CN100593367C - 一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法，该方法以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为原始材料，对外植体进行愈伤组织诱导、继代培养，建立悬浮细胞系，通过悬浮细胞系诱导不定根，通过不定根的稳定性培养、继代保存、培养条件优化，即可用于扩大培养生产雷公藤甲素和生物碱。该方法得到的不定根中雷公藤甲素和总生物碱的含量分别为根皮粉的13倍和1.8倍，培养液中雷公藤甲素产量占55～60%，总生物碱产量占60～65%。利用该方法生产雷公藤甲素和总生物碱，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。

Description

一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法

技术领域

本发明涉及一种雷公藤不定根培养方法，特别是一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法，该方法生产的雷公藤不定根中所含的雷公藤甲素和总生物碱相对较高，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)系卫矛科雷公藤属植物，在我国很早以前就用于医学和防治各种害虫，为著名的杀虫植物之一。民间多用于防治蔬菜害虫，故有“菜药”之称。其对多种害虫有效。传统中医上可用于治疗肿胀、水肿、黄白疽、痢疾等，具有明显的抗肿瘤、抗风湿作用。雷公藤属多年生木质藤本、生长缓慢、处于野生状态，因用根入药，大量应用使资源遭到破坏。

雷公藤根中的活性成分含量显著高于其他部位，是主要药用部位。现已从中分离出70多种化学成分，其中雷公藤甲素又称雷公藤内酯醇，是中药雷公藤的主要有效成分之一，作为免疫抑制药物，可应用于许多自身免疫性疾病的治疗，同时它又是一种毒性成分。雷公藤生物碱具有明显的体液和细胞免疫抑制作用，也是治疗类风湿性关节炎的有效成分。在农业害虫防治中，雷公藤甲素有较好的触杀活性，雷公藤总生物碱有较好的胃毒毒杀活性和拒食活性。这些有效成分均为次生代谢产物，在雷公藤植株内含量很低，在其他植物内的含量更低，虽然可通过化学分离提取获得产品，但受气候、土壤、分布等因素及有效成分含量、原料、季节等条件的限制，生产受到一定的限制，加上人类对自然的过度开发，资源受到破坏，提取量很有限。

雷公藤细胞培养生产有效成分在国内外已进行了大量研究。在国内，尹作鸿等人从雷公藤的茎、叶诱导出愈伤组织，并进行了组织培养，从中分离得到雷公藤甲素、雷公藤乙素等二萜内酯化合物。曹华兴等(2002年)申请发明专利提出采用悬浮法培养雷公藤植物细胞而生产雷公藤总生物碱的方法，该方法得到的产物所含雷公藤总生物碱的含量为植物体的2.9倍。在国外，早在1980年美国乔治顿大学生物学Dujack L W等采用细胞悬浮培养法，并报告了组织培养中前体的影响。与此同时，加拿大学者J.P Kutney等也用雷公藤茎叶进行组织培养成功，把雷公藤内酯醇和雷公藤内酯二醇的产最较根中含量分别提高了3倍和16倍，并探索以托品类(Terpenoids)作为前体物促进雷公藤内酯二醇的生物合成。M Mjsawa等(1982年)报告了用含蔗糖和植物激素的琼脂对雷公藤进行组织培养结果，经培养后的细胞所含雷公藤内酯二醇比原植物含量高10倍。日木Kyowa Hakko kogyo公司也为组织培养生产雷公藤内酯醇和雷公藤内酯二醇申请专利。这些对雷公藤细胞培养的研究从不同方面进行了有益的探索，但远未达到工业化生产的水平。而关于雷公藤不定根悬浮培养法生产雷公藤甲素和总生物碱的方法尚未见到报道。

一般来说，植物的次生代谢产物在已经分化的组织中含量较高，且器官培养相对比较稳定，因此采用苗或根培养的方法是生产次生代谢产物的另一条途径。根培养对植物有着特殊的意义，因为许多植物次生代谢物均来自于根部。但工业化培养生产根类的实例并不多，韩国目前在高丽参根类培养方面已经取得了突破性进展，采用了5～10t的反应器，并以培养的根为原料开发了系列产品。用有一定的器官分化的不定根作为悬浮培养的材料，生产其代谢产物，要比细胞培养有效成分要高得多，但不定根的诱导需要克服更多技术上的困难，并非所有植物均可进行不定根诱导。

植物细胞全能性的设想于1902年提出，1948年得到了证实，这为进行植物组织培养工作奠定了理论基础，自从1956年Routine和Nickel首次申请用植物组织培养生产有用次生代谢产物的专利以来，应用细胞培养生产有用的次生物质的研究取得了很大的进展。大量研究成果证明，通过植物细胞发酵培养产生有用的次生代谢产物越来越显示出巨大的应用潜力。利用植物细胞培养生产次生代谢产物不受地理、季节变换和各种环境因素的影响；可节省土地，降低成本，缩短生产周期；可以提供一种标准化的生产过程，该过程可以连续生产，产品的质量和产量稳定，便于实行工业化生产，已是解决各种有效成分含量低的植物资源利用的主要途径。这是本申请的试验基础和理论基础。

发明内容

为了保护雷公藤的自然资源，本发明的目的在于提供由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体；用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含70％质量分数的酒精消毒20s，然后以无菌水冲洗4次，再用1g/L HgCl₂消毒4min，无菌水冲洗4次；

步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为：MS+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(0.1～0.5)mg/L KT，pH值为5.8，并在培养基中加入蔗糖30g/L，培养室温度为25±1℃，保持每天12小时的光照，光照强度为1000～1500lx，20～30天后形成愈伤组织；

步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，40～45天继代一次，连续继代5代，培养基组成为：6，7-V+1.0mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT；

步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为5％～10％(w/v)，接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为NT+1.0mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT，选择250mL三角瓶，装培养基100mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为：温度25+1℃，自然光照，摇床转速120转/分钟，每25～30天继代培养一次，连续继代培养3次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系；

步骤五，用对数期生长的雷公藤悬浮细胞系，选取直径在1mm以下、分散性好、颗粒状雷公藤悬浮细胞系转接在NT培养基上进行不定根的诱导，接种量为鲜重5g/L～10g/L，NT培养基的组成为：NT+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(2～6)mg/L NAA+(0.1～0.5)mg/L KT，培养30天可产生不定根，继续培养至45天，有85％的细胞团产生长度为0.5cm～3cm的不定根；

步骤六，不定根的稳定性培养：继代时在超净工作台上，挑选步骤五诱导的不定根中，根长度为1cm～2cm、细胞团直径在2mm以下、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，进行继代培养，在步骤五相同培养基上连续培养5代以上，即可形成稳定的不定根培养体系；同时将筛选的生长旺盛、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，继代保存在附加0.5～1.0mg/L 2，4-D、NAA 2～6mg/L，KT 0.1～0.5mg/L，蔗糖30～40g/L，pH值为5.8的MS培养基中，35天继代一次；

步骤七，对不定根进行生产培养时，在NT培养基中加入0.5～1.0mg/L2，4-D、NAA 2～6mg/L，KT 0.1～0.5mg/L，蔗糖25g/L，pH值为6.4，培养至第35天时加入经过滤灭菌的AgNO₃(5～10)mg/L，培养至第50天收获。

本发明的方法得到的不定根，其中雷公藤甲素和总生物碱的含量分别为根皮粉的13倍和1.8倍，培养液中雷公藤甲素产量占55～60％，总生物碱产量占60～65％。利用该方法生产雷公藤甲素和总生物碱，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。

附图说明

图1为本发明的试验流程图；

以下结合附图对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

参见图1，依照本发明的技术方案，由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法，具体包括下列步骤：

1.愈伤组织诱导：以雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)一年生枝条扦插形成的不定根为外植体，用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含70％质量分数的酒精消毒20s，无菌水冲洗4次，再用1g/L HgCl₂消毒4min，无菌水冲洗4次；

将不定根的幼根切成0.7cm左右小段，接种在MS+0.5～1.0mg/L 2，4-D+0.1～0.5mg/L KT培养基上，pH值为5.8，蔗糖30g/L，培养室温度25℃±1℃，每天保持12小时光照，光照强度为1000～1500lx，20～30d后形成愈伤组织。愈伤组织在6，7-V+0.5～1.0mg/L 2，4-D+0.1～0.5mg/LKT培养基上，40d～45d继代一次，连续继代5代。

2.悬浮系的建立：挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为5％～10％(w/v)，接种在NT+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(0.1～0.5)mg/L KT培养基上，250mL三角瓶，装液体培养基100mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为：温度25℃+1℃，自然光照，摇床转速120转/分钟，每25d～30d继代一次，连续继代培养3次以上，获得雷公藤悬浮细胞系；

3.不定根的诱导：用对数期生长的悬浮细胞，选取直径在1mm以下、分散性好、颗粒状悬浮细胞系，转接在培养基上，培养基的组成为：NT+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(2～6)mg/L NAA+(0.1～0.5)mg/L KT，接种量为鲜重(5～10)g/L，培养30d开始有不定根产生，继续培养至40d，85％的细胞团产生长度为0.5～3cm的不定根。

4.不定根的稳定性培养：继代时在超净工作台上，挑选上述诱导的不定根中长度在1cm～2cm、细胞团直径在2mm以下、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，进行继代培养，在相同培养基上连续培养5代以上，即可形成稳定的不定根培养体系。

5.不定根的液体继代保存：将步骤4筛选的生长旺盛、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，继代保存在附加0.5～1.0mg/L 2，4-D、NAA 2～6mg/L，KT 0.1～0.5mg/L，蔗糖30～40g/L，pH值为5.8的MS培养基中，35d继代一次。

6.促进雷公藤甲素和总生物碱合成的培养条件优化：对不定根进行生产培养时，在NT培养基中加入0.5～1.0mg/L 2，4-D、NAA 2～6mg/L，KT 0.1～0.5mg/L，蔗糖25g/L，pH值为6.4，培养至第35天时加入5～10mg/L AgNO₃(过滤灭菌)，培养至第50天收获。

7.不定根、培养液中雷公藤甲素和总生物碱的提取：将培养45d的不定根过滤，在60℃烘干，培养液自然风干至1/3时，按雷公藤甲素的提取方法，如《中草药》，2005，36(7)，1065-1068记载的方法提取雷公藤甲素，按雷公藤总生物碱的提取方法，如《中国中药杂志》1995，20(3)：145-147记载的方法提取总生物碱。

根据申请人的试验结果表明，按照本发明的方法生产的不定根中雷公藤甲素含量为44.76μg/g，雷公藤总生物碱为3.59mg/g，在过滤细胞后的培养液中雷公藤甲素含量为1.24μg/mL、总生物碱含量为147.69μg/mL。每100mL培养液培养细胞后，培养液中雷公藤甲素产量占55～60％，总生物碱产量占60～65％。

雷公藤不定根与根皮粉质量比较：仅培养1g不定根得到的雷公藤甲素就为1g根皮粉的13倍，总生物碱的1.8倍。对本发明所得不定根提取物对小菜蛾3龄幼虫的杀虫活性测定表明，其致死中浓(LD₅₀)是根皮粉的1/2。

以下是申请人给出的相关试验：

实施例1不定根及培养液中雷公藤甲素、总生物碱含量的测定

精密称取冷冻干燥后的雷公藤根皮粉、不定根1.000g，置磨口三角瓶中，加入乙酸乙酯20mL浸泡过夜，超声提取40min，过中性氧化铝柱(含3g中性氧化铝，玻璃柱d＝1.0cm)，然后用20mL乙酸乙酯进行洗脱，合并洗脱液，减压回收乙酸乙酯至干，用45％甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，待用。

培养液提取：取培养液100mL，自然风干至1/3时，用乙酸乙酯以1∶1的比例在分液漏斗中混合，经三次萃取，合并乙酸乙酯相，过中性氧化铝柱，适量乙酸乙酯洗脱，减压回收乙酸乙酯至干，用45％甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，用于测定雷公藤甲素和总生物碱。

雷公藤甲素的含量测定采用高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇∶水(45∶55)；流速：1mL/min；检测波长：218nm。

雷公藤总生物碱含量的测定采用紫外分光光度法，将提取液用45％甲醇稀释10～30倍，用分光光度计在268nm处测定吸光度值。

检测结果：

(1)根皮粉中雷公藤甲素含量为9.89μg/g，总生物碱为5.01mg/g；

(2)雷公藤不定根中雷公藤甲素含量为44.76μg/g，总生物碱为3.59mg/g。每100mL培养基可培养不定根1.3～1.5g，则100mL培养基培养的不定根中雷公藤甲素和总生物碱产量分别为58.188μg和4.667mg(按1.3g计算)；

(3)在过滤不定根后的培养液中雷公藤甲素和总生物碱含量分别为1.24μg/mL和147.69μg/mL。每100mL培养基培养细胞后，培养液至少60mL(按60mL计算)，则培养液中含雷公藤甲素和总生物碱至少分别为74.4μg和8.8814mg。

据上述数据计算可得，培养液中雷公藤甲素和总生物碱产量分别各占总产量的56％和65％；培养1g不定根，培养产物中的雷公藤甲素为1g根皮粉的10倍、总生物碱的2倍。

实施例2：不定根及培养液提取物对小菜蛾幼虫生长发育的抑制活性测定

将雷公藤根皮粉、不定根培养物及培养液分别提取，提取物均分别用丙酮定容至(干样)10mg/mL，待用。

取干净的甘蓝叶片分别在前述样品液中浸渍处理，晾干后分别饲喂试虫(小菜蛾3龄幼虫)，以丙酮处理为对照，连续饲喂72h。每样品处理重复3次，每重复10头试虫。分别于处理后24，48，72h称量幼虫体重，计算相对生长率。相对生长率(mg.mg^-1.d^-1)＝体重增加量(mg)/[平均体重(mg)×取食时间(d)]。

试验结果表明：不同提取物的甘蓝叶片饲喂小菜蛾3龄幼虫后，对幼虫的生长均有明显的抑制作用(表1)，各处理组幼虫的体重、体重增加量和相对生长率均明显低于对照。其中不定根提取物处理后小菜蛾体重增加量均为负值，24h后部分试虫死亡，48h后已不再取食，72h后70％左右已经死亡，存活的已经几乎不动，幼虫长度仅为对照的1/5左右，体重比试验前下降了18.33％。

表1不同类型雷公藤样品提取物对小菜蛾幼虫生长发育的影响

实施例3：不定根及培养液提取物对小菜蛾3龄幼虫的胃毒毒杀活性测定

将雷公藤根皮粉及不定根培养物，冷冻干燥后，取1g，加入乙酸乙酯20mL超声提取40min，过滤后，挥干乙酸乙酯，提取物用丙酮稀释成1，5，10，25，50，100mg/mL的溶液，培养液提取物稀释成培养液和丙酮的体积比为1，5，10，20，40，80，100ml/mL，采用叶碟法测定其毒杀活性。采用Visual Basic 6.0程序求出毒杀曲线。

试验结果表明：不同提取物对小菜蛾3龄幼虫均具有明显的毒杀作用(表2)，其中不定根毒杀作用最强，LD₅₀(致死中浓)为6.72mg/mL，而根皮粉提取物对小菜蛾3龄幼虫的胃毒毒杀LD₅₀为13.13mg/mL，仅为根培养物活性的1/2左右。

表2不同类型雷公藤样品对小菜蛾幼虫的毒杀作用(48h)

供试样品	回归方程	LD<sub>50</sub>(mg/mL)	95％置信限	相关系数r
					根皮	y＝3.6865+1.1747x	13.1280	9.392～20.538	0.9844
不定根	y＝3.7824+1.4715x	6.7217	4.642～8.733	0.9911
					培养液	y＝3.5637+1.3624x	11.3106	7.371～17.355	0.9827

Claims (1)

1.一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：

步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体，用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含70％质量分数的酒精消毒20s，然后以无菌水冲洗4次，再用1g/L HgCl₂消毒4min，无菌水冲洗4次；

步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为：MS+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(0.1～0.5)mg/L KT，pH值为5.8，并在培养基中加入蔗糖30g/L，培养室温度为25±1℃，保持每天12小时的光照，光照强度为1000～1500lx，20～30天后形成愈伤组织；

步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，40～45天继代一次，连续继代5代，培养基组成为：6，7-V+1.0mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT；

步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为5％～10％(w/v)，接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为NT+1.0mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT，选择250mL三角瓶，装培养基100mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为：温度25+1℃，自然光照，摇床转速120转/分钟，每25～30天继代培养一次，连续继代培养3次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系；

步骤五，用对数期生长的雷公藤悬浮细胞系，选取直径在1mm以下、分散性好、颗粒状雷公藤悬浮细胞系转接在NT培养基上进行不定根的诱导，接种量为鲜重5g/L～10g/L，NT培养基的组成为：NT+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(2～6)mg/L NAA+(0.1～0.5)mg/L KT，培养30天可产生不定根，继续培养至45天，有85％的细胞团产生长度为0.5cm～3cm的不定根；

步骤六，不定根的稳定性培养：继代时在超净工作台上，挑选步骤五诱导的不定根中，根长度为1cm～2cm、细胞团直径在2mm以下、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，进行继代培养，在步骤五相同培养基上连续培养5代以上，即可形成稳定的不定根培养体系；同时将筛选的生长旺盛、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，继代保存在附加0.5～1.0mg/L 2，4-D、NAA 2～6mg/L，KT 0.1～0.5mg/L，蔗糖30～40g/L，pH值为5.8的MS培养基中，35天继代一次；

步骤七，对不定根进行生产培养时，在NT培养基中加入0.5～1.0mg/L2，4-D、NAA 2～6mg/L，KT 0.1～0.5mg/L，蔗糖25g/L，pH值为6.4，培养至第35天时加入经过滤灭菌的AgNO₃(5～10)mg/L，培养至第50天收获。

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