JPH0928392A - タキサン型ジテルペンの製造方法 - Google Patents
タキサン型ジテルペンの製造方法Info
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- JPH0928392A JPH0928392A JP18020695A JP18020695A JPH0928392A JP H0928392 A JPH0928392 A JP H0928392A JP 18020695 A JP18020695 A JP 18020695A JP 18020695 A JP18020695 A JP 18020695A JP H0928392 A JPH0928392 A JP H0928392A
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- Japan
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- taxane
- type diterpene
- producing
- carbon atoms
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織
又は細胞を細胞内カルシウム濃度を上昇させうる化合物
及び／又はプロテインキナーゼＣを活性化させうる化合
物の存在下に培養し、得られる培養物及び／又は培地か
らタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタ
キサン型ジテルペンの製造方法。 【効果】 本発明の方法は、タキサン型ジテルペンの生
産性の向上を可能にする。
又は細胞を細胞内カルシウム濃度を上昇させうる化合物
及び／又はプロテインキナーゼＣを活性化させうる化合
物の存在下に培養し、得られる培養物及び／又は培地か
らタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタ
キサン型ジテルペンの製造方法。 【効果】 本発明の方法は、タキサン型ジテルペンの生
産性の向上を可能にする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等
の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型
ジテルペンの製造法に関する。
の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型
ジテルペンの製造法に関する。
【０００２】
【従来技術】卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用
であるタキソール(Taxol)は、イチイ科イチイ属植物で
あるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia NUTT)より
単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と関
連する複雑なエステルグループを有している。タキソー
ルはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在
し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されている。
現在、タキソールは天然のまたは栽培された植物体中か
ら採取されているが、イチイ属植物は地上２０ｃｍの高
さに成長するのに１０年以上かかる生育の遅い植物であ
り、また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことから容易に
大量のタキソールを得ることは困難である。もし、タキ
ソールまたはタキソールの前駆物質であるバッカチンII
I等のタキサン型ジテルペンを組織培養を利用して生産
する事ができれば、樹木を伐採する事なく、大量のタキ
ソールを容易に得ることができるので有利である。
であるタキソール(Taxol)は、イチイ科イチイ属植物で
あるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia NUTT)より
単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と関
連する複雑なエステルグループを有している。タキソー
ルはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在
し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されている。
現在、タキソールは天然のまたは栽培された植物体中か
ら採取されているが、イチイ属植物は地上２０ｃｍの高
さに成長するのに１０年以上かかる生育の遅い植物であ
り、また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことから容易に
大量のタキソールを得ることは困難である。もし、タキ
ソールまたはタキソールの前駆物質であるバッカチンII
I等のタキサン型ジテルペンを組織培養を利用して生産
する事ができれば、樹木を伐採する事なく、大量のタキ
ソールを容易に得ることができるので有利である。
【０００３】これまでの植物の培養細胞を利用したタキ
ソール生産方法については、タイヘイヨウイチイ（Taxu
s brevifolia NUTT）培養細胞によるタキソール生産が
米国で特許〔US Patent:5019504〕になっているが、そ
のタキソール生産量は1〜3mg/lと記載されており、工業
的生産には不十分である。また、細胞培養によるタキソ
ールの生産性は不安定であり、選抜で一次的に生産性の
高い細胞が得られても、継代培養してその含量を維持す
ることは難しい〔E.R.M.Wickremesine et al.,World Co
ngress on Cell and Tissue Culture(1992)〕。
ソール生産方法については、タイヘイヨウイチイ（Taxu
s brevifolia NUTT）培養細胞によるタキソール生産が
米国で特許〔US Patent:5019504〕になっているが、そ
のタキソール生産量は1〜3mg/lと記載されており、工業
的生産には不十分である。また、細胞培養によるタキソ
ールの生産性は不安定であり、選抜で一次的に生産性の
高い細胞が得られても、継代培養してその含量を維持す
ることは難しい〔E.R.M.Wickremesine et al.,World Co
ngress on Cell and Tissue Culture(1992)〕。
【０００４】一方、タキソール生産法の先行技術として
は、タキソール生合成前駆体であるバッカチンIII(bacc
atin III)からの半合成法がHoltonらの米国特許に開示
されている〔US Patent:5015744〕。植物の組織培養法
を用いれば、バッカチンIII等の半合成原料の生産も可
能であり、本法によるタキソール生産にも有利である。
は、タキソール生合成前駆体であるバッカチンIII(bacc
atin III)からの半合成法がHoltonらの米国特許に開示
されている〔US Patent:5015744〕。植物の組織培養法
を用いれば、バッカチンIII等の半合成原料の生産も可
能であり、本法によるタキソール生産にも有利である。
【０００５】
【発明の目的】本発明の目的は、植物組織培養により、
タキサン型ジテルペンの簡便な製造法を提供することで
ある。
タキサン型ジテルペンの簡便な製造法を提供することで
ある。
【０００６】
【課題を達成するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織及
び／又は細胞を、細胞内カルシウム濃度を上昇させうる
化合物及び／又はプロテインキナーゼＣを活性化させう
る化合物の存在下に培養を行うと、タキサン型ジテルペ
ンの生産性が向上することを見いだし、本発明を完成す
るに至った。
の結果、タキサン型ジテルペンを産生する植物の組織及
び／又は細胞を、細胞内カルシウム濃度を上昇させうる
化合物及び／又はプロテインキナーゼＣを活性化させう
る化合物の存在下に培養を行うと、タキサン型ジテルペ
ンの生産性が向上することを見いだし、本発明を完成す
るに至った。
【０００７】すなわち、本発明はタキサン型ジテルペン
を産生する植物の組織及び／又は細胞を細胞内カルシウ
ム濃度を上昇させうる化合物及び／又はプロテインキナ
ーゼＣを活性化させうる化合物の存在下に培養し、得ら
れる培養物及び／又は培地からタキサン型ジテルペンを
回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造
方法である。
を産生する植物の組織及び／又は細胞を細胞内カルシウ
ム濃度を上昇させうる化合物及び／又はプロテインキナ
ーゼＣを活性化させうる化合物の存在下に培養し、得ら
れる培養物及び／又は培地からタキサン型ジテルペンを
回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造
方法である。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。タキサン
型ジテルペンとしては、タキサン骨格を有するジテルペ
ンであれば特に制限はなく、例えばタキソール、１０−
デアセチルタキソール、７−エピタキソ−ル、バッカチ
ンIII、１０−デアセチルバッカチンIII、７−エピバッ
カチンIII、セファロマニン、１０−デアセチルセファ
ロマニン、７−エピセファロマニン、バッカチンＶＩ、
タキソールＣ、１０−デアセチルタキソールＣ、タキサ
ギフィン及びその類縁体、タキサン １ａ及びその類縁
体、キシロシルセファロマニン、キシロシルタキソール
等が挙げられる。
型ジテルペンとしては、タキサン骨格を有するジテルペ
ンであれば特に制限はなく、例えばタキソール、１０−
デアセチルタキソール、７−エピタキソ−ル、バッカチ
ンIII、１０−デアセチルバッカチンIII、７−エピバッ
カチンIII、セファロマニン、１０−デアセチルセファ
ロマニン、７−エピセファロマニン、バッカチンＶＩ、
タキソールＣ、１０−デアセチルタキソールＣ、タキサ
ギフィン及びその類縁体、タキサン １ａ及びその類縁
体、キシロシルセファロマニン、キシロシルタキソール
等が挙げられる。
【０００９】タキサン型ジテルペンを産生する植物とし
ては、例えばセイヨウイチイ(Taxusbaccata LINN)、イ
チイ(T. cuspidata SIEB.et ZUCC)、キャラボク(T. cus
pidata SIEB.et ZUCC var. nana REHDER)、タイヘイヨ
ウイチイ(T. brevifolia NUTT)、カナダイチイ(T. cana
densis MARSH)、中国イチイ(T. chinensis)、T.media等
のイチイ属植物を挙げる事ができる。
ては、例えばセイヨウイチイ(Taxusbaccata LINN)、イ
チイ(T. cuspidata SIEB.et ZUCC)、キャラボク(T. cus
pidata SIEB.et ZUCC var. nana REHDER)、タイヘイヨ
ウイチイ(T. brevifolia NUTT)、カナダイチイ(T. cana
densis MARSH)、中国イチイ(T. chinensis)、T.media等
のイチイ属植物を挙げる事ができる。
【００１０】前記植物の培養は本発明により、植物の組
織及び／又は細胞を細胞内カルシウム濃度を上昇させう
る化合物及び／又はプロテインキナーゼＣを活性化させ
うる化合物の存在下に培養を行う事以外は、従来から知
られている方法によって行うことができる。
織及び／又は細胞を細胞内カルシウム濃度を上昇させう
る化合物及び／又はプロテインキナーゼＣを活性化させ
うる化合物の存在下に培養を行う事以外は、従来から知
られている方法によって行うことができる。
【００１１】細胞内カルシウム濃度を上昇させうる化合
物としては、Ca2+-ATPase阻害剤、カルシウムイオノホ
アのいずれも利用可能である。Ca2+-ATPase阻害剤とし
ては例えばammonium vanadate、sodium vanadate等のva
nadate化合物、cyclopiazonic acid、2,5-di(tert-buty
l)-1,4-benzohydroquinone、thapsigargin、lanthanum
chloride等のlanthanum化合物を例示する事が出来る。
カルシウムイオノホアとしてはcalcium ionophore A231
87およびその類縁体、ionomycin、lasalocid(X-537A)、
prostaglandin B4、phosphatidic acid、1,4,5-triphos
phoinositol等を例示することが出来る。
物としては、Ca2+-ATPase阻害剤、カルシウムイオノホ
アのいずれも利用可能である。Ca2+-ATPase阻害剤とし
ては例えばammonium vanadate、sodium vanadate等のva
nadate化合物、cyclopiazonic acid、2,5-di(tert-buty
l)-1,4-benzohydroquinone、thapsigargin、lanthanum
chloride等のlanthanum化合物を例示する事が出来る。
カルシウムイオノホアとしてはcalcium ionophore A231
87およびその類縁体、ionomycin、lasalocid(X-537A)、
prostaglandin B4、phosphatidic acid、1,4,5-triphos
phoinositol等を例示することが出来る。
【００１２】前記Ca2+-ATPase阻害剤の培地における濃
度は、通常10-7〜10-2M、好ましくは10-7M〜10-3Mであ
り、この中でも特に10-5M〜10-4Mの範囲に調製すること
が本発明の方法にとって好ましい。前記カルシウムイオ
ノホアの培地における濃度は、通常10ー10〜10ー6M、好ま
しくは10-9M〜10-6Mであり、この中でも特に10-8M〜10
-7Mの範囲に調製することが本発明の方法にとって好ま
しい。
度は、通常10-7〜10-2M、好ましくは10-7M〜10-3Mであ
り、この中でも特に10-5M〜10-4Mの範囲に調製すること
が本発明の方法にとって好ましい。前記カルシウムイオ
ノホアの培地における濃度は、通常10ー10〜10ー6M、好ま
しくは10-9M〜10-6Mであり、この中でも特に10-8M〜10
-7Mの範囲に調製することが本発明の方法にとって好ま
しい。
【００１３】プロテインキナーゼＣを活性化させうる化
合物としてはphorbol 12,13-diacetate(PDA)、phorbol
12-myristate 13-acetate、phorbol 12,13-dibutylate
等のホルボールエステル類を例示することができる。 上
記ホルボールエステル類の培地における濃度は、通常１
０-9M〜10-4Mであり、この中でも特に10-8M〜10-5Mの範
囲に調製することが本発明の方法にとって好ましい。
合物としてはphorbol 12,13-diacetate(PDA)、phorbol
12-myristate 13-acetate、phorbol 12,13-dibutylate
等のホルボールエステル類を例示することができる。 上
記ホルボールエステル類の培地における濃度は、通常１
０-9M〜10-4Mであり、この中でも特に10-8M〜10-5Mの範
囲に調製することが本発明の方法にとって好ましい。
【００１４】植物の組織培養物に細胞内カルシウム濃度
を上昇させうる化合物を添加して二次代謝産物が誘導さ
れる事を示した例としては、ニンジンの培養細胞にカル
シウムイオノホアを添加する事で、６−メトキシメイレ
ンの産生が誘導される事を示した報告〔F.Kurosaki,Y.T
surusawa,A.Nishi,Phytochemistry,26,1919(1987)〕を
例示する事が出来る。しかしながら、ニンジンとは植物
種の異なる、タキサン型ジテルペン産生植物の組織培養
に於いて、培地添加物としてカルシウムイオノホアを存
在させて組織培養を行った例は報告されておらず、しか
もそれにより６−メトキシメイレンとは生合成経路の全
く異なるタキサン型ジテルペンの産生量が増大すること
は予想外のことであった。
を上昇させうる化合物を添加して二次代謝産物が誘導さ
れる事を示した例としては、ニンジンの培養細胞にカル
シウムイオノホアを添加する事で、６−メトキシメイレ
ンの産生が誘導される事を示した報告〔F.Kurosaki,Y.T
surusawa,A.Nishi,Phytochemistry,26,1919(1987)〕を
例示する事が出来る。しかしながら、ニンジンとは植物
種の異なる、タキサン型ジテルペン産生植物の組織培養
に於いて、培地添加物としてカルシウムイオノホアを存
在させて組織培養を行った例は報告されておらず、しか
もそれにより６−メトキシメイレンとは生合成経路の全
く異なるタキサン型ジテルペンの産生量が増大すること
は予想外のことであった。
【００１５】本発明の組織培養に使用される培地として
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962年)〔Murashige
& Skoog〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965年)
〔Linsmaier Skoog〕の培地、ウッディー・プラント・
メディウム(1981年) 〔Woody Plant Medium〕の培地、
ガンボルグ〔Gamborg〕のＢ−５培地、三井のＭ−９培
地等が挙げられる。これら培地に植物ホルモンを添加
し、更に必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、
アミノ酸等を添加することもできる。
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962年)〔Murashige
& Skoog〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965年)
〔Linsmaier Skoog〕の培地、ウッディー・プラント・
メディウム(1981年) 〔Woody Plant Medium〕の培地、
ガンボルグ〔Gamborg〕のＢ−５培地、三井のＭ−９培
地等が挙げられる。これら培地に植物ホルモンを添加
し、更に必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、
アミノ酸等を添加することもできる。
【００１６】炭素源としては、シュクロース、マルトー
ス、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトー
ス、ガラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら
糖源の２種類以上を適当な比率で混合したものを使用で
きる。
ス、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトー
ス、ガラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら
糖源の２種類以上を適当な比率で混合したものを使用で
きる。
【００１７】無機成分としては、例えばリン、窒素、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。
【００１８】植物ホルモンとしては、例えばインドール
酢酸(IAA)、ナフタレン酢酸(NAA)、２,４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸(2,4-D)等のオーキシン類、カイネチン、
ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用
いられる。
酢酸(IAA)、ナフタレン酢酸(NAA)、２,４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸(2,4-D)等のオーキシン類、カイネチン、
ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用
いられる。
【００１９】ビタミン類としては、例えばビオチン、チ
アミン（ビタミンＢ1）、ピリドキシン（ビタミンＢ
6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用
いられる。
アミン（ビタミンＢ1）、ピリドキシン（ビタミンＢ
6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用
いられる。
【００２０】アミノ酸類としては、例えばグリシン、フ
ェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等
を添加できる。一般に前記の各成分は、無機成分が約0.
1μM〜100mM、炭素源が約1〜約30g/l、植物ホルモン類
が約0.01〜約10μM、ビタミン類及びアミノ酸類がそれ
ぞれ約0.1〜約100mg/lの濃度で用いられる。
ェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等
を添加できる。一般に前記の各成分は、無機成分が約0.
1μM〜100mM、炭素源が約1〜約30g/l、植物ホルモン類
が約0.01〜約10μM、ビタミン類及びアミノ酸類がそれ
ぞれ約0.1〜約100mg/lの濃度で用いられる。
【００２１】尚、本発明には液体培地及び寒天やゲラン
ガム等を通常0.1〜1％含有する固形培地のいずれも使用
できる。
ガム等を通常0.1〜1％含有する固形培地のいずれも使用
できる。
【００２２】本発明の組織培養においては、上記植物の
根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片
または細胞、あるいはこれらを上記培地あるいは他の従
来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用
することができる。
根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片
または細胞、あるいはこれらを上記培地あるいは他の従
来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用
することができる。
【００２３】また本発明は、Agrobacterium tumefacien
s或いはAgrobacterium rhizogenesを植物組織に感染す
ることによって得られる腫瘍細胞及び／又は毛状根にも
使用できる。
s或いはAgrobacterium rhizogenesを植物組織に感染す
ることによって得られる腫瘍細胞及び／又は毛状根にも
使用できる。
【００２４】これらの組織及び／又は細胞を細胞内カル
シウム濃度を上昇させうる化合物及び／又はプロテイン
キナーゼＣを活性化させうる化合物の存在下に培養する
と、通常の培養条件下で組織培養した場合と比較してタ
キサン型ジテルペンの高生産性培養組織又は培養細胞が
得られる。
シウム濃度を上昇させうる化合物及び／又はプロテイン
キナーゼＣを活性化させうる化合物の存在下に培養する
と、通常の培養条件下で組織培養した場合と比較してタ
キサン型ジテルペンの高生産性培養組織又は培養細胞が
得られる。
【００２５】本発明の効果をさらに高めるため、下記一
般式（Ｉ）で表される化合物を併用することができる。
般式（Ｉ）で表される化合物を併用することができる。
【００２６】
【化２】
【００２７】［式中、Ｒ1a、Ｒ1b、Ｒ1c、Ｒ1d、Ｒ1e及
びＲ1fは、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１
〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表
し；Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立に水
素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ1−Ｃ2
−Ｃ3−Ｃ4−Ｃ5−Ｃ6からなる側鎖は、１個以上の二重
結合を含んでいてもよく；Ｒ7は水酸基、ＯＭ（ここ
で、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は
ＮＨ4を表す。）、ＮＲ8aＲ8b（ここでＲ8a及びＲ8b
は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル
基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表
す。）、ＯＲ9（ここでＲ9は炭素数１〜６のアルキル基
又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキ
ル基を表し；ｎは１〜７の整数を表し；前記５員環は、
隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよ
い。］
びＲ1fは、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１
〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表
し；Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立に水
素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ1−Ｃ2
−Ｃ3−Ｃ4−Ｃ5−Ｃ6からなる側鎖は、１個以上の二重
結合を含んでいてもよく；Ｒ7は水酸基、ＯＭ（ここ
で、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又は
ＮＨ4を表す。）、ＮＲ8aＲ8b（ここでＲ8a及びＲ8b
は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル
基、炭素数１〜６のアルキル基又はアミノ酸残基を表
す。）、ＯＲ9（ここでＲ9は炭素数１〜６のアルキル基
又は炭水化物残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキ
ル基を表し；ｎは１〜７の整数を表し；前記５員環は、
隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよ
い。］
【００２８】前記一般式（Ｉ）において、炭素数１〜６
のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ
−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブ
チル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチ
ル基、ｉ−ヘキシル基が挙げられる。炭素数１〜６のア
ルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、
ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ
基、ｉ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔ−ブトキ
シ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｉ−ヘキシルオキシ基が
挙げられる。アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子
としては、ナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げら
れる。炭素数１〜６のアシル基としては、例えばホルミ
ル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレ
リル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基が挙げられ、
これらは直鎖状でも分岐状でもよい。アミノ酸残基とし
ては、イソロイシル基、チロシル基、トリプトフィル基
等が挙げられる。炭水化物残基としては、例えばグルコ
ピラノシル基が挙げられる。一般式（Ｉ）の化合物には
種々の立体異性体（シストランス異性体、光学異性体）
が存在するが、それぞれを単独で用いても、混合物を用
いてもよい。
のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ
−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブ
チル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチ
ル基、ｉ−ヘキシル基が挙げられる。炭素数１〜６のア
ルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、
ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ
基、ｉ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔ−ブトキ
シ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｉ−ヘキシルオキシ基が
挙げられる。アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子
としては、ナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げら
れる。炭素数１〜６のアシル基としては、例えばホルミ
ル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレ
リル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基が挙げられ、
これらは直鎖状でも分岐状でもよい。アミノ酸残基とし
ては、イソロイシル基、チロシル基、トリプトフィル基
等が挙げられる。炭水化物残基としては、例えばグルコ
ピラノシル基が挙げられる。一般式（Ｉ）の化合物には
種々の立体異性体（シストランス異性体、光学異性体）
が存在するが、それぞれを単独で用いても、混合物を用
いてもよい。
【００２９】一般式（Ｉ）の化合物の具体例としては、
ジャスモン酸、その塩またはそのアルキルエステル、特
にメチルエステルを挙げることができる。このような一
般式（Ｉ）の化合物の培地における濃度は、通常0.01〜
1000μＭであり、特に0.1〜500μＭの範囲に調製するの
が好ましい。
ジャスモン酸、その塩またはそのアルキルエステル、特
にメチルエステルを挙げることができる。このような一
般式（Ｉ）の化合物の培地における濃度は、通常0.01〜
1000μＭであり、特に0.1〜500μＭの範囲に調製するの
が好ましい。
【００３０】また、特願平６−１０４２１１号、特願平
６−１０４２１２号にタキサン系化合物の生産促進物質
として開示されている、ツベロン酸、ツベロン酸メチ
ル、ククルビン酸、ククルビン酸メチル等の化合物を併
用することによっても生産性を高めることができる。
６−１０４２１２号にタキサン系化合物の生産促進物質
として開示されている、ツベロン酸、ツベロン酸メチ
ル、ククルビン酸、ククルビン酸メチル等の化合物を併
用することによっても生産性を高めることができる。
【００３１】以上のようにして得られた培養組織又は培
養細胞から、メタノール等の有機溶媒による抽出によっ
てタキサン型ジテルペンをを分離することができる。ま
た、培地中に適当な吸着剤や有機溶媒を共存させ、培養
中に連続的にタキサン型ジテルペンを回収することもで
きる。
養細胞から、メタノール等の有機溶媒による抽出によっ
てタキサン型ジテルペンをを分離することができる。ま
た、培地中に適当な吸着剤や有機溶媒を共存させ、培養
中に連続的にタキサン型ジテルペンを回収することもで
きる。
【００３２】本発明の組織培養の好ましい一例として
は、次の方法が挙げられる。先ずイチイ属に属する植物
の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採
取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッ
ディー・プラント・メディウムの固体培地上に置床し、
10〜35℃で14〜60日程度経過させて組織片の一部をカル
ス化させる。このようにして得られたカルスを継代培養
すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが得られ
る。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカルスの
一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態を保持
する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものをい
う。
は、次の方法が挙げられる。先ずイチイ属に属する植物
の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採
取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッ
ディー・プラント・メディウムの固体培地上に置床し、
10〜35℃で14〜60日程度経過させて組織片の一部をカル
ス化させる。このようにして得られたカルスを継代培養
すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが得られ
る。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカルスの
一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態を保持
する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものをい
う。
【００３３】この安定化したカルスを増殖に適した液体
培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体
培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速
度が高められる。本発明では、この安定化したカルスま
たは該カルスを構成する細胞は、細胞内カルシウム濃度
を上昇させうる化合物存在下、固体培地又は液体培地で
培養される。
培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体
培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速
度が高められる。本発明では、この安定化したカルスま
たは該カルスを構成する細胞は、細胞内カルシウム濃度
を上昇させうる化合物存在下、固体培地又は液体培地で
培養される。
【００３４】細胞内カルシウム濃度を上昇させうる化合
物及び／又はプロテインキナーゼＣを活性化させうる化
合物は、細胞が増殖期から定常期に移行する時期までに
添加することが効果的であり、特に増殖期に添加する事
が好ましい。また当該化合物は、一度に行っても良い
し、数回に分けて行っても良い。一般式（Ｉ）の化合物
の添加時期、添加方法も同様である。
物及び／又はプロテインキナーゼＣを活性化させうる化
合物は、細胞が増殖期から定常期に移行する時期までに
添加することが効果的であり、特に増殖期に添加する事
が好ましい。また当該化合物は、一度に行っても良い
し、数回に分けて行っても良い。一般式（Ｉ）の化合物
の添加時期、添加方法も同様である。
【００３５】本発明の組織培養における培養温度として
は、通常は約10〜約35℃、特に約23〜28℃が増殖速度が
大きいので好適である。また、培養期間としては、14〜
42日間が好適である。
は、通常は約10〜約35℃、特に約23〜28℃が増殖速度が
大きいので好適である。また、培養期間としては、14〜
42日間が好適である。
【００３６】本発明の培養方法において液体培地を用い
た場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーション
または濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞
および／または培地から目的とする代謝産物を有機溶媒
による抽出等の方法によって分離することができる。
た場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーション
または濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞
および／または培地から目的とする代謝産物を有機溶媒
による抽出等の方法によって分離することができる。
【００３７】
【実施例】以下、実施例及び比較例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。
【００３８】〔実施例１〕α−ナフタレン酢酸を10-5M
の濃度になるように添加したウッディー・プラント・メ
ディウムの固体培地（ゲランガム0.25重量％）に、前も
って2％アンチホルミン溶液または70％エタノール溶液
等で滅菌処理したセイヨウイチイ(Taxus baccata LINN)
の茎の一部を置床し、25℃で暗所にて静置培養してセイ
ヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス１g（新鮮
重）を、上記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プ
ラント・メディウムの液体培地20ml入りの三角フラスコ
に移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅25m
m、100rpm）し、21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速
度を速めた。
の濃度になるように添加したウッディー・プラント・メ
ディウムの固体培地（ゲランガム0.25重量％）に、前も
って2％アンチホルミン溶液または70％エタノール溶液
等で滅菌処理したセイヨウイチイ(Taxus baccata LINN)
の茎の一部を置床し、25℃で暗所にて静置培養してセイ
ヨウイチイカルスを得た。次にこのカルス１g（新鮮
重）を、上記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プ
ラント・メディウムの液体培地20ml入りの三角フラスコ
に移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅25m
m、100rpm）し、21日毎に植えつぎ、該カルスの生育速
度を速めた。
【００３９】このようにして得られた培養細胞１ｇ（新
鮮重）を、上記成分を同じ濃度で添加したウッディー・
プラント・メディウムの液体培地20ml入りの三角フラス
コに移し、calcium ionophore A23187をその終濃度が10
-10M〜10-5Mになるように添加して25℃で21日間旋回培
養を行った。
鮮重）を、上記成分を同じ濃度で添加したウッディー・
プラント・メディウムの液体培地20ml入りの三角フラス
コに移し、calcium ionophore A23187をその終濃度が10
-10M〜10-5Mになるように添加して25℃で21日間旋回培
養を行った。
【００４０】培養終了後、セイヨウイチイ培養細胞を濾
過により採取し、凍結乾燥した後その乾燥重量を測定
し、生育倍率を求めた。得られた乾燥カルスからメタノ
ール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液
体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セフ
ァロマニン、バッカチンIIIと比較定量することによっ
てタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表
１に示す。
過により採取し、凍結乾燥した後その乾燥重量を測定
し、生育倍率を求めた。得られた乾燥カルスからメタノ
ール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液
体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セフ
ァロマニン、バッカチンIIIと比較定量することによっ
てタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表
１に示す。
【００４１】〔実施例２〕実施例１に於いて、calcium
ionophore A23187を培養14日目に添加し、その後7日間
培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表１に示す。 〔実施例３〕実施例１に於いて、calcium ionophore A2
3187を培養開始時（0日目）より4日置きに計5回逐次添
加（1回当たりの終濃度は2X10-8M、合計10-7M）するこ
と以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に
示す。 〔実施例４〕実施例１に於いて、培養14日目にジャスモ
ン酸のメチルエステルをその終濃度が10-4Mになるよう
添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結
果を表１に示す。 〔比較例１〕実施例１に於いて、calcium ionophore A2
3187を添加しない以外は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表１〜３に示す。
ionophore A23187を培養14日目に添加し、その後7日間
培養した。培養終了後は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表１に示す。 〔実施例３〕実施例１に於いて、calcium ionophore A2
3187を培養開始時（0日目）より4日置きに計5回逐次添
加（1回当たりの終濃度は2X10-8M、合計10-7M）するこ
と以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に
示す。 〔実施例４〕実施例１に於いて、培養14日目にジャスモ
ン酸のメチルエステルをその終濃度が10-4Mになるよう
添加すること以外は該実施例と同様に操作した。その結
果を表１に示す。 〔比較例１〕実施例１に於いて、calcium ionophore A2
3187を添加しない以外は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表１〜３に示す。
【００４２】〔実施例５〕実施例２に於いて、ammonium
vanadateを、その終濃度が10-8M〜10-2Mになるように
添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結
果を表２に示す。 〔参考例１〕Ammonium vanadateの効果がCa2+-ATPase阻
害による細胞内Ca2+濃度の上昇であるならば、カルシウ
ムキレート剤で細胞内の遊離のCa2+濃度を下げることに
より、ammonium vanadateの効果は低下すると考えられ
る。そこで実施例５に於いて、ammonium vanadateを、
その終濃度が10-5Mになるよう添加し、さらにカルシウ
ムキレート剤FuraII-AMをその終濃度が10-8M〜10-6Mに
なるよう添加したこと以外は該実施例と同様に操作し
た。その結果を表２に示す。
vanadateを、その終濃度が10-8M〜10-2Mになるように
添加したこと以外は該実施例と同様に操作した。その結
果を表２に示す。 〔参考例１〕Ammonium vanadateの効果がCa2+-ATPase阻
害による細胞内Ca2+濃度の上昇であるならば、カルシウ
ムキレート剤で細胞内の遊離のCa2+濃度を下げることに
より、ammonium vanadateの効果は低下すると考えられ
る。そこで実施例５に於いて、ammonium vanadateを、
その終濃度が10-5Mになるよう添加し、さらにカルシウ
ムキレート剤FuraII-AMをその終濃度が10-8M〜10-6Mに
なるよう添加したこと以外は該実施例と同様に操作し
た。その結果を表２に示す。
【００４３】〔実施例６〕実施例２に於いて、phorbol-
12,13-diacetate(PDA)を、さらにその終濃度が10 -9M〜1
0-4Mになるように添加したこと以外は該実施例と同様に
操作した。その結果を表３に示す。 〔実施例７〕実施例２に於いて、phorbol-12,13-diacet
ate(PDA)をその終濃度が10-7Mになるよう添加し、培養1
4日目にジャスモン酸のメチルエステルをその終濃度が1
0-4Mになるよう添加すること以外は該実施例と同様に操
作した。その結果を表３に示す。
12,13-diacetate(PDA)を、さらにその終濃度が10 -9M〜1
0-4Mになるように添加したこと以外は該実施例と同様に
操作した。その結果を表３に示す。 〔実施例７〕実施例２に於いて、phorbol-12,13-diacet
ate(PDA)をその終濃度が10-7Mになるよう添加し、培養1
4日目にジャスモン酸のメチルエステルをその終濃度が1
0-4Mになるよう添加すること以外は該実施例と同様に操
作した。その結果を表３に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
【表２】
【００４６】
【表３】
【００４７】
【発明の効果】本発明によれば、植物の組織又は細胞を
細胞内カルシウム濃度を上昇させうる化合物の存在下及
び／又はプロテインキナーゼＣを活性化させうる化合物
の存在下に培養することにより、植物由来の代謝産物を
大量に且つ簡便に得ることが可能となった。
細胞内カルシウム濃度を上昇させうる化合物の存在下及
び／又はプロテインキナーゼＣを活性化させうる化合物
の存在下に培養することにより、植物由来の代謝産物を
大量に且つ簡便に得ることが可能となった。
Claims (13)
- 【請求項１】 タキサン型ジテルペンを産生する植物の
組織及び／又は細胞を、細胞内カルシウム濃度を上昇さ
せうる化合物の存在下に培養し、得られる培養物及び／
又は培地からタキサン型ジテルペンを回収することを特
徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。 - 【請求項２】 細胞内カルシウム濃度を上昇させうる化
合物が、Ca2+-ATPase阻害剤である事を特徴とする請求
項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。 - 【請求項３】 Ca2+-ATPase阻害剤がvanadate化合物、c
yclopiazonic acid、2,5-di(tert-butyl)-1,4-benzohyd
roquinone、thapsigargin,lanthanum化合物から選ばれ
る少なくとも１種類以上である事を特徴とする請求項２
記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。 - 【請求項４】 Ca2+-ATPase阻害剤の濃度が、10-7M〜10
-3Mであることを特徴とする請求項２記載のタキサン型
ジテルペンの製造方法。 - 【請求項５】 細胞内カルシウム濃度を上昇させうる化
合物が、カルシウムイオノホアである事を特徴とする請
求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。 - 【請求項６】 カルシウムイオノホアがcalcium ionoph
ore A23187およびその類縁体、ionomycin、lasalocid(X
-537A)、prostaglandin B4、phosphatidic acid、1,4,5
-triphosphoinositolから選ばれる少なくとも１種類以
上である事を特徴とする請求項５記載のタキサン型ジテ
ルペンの製造方法。 - 【請求項７】 カルシウムイオノホアの濃度が、10-9M
〜10-6Mであることを特徴とする請求項５記載のタキサ
ン型ジテルペンの製造方法。 - 【請求項８】 タキサン型ジテルペンを産生する植物の
組織及び／又は細胞を、プロテインキナーゼＣを活性化
させうる化合物の存在下に培養し、得られる培養物及び
／又は培地からタキサン型ジテルペンを回収することを
特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。 - 【請求項９】 プロテインキナーゼＣを活性化させうる
化合物がホルボールエステル類である事を特徴とする請
求項８記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。 - 【請求項１０】 ホルボールエステル類の濃度が、10-9
M〜10-4Mであることを特徴とする請求項８記載のタキサ
ン型ジテルペンの製造方法。 - 【請求項１１】 タキサン型ジテルペンが、タキソー
ル、１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソ−
ル、バッカチンIII、１０−デアセチルバッカチンIII、
７−エピバッカチンIII、セファロマニン、１０−デア
セチルセファロマニン及び７−エピセファロマニン、バ
ッカチンＶＩ、タキソールＣ、１０−デアセチルタキソ
ールＣ、タキサギフィン及びその類縁体、タキサン １
ａ及びその類縁体、キシロシルセファロマニン、キシロ
シルタキソールであることを特徴とする請求項１および
８記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。 - 【請求項１２】 タキサン型ジテルペンを産生する植物
がイチイ属植物であることを特徴とする請求項１および
８記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。 - 【請求項１３】 タキサン型ジテルペンを植物の組織及
び／又は細胞を下記の一般式（Ｉ）で表される化合物の
存在下に培養することを特徴とする請求項１および８記
載のタキサン型ジテルペンの製造方法。 【化１】 ［式中、Ｒ1a、Ｒ1b、Ｒ1c、Ｒ1d、Ｒ1e及びＲ1fは、そ
れぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキ
ル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表し；Ｒ2、Ｒ
3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立に水素原子又は炭
素数１〜６のアルキル基を表し；Ｃ1−Ｃ2−Ｃ3−Ｃ4−
Ｃ5−Ｃ6からなる側鎖は、１個以上の二重結合を含んで
いてもよく；Ｒ7は水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカ
リ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ4を表
す。）、ＮＲ8aＲ8b（ここでＲ8a及びＲ8bは、それぞれ
独立に水素原子、炭素数１〜６のアシル基、炭素数１〜
６のアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ9
（ここでＲ9は炭素数１〜６のアルキル基又は炭水化物
残基を表す。）又は炭素数１〜６のアルキル基を表し；
ｎは１〜７の整数を表し；前記５員環は、隣接する環員
炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18020695A JPH0928392A (ja) | 1995-07-17 | 1995-07-17 | タキサン型ジテルペンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18020695A JPH0928392A (ja) | 1995-07-17 | 1995-07-17 | タキサン型ジテルペンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0928392A true JPH0928392A (ja) | 1997-02-04 |
Family
ID=16079261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18020695A Pending JPH0928392A (ja) | 1995-07-17 | 1995-07-17 | タキサン型ジテルペンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0928392A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7264951B1 (en) | 1992-02-20 | 2007-09-04 | Phyton, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| US8058314B2 (en) | 1999-10-27 | 2011-11-15 | Yale University | Conductance of improperly folded proteins through the secretory pathway and related methods for treating disease |
| US8338143B2 (en) | 1996-05-24 | 2012-12-25 | Phyton Holdings, Llc | Enhanced production of paclitaxel and taxanes by cell cultures of Taxus species |
-
1995
- 1995-07-17 JP JP18020695A patent/JPH0928392A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7264951B1 (en) | 1992-02-20 | 2007-09-04 | Phyton, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| US8338143B2 (en) | 1996-05-24 | 2012-12-25 | Phyton Holdings, Llc | Enhanced production of paclitaxel and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| US8058314B2 (en) | 1999-10-27 | 2011-11-15 | Yale University | Conductance of improperly folded proteins through the secretory pathway and related methods for treating disease |
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|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20050412 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050906 |