JP3066873B2 - 半連続培養によるタキソールの大量生産方法 - Google Patents
半連続培養によるタキソールの大量生産方法Info
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明はイチイ（Taxus）属植物の細胞培養物由来の
タキソールの大量生産方法に関する。より具体的には、
イチイ属植物細胞の半連続培養による、タキソールを高
収率で大量生産する方法に関する。
タキソールの大量生産方法に関する。より具体的には、
イチイ属植物細胞の半連続培養による、タキソールを高
収率で大量生産する方法に関する。
先行技術の説明 タキサンはタキサン骨格を有するジテルペン化合物で
ある。例えば、タイヘイヨウイチイ（Taxus brevifoli
a）の樹皮より単離されたタキソールは、タキサン環を
有する最初に同定された化合物として有名であり、白血
病および癌の治療に有効である。最近、タキソールは微
小管の解重合を抑制することにより卵巣癌、乳癌および
肺癌患者のそれぞれ約30％、50％および20％を治すこと
が可能であると報告された（E.K.Rowinskyら、J.Natl.C
ancer.Inst.,82:1247−1259（1990）参照）。
ある。例えば、タイヘイヨウイチイ（Taxus brevifoli
a）の樹皮より単離されたタキソールは、タキサン環を
有する最初に同定された化合物として有名であり、白血
病および癌の治療に有効である。最近、タキソールは微
小管の解重合を抑制することにより卵巣癌、乳癌および
肺癌患者のそれぞれ約30％、50％および20％を治すこと
が可能であると報告された（E.K.Rowinskyら、J.Natl.C
ancer.Inst.,82:1247−1259（1990）参照）。
他方、タキソールを調製するため、全化学合成法、半
合成法および抽出法が用いられてきた。
合成法および抽出法が用いられてきた。
しかし、全化学合成法はタキソールの複雑な化学構造
から予想できるように非常に高価な試薬を必要とし、ま
た収率もそれほど高くないので、本分野では実際には使
用されていない。
から予想できるように非常に高価な試薬を必要とし、ま
た収率もそれほど高くないので、本分野では実際には使
用されていない。
10−デアセチルバッカチンIII等の前躯体を用いる半
合成法は、イチイ属植物からタキソール前駆体を単離精
製し、さらにタキソール前駆体をタキソールへ変換する
複雑で多数の工程を本質的に必要とするため、幾つかの
欠点がある。
合成法は、イチイ属植物からタキソール前駆体を単離精
製し、さらにタキソール前駆体をタキソールへ変換する
複雑で多数の工程を本質的に必要とするため、幾つかの
欠点がある。
この点で、タキソールをイチイ属植物から直接単離す
ることができる抽出法は経済的な利点を有するため、本
分野で普及した。しかし、この方法はタキソールを精製
するために大量のイチイの樹を本質的に必要とし、それ
は最終的には深刻な環境破壊を引き起こす、という意味
でさほど満足すべきものでないことが示された。
ることができる抽出法は経済的な利点を有するため、本
分野で普及した。しかし、この方法はタキソールを精製
するために大量のイチイの樹を本質的に必要とし、それ
は最終的には深刻な環境破壊を引き起こす、という意味
でさほど満足すべきものでないことが示された。
したがって、全化学合成法、半合成法および抽出法
の、世界中の化学療法用途にタキソールを提供する能力
は保証されていない；そこで、タキソール生産の別の手
段を研究し、開発する強い理由が存在する。
の、世界中の化学療法用途にタキソールを提供する能力
は保証されていない；そこで、タキソール生産の別の手
段を研究し、開発する強い理由が存在する。
上記の問題を解決するための有望な別の手段として、
タキソール生産のための細胞培養が本分野で提案され
た。
タキソール生産のための細胞培養が本分野で提案され
た。
細胞培養に基づくタキソール生産方法は、先行技術と
違って、以下の利点を有する。第１に、胴枯れ病や害虫
等による損害によるイチイ植物供給の変動に関わらず、
タキソールが安定した方法で生産できる。第２に、細胞
培養物を大きなバイオリアクターの中で増殖させ、そし
て培養条件を操作することによってそこからタキソール
を大量に生産させることができる。第３に、他の先行技
術の方法と比較して細胞培養物はより単純な範囲の化合
物を生成するので、分離および精製がかなり単純化され
る。第４に、他の方法に較べ、細胞培養プロセスは急激
な需要の変化に迅速に適合できる。第５に、細胞培養プ
ロセスにより、タキソールおよびタキソールに変換可能
なバッカチン等のタキサン前駆体を生産できる。
違って、以下の利点を有する。第１に、胴枯れ病や害虫
等による損害によるイチイ植物供給の変動に関わらず、
タキソールが安定した方法で生産できる。第２に、細胞
培養物を大きなバイオリアクターの中で増殖させ、そし
て培養条件を操作することによってそこからタキソール
を大量に生産させることができる。第３に、他の先行技
術の方法と比較して細胞培養物はより単純な範囲の化合
物を生成するので、分離および精製がかなり単純化され
る。第４に、他の方法に較べ、細胞培養プロセスは急激
な需要の変化に迅速に適合できる。第５に、細胞培養プ
ロセスにより、タキソールおよびタキソールに変換可能
なバッカチン等のタキサン前駆体を生産できる。
培養した植物細胞を用いてタキソールを生産する方法
が本分野で記述されている。
が本分野で記述されている。
USP 5,019,504はタイヘイヨウイチイの培養細胞を用
いてタキソールおよびその誘導体を生産する方法を開示
している。しかし、ここに記載されたタキソールの収率
は１〜3mg/Lで、これは産業上の利用には不十分であ
る。そのうえ、細胞培養によるタキソールの生産は不安
定で、選択により高生産性の一次細胞が得られた場合で
も、継代培養によってその含量を維持することは困難で
ある（E.R.M.Wickremesineら、World Congress on Cell
and Tissue Culture（1992）参照）。
いてタキソールおよびその誘導体を生産する方法を開示
している。しかし、ここに記載されたタキソールの収率
は１〜3mg/Lで、これは産業上の利用には不十分であ
る。そのうえ、細胞培養によるタキソールの生産は不安
定で、選択により高生産性の一次細胞が得られた場合で
も、継代培養によってその含量を維持することは困難で
ある（E.R.M.Wickremesineら、World Congress on Cell
and Tissue Culture（1992）参照）。
USP 5,015,744は、タキソールの生合成における前駆
体であるバッカチンIIIからの半合成法を教示する。植
物組織培養の使用により、バッカチンIII等の半合成プ
ロセスのための原料が生成されうる。したがって、植物
組織培養は上記の半合成法によるタキソールの生産方法
にも利用することができる。
体であるバッカチンIIIからの半合成法を教示する。植
物組織培養の使用により、バッカチンIII等の半合成プ
ロセスのための原料が生成されうる。したがって、植物
組織培養は上記の半合成法によるタキソールの生産方法
にも利用することができる。
WO 93/17121は、培地の組成、増殖速度、および生産
速度等を変えながらイチイ属植物の細胞を培養すること
によるタキソールの生産方法を提案する。中国イチイ
（Taxus chinensis）の場合、18日の培養で24.1mg/Lの
タキソールが得られ、バイオマスは2.5日毎に２倍にな
る。
速度等を変えながらイチイ属植物の細胞を培養すること
によるタキソールの生産方法を提案する。中国イチイ
（Taxus chinensis）の場合、18日の培養で24.1mg/Lの
タキソールが得られ、バイオマスは2.5日毎に２倍にな
る。
これらの特許はすべて、バッチ培養を採用することに
よるタキソールの大量生産方法を記述している。タキソ
ール生産性細胞系の半連続培養について、上記特許には
何の教示もなく、また予想できるものでもない。
よるタキソールの大量生産方法を記述している。タキソ
ール生産性細胞系の半連続培養について、上記特許には
何の教示もなく、また予想できるものでもない。
このような状況下で、USP 5,407,816は、中国イチイ
の細胞を栄養倍地に接種して懸濁物を形成し、次にこの
懸濁物を培養して懸濁培養物を形成し、次にこれを別の
栄養倍地で継代培養し、生産性培養物を形成したとこ
ろ、この培養物は最終的に153mg/Lの収量でタキソール
およびタキサンを生じる、と記述している。この方法は
タキソールの生産性をかなり改善したが、この方法は組
成が非常に複雑な多数の栄養培地を本質的に必要とし、
またかなり限定された増殖条件のもとで高い生産性が実
現される、という意味でさほど満足すべきものではない
ことが示された。
の細胞を栄養倍地に接種して懸濁物を形成し、次にこの
懸濁物を培養して懸濁培養物を形成し、次にこれを別の
栄養倍地で継代培養し、生産性培養物を形成したとこ
ろ、この培養物は最終的に153mg/Lの収量でタキソール
およびタキサンを生じる、と記述している。この方法は
タキソールの生産性をかなり改善したが、この方法は組
成が非常に複雑な多数の栄養培地を本質的に必要とし、
またかなり限定された増殖条件のもとで高い生産性が実
現される、という意味でさほど満足すべきものではない
ことが示された。
したがって、工業的用途に使用できるかどうかを決め
る重大な因子である高い生産性という要求を満たすこと
のできる、タキソール生産のための実用的で簡素な方法
を開発する必要が継続している。
る重大な因子である高い生産性という要求を満たすこと
のできる、タキソール生産のための実用的で簡素な方法
を開発する必要が継続している。
発明の概略 本発明によれば、新規なタキソール生産性細胞系Taxu
s chinensis SYG−１の半連続培養により、タキソール
を高い効率で生産できることが見いだされた。
s chinensis SYG−１の半連続培養により、タキソール
を高い効率で生産できることが見いだされた。
したがって、本発明の第１の目的は半連続培養による
タキソールの大量生産方法を提供することである。
タキソールの大量生産方法を提供することである。
本発明の別の目的は、中国イチイから単離された新規
なタキソール生産性細胞系を提供することである。
なタキソール生産性細胞系を提供することである。
図面の簡単な説明 本発明の上記および他の目的、ならびに特徴は、添付
の図面と共に提供される以下の説明により明らかになる
であろう。図面において： 図１は、タキソール生産性に対するAgNO3の効果を示
すグラフである。
の図面と共に提供される以下の説明により明らかになる
であろう。図面において： 図１は、タキソール生産性に対するAgNO3の効果を示
すグラフである。
図２は、タキソール生産性に対するNH4−クエン酸塩
の効果を示すグラフである。
の効果を示すグラフである。
図３は、タキソール生産性に対するマルトースの効果
を示すグラフである。
を示すグラフである。
図４は、培養サイクルにしたがった、SYG−１の半連
続培養におけるタキソールの生産性を示すグラフであ
る。
続培養におけるタキソールの生産性を示すグラフであ
る。
発明の詳細な説明 本発明者らは先ず中国イチイから誘導されたカルスを
ベースとしてタキソール生産性細胞系を開発し、そして
その細胞系を本分野で公知の細胞系と比較した。タキソ
ール生産性細胞系の形態、生理および増殖条件の比較研
究から、新たに開発された細胞系はタキソール生産性、
タキソール分泌様式、等に鑑みて先行技術の細胞系と幾
分異なった、新規な細胞系であることが確認された。し
たがって、この細胞系をTaxus chinensis SYG−１（以
後便宜のため「SYG−１」と呼ぶ）と名付け、Korean Co
llection for Type Cultures（KCTC）、国際寄託機関
（IDA）に受託番号KCTC 0232BPのもとに1996年３月14日
に寄託した。
ベースとしてタキソール生産性細胞系を開発し、そして
その細胞系を本分野で公知の細胞系と比較した。タキソ
ール生産性細胞系の形態、生理および増殖条件の比較研
究から、新たに開発された細胞系はタキソール生産性、
タキソール分泌様式、等に鑑みて先行技術の細胞系と幾
分異なった、新規な細胞系であることが確認された。し
たがって、この細胞系をTaxus chinensis SYG−１（以
後便宜のため「SYG−１」と呼ぶ）と名付け、Korean Co
llection for Type Cultures（KCTC）、国際寄託機関
（IDA）に受託番号KCTC 0232BPのもとに1996年３月14日
に寄託した。
次に、発明者らは本発明の細胞系の増殖条件を最適化
し、そしてSYG−１細胞はB5培地、最も好ましくは20μM
NAA（ナフトキシ酢酸）、0.4μM BSP（６−ベンジルア
ミノプリン）、1g/Lカゼイン加水分解物および30g/Lス
クロースを補充したB5培地で、温度24℃の条件下で、攪
拌速度150rpmで良好に増殖することを確認した。他方、
タキソールの生産性に対するAgNO3、NH4−クエン酸塩お
よびマルトースの効果もまた検討し、そして発明者らは
これらの添加はタキソールの生産性をかなり向上させる
と結論した。
し、そしてSYG−１細胞はB5培地、最も好ましくは20μM
NAA（ナフトキシ酢酸）、0.4μM BSP（６−ベンジルア
ミノプリン）、1g/Lカゼイン加水分解物および30g/Lス
クロースを補充したB5培地で、温度24℃の条件下で、攪
拌速度150rpmで良好に増殖することを確認した。他方、
タキソールの生産性に対するAgNO3、NH4−クエン酸塩お
よびマルトースの効果もまた検討し、そして発明者らは
これらの添加はタキソールの生産性をかなり向上させる
と結論した。
本発明によれば、下記の工程を含んでなるSYG−１の
半連続培養を用いることにより、タキソールを高い収率
で調製することが可能である。すなわち： （ｉ）イチイ属植物細胞を１〜10％（w/v）の糖を含有
する培地に接触し、これをインキュベートし；そして （ii）上記の工程（ｉ）で得られた培養物の1/10から1/
2容量を新鮮な培地に移して上記の工程（ｉ）を繰り返
し、残りの培養物に１〜10％（w/v）の糖を添加し、そ
してタキソールの最大生産時までインキュベートする工
程である。
半連続培養を用いることにより、タキソールを高い収率
で調製することが可能である。すなわち： （ｉ）イチイ属植物細胞を１〜10％（w/v）の糖を含有
する培地に接触し、これをインキュベートし；そして （ii）上記の工程（ｉ）で得られた培養物の1/10から1/
2容量を新鮮な培地に移して上記の工程（ｉ）を繰り返
し、残りの培養物に１〜10％（w/v）の糖を添加し、そ
してタキソールの最大生産時までインキュベートする工
程である。
培養の始めに、AgNO3をイチイ属植物細胞培養物に添
加し、これを10〜20日間、より好ましくは10〜15日間、
１〜15μＭより好ましくは５〜10μＭの濃度でインキュ
ベートすることができる。さらに、NH4−クエン酸塩お
よびマルトースをインキュベート開始後５〜30日目に、
より好ましくは５〜10日目に、それぞれ１〜15mM、より
好ましくは１〜10mM、および１〜10％（w/v）、より好
ましくは１〜５％（w/v）の濃度で培養物に添加するこ
とができる。
加し、これを10〜20日間、より好ましくは10〜15日間、
１〜15μＭより好ましくは５〜10μＭの濃度でインキュ
ベートすることができる。さらに、NH4−クエン酸塩お
よびマルトースをインキュベート開始後５〜30日目に、
より好ましくは５〜10日目に、それぞれ１〜15mM、より
好ましくは１〜10mM、および１〜10％（w/v）、より好
ましくは１〜５％（w/v）の濃度で培養物に添加するこ
とができる。
インキュベーション開始後５〜30日目に、全培養物の
1/10から1/2容量を新鮮な培地（この内容物は培養の始
めに用いられたものと同じである）を含有する別のフラ
スコに移し、培養サイクルを開始する。次に、全培養物
の9/10から1/2に相当する残りの培養物に、１〜10％（w
/v）、より好ましくは１〜５％（w/v）のマルトースを
添加し、30〜60日間インキュベートする。この間にタキ
ソールの生産が最大となる。この時、インキュベーショ
ンは24℃で、攪拌速度150rpmで、暗条件下で行われる。
1/10から1/2容量を新鮮な培地（この内容物は培養の始
めに用いられたものと同じである）を含有する別のフラ
スコに移し、培養サイクルを開始する。次に、全培養物
の9/10から1/2に相当する残りの培養物に、１〜10％（w
/v）、より好ましくは１〜５％（w/v）のマルトースを
添加し、30〜60日間インキュベートする。この間にタキ
ソールの生産が最大となる。この時、インキュベーショ
ンは24℃で、攪拌速度150rpmで、暗条件下で行われる。
本発明の方法に用いられるイチイ属植物は、タイヘイ
ヨウイチイ、カナダイチイ（Taxus canadensis）、イチ
イ（Taxus cuspidata）、セイヨウイチイ（Taxus bacca
ta）、メキシコイチイ（Taxus globosa）、フロリダイ
チイ（Taxus floridana）、インドイチイ（Taxus walli
chiana）、タクスス・メディア（Taxus media）および
中国イチイを含むが、本発明者らによって新たに開発さ
れたTaxus chinensis SYG−１が最も好ましく用いられ
る。
ヨウイチイ、カナダイチイ（Taxus canadensis）、イチ
イ（Taxus cuspidata）、セイヨウイチイ（Taxus bacca
ta）、メキシコイチイ（Taxus globosa）、フロリダイ
チイ（Taxus floridana）、インドイチイ（Taxus walli
chiana）、タクスス・メディア（Taxus media）および
中国イチイを含むが、本発明者らによって新たに開発さ
れたTaxus chinensis SYG−１が最も好ましく用いられ
る。
本発明の法によれば、タキソールの生産性を改善する
ためAgNO3、NH4−クエン酸塩およびマルトースを添加す
る半連続培養にTaxus chinensis SYG−１を用いた場
合、インキュベーション開始後42〜49日目に300mg/Lと
いうレベルのタキソール生産性が観察される。
ためAgNO3、NH4−クエン酸塩およびマルトースを添加す
る半連続培養にTaxus chinensis SYG−１を用いた場
合、インキュベーション開始後42〜49日目に300mg/Lと
いうレベルのタキソール生産性が観察される。
タキソールの定量分析 Taxus chinensis SYG−１の培養物から本発明の方法
によって生産されたタキソールは、下記の表１に記載の
特定の条件のもとで高速液体クロマトグラフィーを用い
て定量的にアッセイされる。
によって生産されたタキソールは、下記の表１に記載の
特定の条件のもとで高速液体クロマトグラフィーを用い
て定量的にアッセイされる。
表1.タキソールの定量的アッセイの条件 装置 HPLC（Waters,U.S.A.） カラム Capcell Pack C18 UG 120（長さ:250mm,内径:4.6mm） カラム温度 40℃ 移動相 CH3CN:水（20〜100％勾配） 流速 1.0ml/分 注入量 10μｌ 検出器 UV（227nm）,ATTE＝３ 本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、そ
れらは本発明の範囲を制限するものではない。
れらは本発明の範囲を制限するものではない。
実施例1:中国イチイからのカルスの誘導およびその特徴
付け 本発明の細胞系は、カルス誘導によって中国イチイか
ら単離された。ホルモンを含有する適切な培地を用いて
植物組織をインキュベートすると、未分化細胞であるカ
ルスが誘導された。中国イチイの樹皮、葉、幹および根
由来の組織を水道水で洗浄し、次亜塩素酸カルシウム溶
液で20〜30分間滅菌した。次に、滅菌した組織を蒸留水
で２〜３回洗浄し、長さ1cmに刻み、そして20μM NAA
（ナフトキシ酢酸）、0.4μM BAP（６−ベンジルアミノ
プリン）、1g/Lカゼイン加水分解物および30g/Lスクロ
ースを0.2％（w/w）ゼライト（gelite）で固形化した後
に補充したB5培地（Gamborgら、Can.J.Biochem.,46:417
−421（1968）参照）に移し、24〜26℃で２〜６週間暗
条件でインキュベートし、目的のカルスを誘導した。
付け 本発明の細胞系は、カルス誘導によって中国イチイか
ら単離された。ホルモンを含有する適切な培地を用いて
植物組織をインキュベートすると、未分化細胞であるカ
ルスが誘導された。中国イチイの樹皮、葉、幹および根
由来の組織を水道水で洗浄し、次亜塩素酸カルシウム溶
液で20〜30分間滅菌した。次に、滅菌した組織を蒸留水
で２〜３回洗浄し、長さ1cmに刻み、そして20μM NAA
（ナフトキシ酢酸）、0.4μM BAP（６−ベンジルアミノ
プリン）、1g/Lカゼイン加水分解物および30g/Lスクロ
ースを0.2％（w/w）ゼライト（gelite）で固形化した後
に補充したB5培地（Gamborgら、Can.J.Biochem.,46:417
−421（1968）参照）に移し、24〜26℃で２〜６週間暗
条件でインキュベートし、目的のカルスを誘導した。
カルスを本分野で周知の幾つかの培地、例えばMS（Mu
rashige T.およびF.Skoog F.,Physiol.Plant,5:473（19
62）参照）、SH（SchenkおよびHilderbrahdt,Can.J.Bo
t.,50:199−204（1972）参照）、WPM（LloydおよびMcco
wn,Int.Plant Prop.Soc.Proc.,30:421−427（1981）参
照）およびB5培地（前出）にそれぞれ移して、肉眼でカ
ルスの増殖パターンを観察することにより、カルスの増
殖培地を選択した。上の結果から、カルスは20μM NA
A、0.4μM BAPおよび2g/L カゼイン加水分解物を含有す
るB5培地で良好な増殖を示すことが確認された。
rashige T.およびF.Skoog F.,Physiol.Plant,5:473（19
62）参照）、SH（SchenkおよびHilderbrahdt,Can.J.Bo
t.,50:199−204（1972）参照）、WPM（LloydおよびMcco
wn,Int.Plant Prop.Soc.Proc.,30:421−427（1981）参
照）およびB5培地（前出）にそれぞれ移して、肉眼でカ
ルスの増殖パターンを観察することにより、カルスの増
殖培地を選択した。上の結果から、カルスは20μM NA
A、0.4μM BAPおよび2g/L カゼイン加水分解物を含有す
るB5培地で良好な増殖を示すことが確認された。
次に、このようにして誘導した細胞系について、形
態、生理および増殖条件に関する研究を行い、そして本
分野で公知の細胞系と比較した。結果を下記の表２およ
び３にまとめた。表２および３から分かるように、本発
明において開発された細胞系は、タキソール生産性およ
びタキソール分泌様式、等の点で先行技術の細胞系と区
別される特徴を有する。したがって、この細胞系をTaxu
s chinensis SYG−１と名付け、Korean Collection for
Type Cultures（KCTC）、国際寄託機関（IDA）に受託
番号KCTC 0232BPのもとに1996年３月14日に寄託した。
態、生理および増殖条件に関する研究を行い、そして本
分野で公知の細胞系と比較した。結果を下記の表２およ
び３にまとめた。表２および３から分かるように、本発
明において開発された細胞系は、タキソール生産性およ
びタキソール分泌様式、等の点で先行技術の細胞系と区
別される特徴を有する。したがって、この細胞系をTaxu
s chinensis SYG−１と名付け、Korean Collection for
Type Cultures（KCTC）、国際寄託機関（IDA）に受託
番号KCTC 0232BPのもとに1996年３月14日に寄託した。
表2.Taxus chinensis SYG−１の形態および増殖条件 Taxus chinensis SYG−１ 特徴 大きさ 50〜150μｍ 運動性 （−） 凝集（agglutination） 弱い 細胞集合（aggregation） （＋） せん断応力への順応 強い 培養物の色 薄茶色 培養温度 24℃ 実施例2:SYG−１の懸濁培養 SYG−１の懸濁培養に最も好ましい培地を選択するた
め、この細胞系をそれぞれMS、SH、WPMおよびB5培地に
移し、実施例１と同様に増殖パターンを観察した。その
結果、SYG−１細胞はカルス同様、20μM NAA、0.4μM B
APおよび2g/Lカゼイン加水分解物を含有するB5培地で良
好に増殖した。さらに、SYG−１細胞は24℃の温度で、
攪拌速度150rpmで良好に増殖することも確認された。
め、この細胞系をそれぞれMS、SH、WPMおよびB5培地に
移し、実施例１と同様に増殖パターンを観察した。その
結果、SYG−１細胞はカルス同様、20μM NAA、0.4μM B
APおよび2g/Lカゼイン加水分解物を含有するB5培地で良
好に増殖した。さらに、SYG−１細胞は24℃の温度で、
攪拌速度150rpmで良好に増殖することも確認された。
固形化培地の場合は、ピンセットで組織の一部を移し
ながらカルスの連続培養を４週間毎に行った。カルスの
一片を固形培地のプレート上で維持した。次に、固形培
地上で維持したカルスを少量のB5培地に接種し、細胞が
増殖して培養物の全容量が増加するにつれ、少量の培地
を培養物に補充した。次に、良好に増殖した細胞系を50
0mlの三角フラスコに入れた改変B5培地中で1/5（v/v）
の比率で希釈し、２週間ごとに懸濁培養培地に接種し
た。
ながらカルスの連続培養を４週間毎に行った。カルスの
一片を固形培地のプレート上で維持した。次に、固形培
地上で維持したカルスを少量のB5培地に接種し、細胞が
増殖して培養物の全容量が増加するにつれ、少量の培地
を培養物に補充した。次に、良好に増殖した細胞系を50
0mlの三角フラスコに入れた改変B5培地中で1/5（v/v）
の比率で希釈し、２週間ごとに懸濁培養培地に接種し
た。
実施例3:タキソール生産性に対するAgNO3の効果 AgNO3は、植物細胞の成長および二次代謝物の生産に
影響を及ぼす植物ホルモン、エチレンのアンタゴニスト
であることが周知である。したがって、本発明者らはSY
G−１の懸濁培養におけるAgNO3のタキソール生産性に対
する効果を試験した。
影響を及ぼす植物ホルモン、エチレンのアンタゴニスト
であることが周知である。したがって、本発明者らはSY
G−１の懸濁培養におけるAgNO3のタキソール生産性に対
する効果を試験した。
250mlの三角フラスコに、10μＭのAgNO3および25mlの
14日齢細胞培養物を含有する75mlのB5培地を注ぎ、実施
例２と同様にインキュベートした。次に、タキソールの
生産性をAgNO3を含まない対照と比較した（図１参
照）。図１から分かるように、AgNO3を培地に加えた時
（−●−）とタキソール生産量98.95mg/Lは、対照（−
○−）の4.7倍であることが明確に確認された。
14日齢細胞培養物を含有する75mlのB5培地を注ぎ、実施
例２と同様にインキュベートした。次に、タキソールの
生産性をAgNO3を含まない対照と比較した（図１参
照）。図１から分かるように、AgNO3を培地に加えた時
（−●−）とタキソール生産量98.95mg/Lは、対照（−
○−）の4.7倍であることが明確に確認された。
実施例4:タキソール生産性に対するHH4−クエン酸塩の
効果 HH4−クエン酸塩を添加した後、SYG−１の懸濁培地に
おけるタキソールの生産性をモニターした。250mlの三
角フラスコに75mlのB5培地を注ぎ、この培地に25mlの14
日齢細胞培養物を接種して、実施例２に記載の増殖条件
と同一の条件でインキュベートした。９日間のインキュ
ベーション後、5mMのNH4−クエン酸塩を培養物に加え、
NH4−クエン酸塩を添加しなかった対照とタキソール生
産性を比較した（図２参照）。図２から分かるように、
NH4−クエン酸塩を培地に加えた時（−●−）のタキソ
ール生産量は約103.6mg/Lで、これは対照（−○−）の
4.9倍であることが確認された。
効果 HH4−クエン酸塩を添加した後、SYG−１の懸濁培地に
おけるタキソールの生産性をモニターした。250mlの三
角フラスコに75mlのB5培地を注ぎ、この培地に25mlの14
日齢細胞培養物を接種して、実施例２に記載の増殖条件
と同一の条件でインキュベートした。９日間のインキュ
ベーション後、5mMのNH4−クエン酸塩を培養物に加え、
NH4−クエン酸塩を添加しなかった対照とタキソール生
産性を比較した（図２参照）。図２から分かるように、
NH4−クエン酸塩を培地に加えた時（−●−）のタキソ
ール生産量は約103.6mg/Lで、これは対照（−○−）の
4.9倍であることが確認された。
実施例5:タキソール生産性に対するマルトースの効果 植物細胞培養物における糖濃度の増加は、二次代謝物
生産の増加をもたらすことがよく知られている。例え
ば、３％（w/v）スクロースおよび５％（w/v）マンニト
ールの添加がDaucus（ニンジン属）carotaのカルス培養
におけるアントシアニンの生産性を改善したことが報告
されている（Knobloch,K.−H.ら,Zeiteshrift fur Natr
uforschung,35c:55−556（1981）参照）。また、88mMス
クロースおよび165mMマンニトールは、Vitis（ブドウ
属）viniferaの懸濁培養におけるアントシアニンの生産
性を増大させた（Rajendran,L.ら,Biotechnology Lette
rs,14（８）:707−712（1992）参照）。他方、ある濃度
を超えて糖を添加した場合、恐らく浸透圧のためと思わ
れる、増殖および二次代謝物生産の低下もまた報告され
ている（Do,C.B.およびCormier,F.,Plant Cell Report
s,9:500−504（1990）参照）。
生産の増加をもたらすことがよく知られている。例え
ば、３％（w/v）スクロースおよび５％（w/v）マンニト
ールの添加がDaucus（ニンジン属）carotaのカルス培養
におけるアントシアニンの生産性を改善したことが報告
されている（Knobloch,K.−H.ら,Zeiteshrift fur Natr
uforschung,35c:55−556（1981）参照）。また、88mMス
クロースおよび165mMマンニトールは、Vitis（ブドウ
属）viniferaの懸濁培養におけるアントシアニンの生産
性を増大させた（Rajendran,L.ら,Biotechnology Lette
rs,14（８）:707−712（1992）参照）。他方、ある濃度
を超えて糖を添加した場合、恐らく浸透圧のためと思わ
れる、増殖および二次代謝物生産の低下もまた報告され
ている（Do,C.B.およびCormier,F.,Plant Cell Report
s,9:500−504（1990）参照）。
SYG−１へのマルトース添加の効果を評価した。
250mlの三角フラスコに75mlのB5培地を注ぎ、この培
地に25mlの14日齢細胞培養物を接種して、実施例２に記
載の増殖条件と同一の条件でインキュベートした。次
に、２％（w/v）および３％（w/v）マルトースをそれぞ
れインキュベーション開始後９日目および21日目に培養
物に添加した。そして、タキソールの生産性をマルトー
スを含有しない対照と比較した（図３参照）。図３から
分かるように、マルトースを培地に加えた時（−●−）
のタキソール生産性は112.75mg/Lで、これは対照（−○
−）の5.3倍であることが確認された。
地に25mlの14日齢細胞培養物を接種して、実施例２に記
載の増殖条件と同一の条件でインキュベートした。次
に、２％（w/v）および３％（w/v）マルトースをそれぞ
れインキュベーション開始後９日目および21日目に培養
物に添加した。そして、タキソールの生産性をマルトー
スを含有しない対照と比較した（図３参照）。図３から
分かるように、マルトースを培地に加えた時（−●−）
のタキソール生産性は112.75mg/Lで、これは対照（−○
−）の5.3倍であることが確認された。
実施例6:SYG−１の半連続培養 実施例２から５で得られた結果に基づいて、SYG−１
の半連続培養を用いてタキソールを調製した。
の半連続培養を用いてタキソールを調製した。
250mlの三角フラスコに80mlの増殖培地と20mlの14日
齢SYG−１培養物を加え、そして培養の始めに10μM AgN
O3を加え、次に5mM NH4−クエン酸塩および２％（w/v）
マルトースをインキュベーション開始後９日目に加え
た。インキュベーション開始後21日目に、全培養物の1/
5容量に相当する20mlの培養物を80mlの新鮮な培地を含
有する別のフラスコに移し、別の培養サイクルを開始さ
せた。次に、全培養物の4/5容量に相当する80mlの残っ
た培養物に、３％（w/v）マルトースを添加し、さらに2
1日間インキュベートした。この期間にタキソール生産
は最大となる。この時、インキュベーションは24℃で、
攪拌速度150rpmで実施した。培養物サンプルを採取し、
定期的に微生物汚染をチェックした。また、培養物中に
生産されたタキソールの量を上記のように高速液体クロ
マトグラフィー（HPLC,Waters,U.S.A.）を用いて測定し
た。その結果、微生物汚染は観察されず、また、42日間
インキュベーションした後のタキソール生産性は284mg/
Lであることが確認された（図４参照）。図４から分か
るように、タキソール濃度は培養サイクルを繰り返すに
つれ増大した。
齢SYG−１培養物を加え、そして培養の始めに10μM AgN
O3を加え、次に5mM NH4−クエン酸塩および２％（w/v）
マルトースをインキュベーション開始後９日目に加え
た。インキュベーション開始後21日目に、全培養物の1/
5容量に相当する20mlの培養物を80mlの新鮮な培地を含
有する別のフラスコに移し、別の培養サイクルを開始さ
せた。次に、全培養物の4/5容量に相当する80mlの残っ
た培養物に、３％（w/v）マルトースを添加し、さらに2
1日間インキュベートした。この期間にタキソール生産
は最大となる。この時、インキュベーションは24℃で、
攪拌速度150rpmで実施した。培養物サンプルを採取し、
定期的に微生物汚染をチェックした。また、培養物中に
生産されたタキソールの量を上記のように高速液体クロ
マトグラフィー（HPLC,Waters,U.S.A.）を用いて測定し
た。その結果、微生物汚染は観察されず、また、42日間
インキュベーションした後のタキソール生産性は284mg/
Lであることが確認された（図４参照）。図４から分か
るように、タキソール濃度は培養サイクルを繰り返すに
つれ増大した。
上に明確に説明され、かつ実証されているように、本
発明はイチイ属植物の半連続培養による、タキソールを
高収率で大量生産する方法に関する。本発明によれば、
タキソールの生産性を改善するためAgNO3、NH4−クエン
酸塩およびマルトースを添加する半連続培養にTaxus ch
inensis SYG−１を用いた場合、インキュベーション開
始後40〜50日目に300mg/Lというレベルのタキソール生
産性が観察された。
発明はイチイ属植物の半連続培養による、タキソールを
高収率で大量生産する方法に関する。本発明によれば、
タキソールの生産性を改善するためAgNO3、NH4−クエン
酸塩およびマルトースを添加する半連続培養にTaxus ch
inensis SYG−１を用いた場合、インキュベーション開
始後40〜50日目に300mg/Lというレベルのタキソール生
産性が観察された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スタールフット・ロイ・ウイリアム アメリカ合衆国 94002 カリフォルニ ア ベルモント、 コロネット・ブルバ ード 2320 (72)発明者 キム・サンイク 大韓民国 139−220 ソウル ノウン ク、 チュンゲェドン、ダエリムビュク サン・アパート 102−605 (72)発明者 ユン・ジェオンホワン 大韓民国 305−348 タエジョン、ユソ ンク、 ホワムドン 63−２ (72)発明者 ソン・ボンキュ 大韓民国 305−390 タエジョン ユソ ンク、 ジェオンミンドン 462−４、 チェオングナラエ・アパート 109−303 (72)発明者 キム・ジンヒュン 大韓民国 302−222 タエジョン、セオ ク、 サムチュンドン、ソージュン・ア パート ３−303 (72)発明者 ソン・ジュンセオ 大韓民国 305−390 タエジョン、ユン ソク、 ジェオンミンドン 462−４ チェオングナラエ・アパート 104−305 (72)発明者 ホン・セウンスー 大韓民国 305−390 タエジョン、ユン ソク、 ジェオンミンドン 462−４ チェオングナラエ・アパート 109−404 (72)発明者 リー・ヒュンソー 大韓民国 158−070 ソウル、ヤンチュ ンク、 シンジュンドン 328、モクド ンシンシガジ・アパート 1331−603 (56)参考文献 特開 平８−140690（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−154693（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−52294（ＪＰ，Ａ) ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＥＴ ＴＥＲＳ，Ｖｏｌ．17，Ｎｏ．１，ｐ. 101−106（1995) Ｊ．Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．, Ｖｏｌ．144，ｐ．183−188（1994) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 17/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】下記の工程を含んでなる、半連続培養によ
るタキソールの大量生産方法： （ｉ）イチイ属植物細胞を１〜10％（w/v）の糖を含有
する培地に接種し、これをインキュベートし；そして （ii）上記工程（ｉ）で得られた培養物を体積比1/10乃
至1/2の量で新鮮な培地に移して上記の工程（ｉ）を繰
り返し、残りの培養物に１〜10％（w/v）の糖を添加
し、そしてタキソールの最大生産時までインキュベート
する。 - 【請求項２】イチイ属植物がタイヘイヨウイチイ（Taxu
s brevifolia）、カナダイチイ（Taxus canadensis）、
イチイ（Taxus cuspidata）、セイヨウイチイ（Taxus b
accata）、メキシコイチイ（Taxus globosa）、フロリ
ダイチイ（Taxus floridana）、インドイチイ（Taxus w
allichiana）、タクスス・メディア（Taxus media）お
よび中国イチイ（Taxus chinensis）からなる群より選
択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】イチイ属植物細胞が、Taxus chinensis S
YG−１（KCTC 0232BP）である、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項４】細胞培養の始めにAgNO3を１〜15μＭの濃
度で培地に添加する工程をさらに含む、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項５】インキュベーション開始後５から30日後
に、NH4−クエン酸塩またはマルトース、またはその両
方を、それぞれ１〜15mMおよび１〜10％（w/v）の濃度
で培地に添加する工程をさらに含む、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項６】タキソールの最大生産時が細胞培養開始後
40日から50日である、請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019950010204A KR960037826A (ko) | 1995-04-27 | 1995-04-27 | 택서스속 식물세포의 반연속식 배양방법 |
| KR1995/10204 | 1995-04-27 | ||
| PCT/KR1996/000060 WO1996034110A1 (en) | 1995-04-27 | 1996-04-27 | A method for mass production of taxol by semi-continuous culture |
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|---|---|---|---|
| JP2000036519A Division JP3331204B2 (ja) | 1995-04-27 | 2000-02-15 | 半連続培養によるタキソールの大量生産方法 |
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|---|---|
| JPH10504726A JPH10504726A (ja) | 1998-05-12 |
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ID=19413178
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP2000036519A Expired - Lifetime JP3331204B2 (ja) | 1995-04-27 | 2000-02-15 | 半連続培養によるタキソールの大量生産方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000036519A Expired - Lifetime JP3331204B2 (ja) | 1995-04-27 | 2000-02-15 | 半連続培養によるタキソールの大量生産方法 |
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| US6248572B1 (en) * | 1995-04-27 | 2001-06-19 | Samyang, Genex, Corporation | Production of taxol from taxus plant cell culture adding silver nitrate |
| DE69735059T2 (de) | 1996-05-24 | 2006-08-31 | Phyton, Inc. | Erhöhte produktion von taxanen durch zellkulturen von taxus-arten |
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| WO2006129988A1 (en) * | 2005-06-03 | 2006-12-07 | Samyang Genex Corporation | Mass production of secondary metabolite in plant cell culture by treatment of saccharide mixture in medicum |
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| CN101696436B (zh) * | 2009-10-30 | 2011-09-28 | 广东科伦药业有限公司 | 培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基 |
| KR20140031835A (ko) | 2010-10-04 | 2014-03-13 | 다이아나플랜트사이언시즈, 에스.에이.에스. | 식물 세포 배양으로부터 프로시아니딘의 생산 및 추출 |
| CN105349592B (zh) * | 2015-12-09 | 2018-11-27 | 天津艾赛博生物技术有限公司 | 代谢互补的植物细胞系混种培养生产次级代谢产物的方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO1992013961A1 (en) * | 1991-02-12 | 1992-08-20 | Nippon Steel Corporation | Process for producing taxol by cell culture of taxus species |
| US5344775A (en) * | 1991-11-15 | 1994-09-06 | Escagenetics Corporation | Synthesis of taxanes in culture using pseudocalluscells |
| US5407816A (en) * | 1992-02-20 | 1995-04-18 | Phyton Catalytic, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of taxus species |
| EP0633719A4 (en) * | 1992-04-01 | 1995-12-20 | Union Camp Corp | PROCESS FOR INDUCING SOMATIC EMBRYOGENESIS IN THE -i (TAXUS) AND PRODUCTION OF ALKALOIDS CONTAINING A TAXANE CORE ACCORDING TO THIS PROCESS. |
| US5279953A (en) * | 1992-06-24 | 1994-01-18 | Esca Genetics Corporation | In vivo production of taxanes |
| DE69426692T2 (de) * | 1993-11-15 | 2001-06-21 | Mitsui Chemicals Inc | Methode zur herstellung von taxan-diterpen und methode zum einten von kulturzellen, die taxan-diterpen in hohen ausbeuten herstellen |
-
1995
- 1995-04-27 KR KR1019950010204A patent/KR960037826A/ko active IP Right Grant
-
1996
- 1996-04-27 EP EP96912316A patent/EP0769064B1/en not_active Revoked
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- 1996-04-27 CN CNB011448776A patent/CN1184322C/zh not_active Expired - Lifetime
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- 1996-04-27 WO PCT/KR1996/000060 patent/WO1996034110A1/en active IP Right Grant
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2000
- 2000-02-15 JP JP2000036519A patent/JP3331204B2/ja not_active Expired - Lifetime
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