及其培養方法
CN106244517B (zh) 一种山葡萄体细胞胚及其培养方法、培养基及应用
CN114767757B (zh) 一种复方中草药副产物的精准发酵方法及其应用
CN105769938B (zh) 一株淡褐奥德蘑及其应用
CN111134010A (zh) 一种具有高抗氧化活性的西洋参不定根制备方法
CN108575556B (zh) 一种猴头菌株及其选育方法
CN103146638B (zh) 一种珊瑚菜毛状根的诱导增殖方法
CN106399121B (zh) 一种紫色红曲菌菌株
CN109042335A (zh) 一种快速生产葡萄脱毒种苗的培养基及组培量产方法
CN104396758A (zh) 铁皮石斛胚状体培养工艺
Liu et al. Improvement of adventitious root formation in Sedum aizoon L. and the production of flavonoids
CN102943103B (zh) 青霉属真菌m1及其在提高人参或西洋参发酵过程中皂苷类化合物产量中的应用
CN111961594A (zh) 黄蓝状菌sh16在提高杨树干旱胁迫耐受性中的应用
Hwang Catapol production in Chinese foxglove (Rehmannia glutinosa Libos.) hairy roots transformed with Agrobacterium rhizogenes ATCC15834
CN110669606A (zh) 一种酿酒用有机窖泥及其制作工艺

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20170531

Assignee: Foshan Aiweidun Technology Co.,Ltd.

Assignor: INSTITUTE OF SPECIAL ANIMAL AND PLANT SCIENCES OF CAAS

Contract record no.: X2023980032400

Denomination of invention: A kind of Schisandra chinensis somatic embryo and its culture method, medium and application

Granted publication date: 20191220

License type: Common License

Record date: 20230223

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract