KR100276871B1 - 식물세포배양에서 에이지엔오쓰리 전처리에 의한 팩리택셀의 대량 생산 방법 - Google Patents

식물세포배양에서 에이지엔오쓰리 전처리에 의한 팩리택셀의 대량 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물세포를 배양하여 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체를 생산하는 방법으로, 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체 생산 단계 이전에 식물세포를 AgN03존재하에서 전배양하는 것으로 이루어지는 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해, 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체 생산 기간을 줄일 수 있을 뿐 아니라 생산량을 증가시킬 수 있다.

Description

식물세포배양에서 에이지엔오쓰리 전처리에 의한 팩리택셀의 대량 생산 방법
본 발명은 식물세포배양의 이차대사산물인 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체 의 대량생산 방법에 관한 것이다.
팩리택셀 또는 기타 택센 유도체는 택서스속 식물체의 줄기에서 분리된 택세인(taxane) 계열의 화합물로서, 택센 유도체 특히 팩리택셀은 세포분열시 방추사의 작용을 방해하여 백혈병 및 암에 치료효과를 나타내며, 난소암 환자의 약 30% 이상, 유방암 환자의 약 50% 및 폐암 환자의 약 20% 정도를 치유하는 효과가 있다고 보고되고 있다.
일반적으로, 팩리택셀 제조를 위한 방법으로는 화학적으로 팩리택셀을 합성하는 전합성(全合成)법, 합성시 바카틴(baccatin) 등의 전구체를 이용하는 반합성(半合成)법, 택서스속 식물로부터 팩리택셀를 직접 추출하는 추출법 및 팩리택셀 생산 세포주를 배양하여 팩리택셀을 수득하는 배양법 등이 알려져 있다. 이들 중에서, 식물세포의 배양법은 ① 추출법과 같이 병충해 및 자연재해 등에 의한 원료식물 공급의 기복에 영향을 받지 않고 일정량의 팩리택셀을 계속적으로 공급할 수 있으며; ② 팩리택셀의 복잡한 화학구조상 비용이 많이 들고 수율이 높지 못한 전합성법 및 반합성법과 비교할 때, 세포배양을 발효조에서 수행하여 외부조건을 조정하는 간단한 방법으로 팩리택셀의 대량생산을 유도할 수 있고; ③ 식물체로부터의 직접 추출시보다 식물세포의 배양시에 생성되는 화합물의 수가 적으므로 팩리택셀의 분리 및 정제가 용이하며, ④ 여러가지 변화에 대한 적응이 빠르고; ⑤ 팩리택셀 외에 바카틴과 같은 택세인 전구체도 생산할 수 있는 등의 장점을 지니고 있다.
세포배양에 의해 팩리택셀을 생산하는 방법에 대해서는 몇몇 보고되어 있는 선행기술들이 있다. 예를 들면, 미합중국 특허 제 5,019,504호는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 세포 배양에 의한 택세인 및 택세인과 유사한 화합물의 제조에 대하여 개시하고 있다. 그러나, 상기 기술에 의하여 배양된 식물세포는 배양 후 2 내지 4주내에 1 내지 3mg/ℓ라는 적은 양의 팩리택셀을 생산하며, 생물량(biomass)이 2배로 되는데 걸리는 배양시간은 7 내지 12일 정도로 길기 때문에 산업화에 부적당하고, 더우기 세포주의 팩리택셀 생산능이 안정되지 못하여, 계대배양이 거듭되면 세포주가 높은 생산성을 유지하지 못하는 것으로 보고되고 있다(참조: E.R.M. Wickremesine et al., World Congress on Cell and Tissue Culture(1992)).
또한, 국제특허 공개 제 WO 93/17121호는 배양 배지의 구성성분 등을 변화시키면서 여러 가지 택서스속 식물체를 세포배양한 후, 세포주의 성장속도 및 팩리택셀 생산율을 비교하고 그 결과에 의거한 다량의 팩리택셀을 제조하기 위한 조건을 개시하고 있는데, 택서스 취넨시스(Taxus chinensis)의 경우 배양 18일에 24.1 mg/ℓ의 팩리택셀을 생산하며, 생물량이 2배로 되는데 걸리는 배양시간은 2.5일 정도로 보고하고 있다.
미국특허 5,637,484에는 팩리택셀 생산성을 향상시키기 위하여 자스모닌 산(jasmonic acid) 존재하에서 팩리택셀을 생산하는 방법을 제시하였다.
본 발명자들은 PCT/KR96/00060을 통해, 팩리택셀 생산 단계에 AgNO3를 첨가하는 경우 팩리택셀 생산량이 증가한다는 것을 보고한 바 있다.
본 발명의 목적은 팩리택셀의 생산성을 향상시킨 팩리택셀 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물 세포주의 배양시 접종 균주를 고농도로 접종함으로써, 팩리택셀 생산성을 향상시키는 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 식물세포를 배양하여 택센 유도체를 대량 생산하는 방법으로, 생산 단계 이전에 택센 유도체 생산 세포를 AgNO3존재하에서 전배양하는 것으로 이루어지는 택센 유도체 대량 생산 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 특별한 한정이 없는 한, 택센 유도체는 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체를 모두 포함한다.
식물세포의 특성상, 식물세포 배양을 위해서는 신선한 배지에 약 20-30% 정도의 높은 비율로 세포 배양액을 접종하여야 하므로 식물세포의 대량 배양을 위해서는 접종량을 확보하기 위하여 여러 단계의 전배양을 거치게 된다. 일반적으로 플라스크 수준에서 대량 배양을 위한 규모, 예를 들어 10 M3이상으로 스케일업(scale-up)하기 위해서는 6 단계 이상의 계대배양과정을 거치면서 계대배양의 최적화 및 생산성에 관계된 요소들을 조절하는 것이 필요하다.
AgNO3는 일반적으로 식물세포의 생육을 저해한다고 알려져 있으며, 따라서 AgNO3를 배지에 첨가하는 경우 식물세포의 생육속도가 낮아진다.
본 발명자들은 택센 유도체를 생산하는 택서스 속 식물세포의 전배양 단계에서 AgNO3를 첨가하여 배양하는 경우 전배양 단계에서 식물세포의 성장은 다소 억제 되나 택센 유도체 생산 단계에서 생산 기간을 줄일 수 있을 뿐 아니라 전체적인 택 센 유도체, 특히 팩리택셀 생산성은 오히려 현저하게 증가된다는 것을 알게 되었다.
본 발명에 따른 택센 유도체 생산방법은 택서스속 식물세포를 접종한 배양액을 배양하여 택센 유도체를 생산하는 단계 이전에 수행되는 전배양 단계를 AgNO3가 첨가한 배지에서 수행되는 것으로 이루어진다.
본 발명에서 전배양은 택센 유도체 생산 단계 이전에 수행되는, 택센 유도체 생산을 위한 배지에 접종될 식물 세포를 확보하기 위해 수행되는 식물 세포와 배양 단계를 의미한다. 따라서 본 발명에서 의도하는 전배양 단계에서의 AgNO3첨가는, 택센 유도체 생산 단계 이전의 어떠한 단계에라도 적용될 수 있다. 예를 들어 택센 유도체 생산 단계 이전에 수행되는 전배양 단계가 여러 계대를 거치는 경우, 그 중 1회 또는 1회 이상의 계대 배양에 AgNO3를 첨가할 수 있다.
전배양은 회분식, 연속식 또는 반연속식 등 어떠한 형태로도 수행될 수 있다. 예를 들어 전배양이 회분식으로 수행되는 경우, 전배양액 전부가 다음 전배양 또는 택센 유도체 생산 배양을 위해 사용될 것이다. 전배양이 반연속식으로 수행되는 경우, 전배양액의 일부는 이후의 전배양 또는 택센 유도체 생산 배양을 위해 사용되고 나머지 배양액은 택센 유도체 생산을 위해 사용될 수 있을 것이다.
첨가되는 AgN03양은 세포 생육 억제와 택센 유도체 생산 증가를 고려하여 결정할 수 있으며, 예를 들어 1~10 uM, 바람직하게는 1-4 uM을 첨가할 수 있다.
전배양 단계에서 AgN03를 첨가하는 시기는 특별히 한정되지 않으며, 전배양 시작과 동시에 또는 전배양 중에 AgN03를 첨가할 수 있다.
본 발명에 따라 전배양 단계에 AgNO3를 첨가하면 전배양 단계에서의 세포 성장은 다소 저해되나, 택센 유도체 생산단계에서 생산 기간을 단축시킬 수 있을 뿐 아니라, 총 택센 유도체 특히 팩리택셀 생산량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 특별한 한정 없이 택서스속의 식물체에 적용될 수 있으며 , 예를 들어 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 커스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 왈리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 및 택서스 취넨시스(Taxus chinensis) 등에 적용될 수 있다.
한편, 본 발명에서 식물세포 배양을 위하여 사용되는 배지는 카제인 가수분해물을 함유하는 B5 배지(참조: Gamborg et al., Exp. Cell Res., 5O:151-158(1968))가 사용될 수 있으며, 팩리택셀 생산을 위해서는 표 1에 기재된 바와 같은 변형된 B5 배지가 바람직하다. 아울러, 팩리택셀의 생산을 촉진시키기 위하여 당, 바람직하게는 말토스를 배양 5 내지 30일 후에, 보다 바람직하게는 7 내지 12일 후 및 18 내지 24일 후 2회에 걸쳐서 한 회당 10 내지 100 g/ℓ, 보다 바람직하게는 10내지 40 g/ℓ를 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법은 추가로 택센 유도체 생산 단계에서 AgN03를 1~15uM 첨가하여 배양하는 것으로 이루어진다.
또한 본 발명의 방법은 추가로 세포 배양시 초기 세포 접종량을 정상적인 식물세포 배양에서의 접종량보다 높은 농도로, 예를 들어 세포건조중량으로 4 g/ℓ 이상으로 접종하는 것으로 이루어진다. 이와 같이 고농도로 세포를 접종하여 배양하는 경우, 초기 배지의 당 농도를 예를 들어 40 g/ℓ 이상으로 하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
250mℓ의 삼각플라스크에 각각 표 1의 배지 75 ml 및 14일 동안 배양한 택서스 취넨시스 SYG-1(KCTC-0232BP)의 배양액 25mℓ을 넣은 다음, 배양개시와 함께 각각 AgN03를 1 μM, 2 μM 및 4 μM을 첨가하고, 14일간 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양한 후 AgN03을 넣지 않고 계대배양하였다 (#1 계대). 14일 경과 후, 다시 AgNO3을 넣지 않고 계대배양하였다 (#2 계대). 14일 경과 후, AgNO34 μM이 포함된 표 1의 배지 75 ml에 세포배양액 25 ml을 넣고 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양하면서 배양 7일째 1%, 배양 21일째 2%의 말토오스를 첨가하면서 팩리택셀 생산량과 세포건조중량을 측정하였다.
세포건조중량을 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 먼저, 5.5 cm직경의 거름종이(No. 541, Whatman사, 미합중국)를 흡인 플라스크(suction flask)가 장착된 다공성 주발에 옮긴 후, 증류수를 가하여 주발과 거름종이를 완전히 밀착시켰다. 그런 다음, 분석하고자 하는 식물세포의 배양액 5mℓ를 취하여 준비된 거름종이 상에 도포하고, 플라스크에 흡인력을 가하여 거름종이 상의 수분을 제거하였다. 이 수분이 제거된 거름종이를 알루미늄 호일 접시에 담아 80℃의 오븐에서 24시간 동안 건조시키고, 건조가 끝나면 오븐에서 꺼내어 10분 동안 상온에서 방치한 후 알루미늄 호일 접시 및 거름종이 전체의 무게를 측정하였다. 이 측정 결과에서 미리 측정해 둔 알루미늄 호일 접시 및 거름종이의 건조중량을 감하고, 여기에 200을 곱함으로써 배양액 1리터 당 세포건조중량을 구하였다. 팩리택셀 생성량은 HPLC를 사용하여 아래 표 2의 조건에서 정량분석하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
[실시예 2]
250mℓ의 삼각플라스크에 각각 표 1의 배지 75 ml 및 14일 동안 배양한 택서스 치넨시스 SYG-1의 배양액 25mℓ을 넣은 다음, 배양개시와 함께 AgN034 μM을 첨가하고 14일간 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양한 후 AgNO3을 넣지않고 계대배양하였다.(#1 계대). 계대하고 남은 세포배양액 25 ml을 AgNO34 μM을 포함한 표 1의 배지 75 ml에 넣고 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양하면서 배양 7일째 1%, 배양 21일째 말토오스 2%를 첨가해주고 배양 28일째 팩리택셀의 생산성과 세포건조중량을 측정하였다 (#1 생산).
#1 계대에 의해 배양한 세포배양액을 14일후 다시 계대하고(#2 계대), #2 계대에 의해 배양한 세포배양액을 14일 후 다시 계대하였다 (#3 계대). 계대하고 남은 세포배양액 25 ml을 AgNO34 μM을 포함한 표 1의 배지 75 ml에 넣고 24℃, 150rpm의 조건으로 배양하였다. 배양 7일째 1%, 배양 21일째 2%의 말토오스를 첨가해주고 배양 28일째 팩리택셀의 생산성과 세포건조중량을 측정하였다 (#2 생산).
#3 계대에 의해 배양한 세포배양액을 14일후 다시 계대하였다 (#4 계대).
이때 새로 계대한 플라스크에 AgN034 μM을 첨가하였다. #4 계대에 의해 배양한 세포배양액을 14일 후 다시 계대하였다 (#5 계대), 계대하고 남은 세포배양액 25 ml을 AgNO34 μM을 포함한 표 1의 배지 75 ml에 넣고 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양하였다. 배양 7일째 1%, 배양 21일째 2%의 말토오스를 첨가해 주고 배양 28일째 팩리택셀의 생산성과 세포건조중량을 측정하였다 (#3 생산). 결과를 표 4 에 나타낸다.
[실시예 3]
250mℓ의 삼각플라스크에 각각 표 1의 배지 75 ml 및 14일 동안 배양한 택서스 치넨시스 SYG-1의 배양액 25mℓ을 넣은 다음, 배양개시와 함께 AgNO34 μM을 첨가하여 14일간 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양하였다. 배양 14일된 세포배양액 25 ml을 표 1의 배지 75 ml에 넣은 다음, AgNO34 μM을 첨가하고 14일간 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양하였다 (#1 계대). 위와 같은 방법으로 14일 간격으로 AgNO34 μM이 포함된 조건에서 계대를 계속하면서 #1 계대 후 (#1 생산), #3 계대 후 (#2 생산), #5 계대 후 (#3 생산), 각각 계대하고 남은 세포배양액 25 ml을 AgN034 μM이 포함 된, 표 1의 배지 75 ml 에 넣고 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양하면서 배양 7일째 1%, 배양 21일째 2%의 말토오스를 첨가하면서 배양 28일째 팩리택셀의 생산성과 세포건조중량을 측정하는 실험을 수행하였다. 결과를 표 5에 나타낸다
[실시예 4]
250mℓ의 삼각플라스크에 각각 표 1의 배지 75 ml 및 14일 동안 배양한 택서스 치넨시스 SYG-1(KCTC-0232BP)의 배양액 25mℓ을 넣은 다음, 배양개시와 함께 각각 AgN03를 0 uM,1μM,2μM 및 4 μM을 첨가하고,14일간 24℃,150 rpm의 조건으로 배양한 후 AgN03을 넣지 않고 계대배양하였다 (#1 계대). 14일 후, 다시 AgN03을 넣지않고 계대배양하였다 (#2 계대), 14일 후, 세포건조중량이 약 11.4 g/ℓ인 배양액을 세포 양을 2배로 농축하고, AgN034 μM이 포함된 표 1의 배지 75 ml에 농축된 세포배양액 25 ml을 넣고 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양하면서 배양 7일째 1%, 배양 21일째 2%의 말토오스를 첨가하면서 팩리택셀 생산량과 세포건조중량을 측정하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.
[실시예 5]
250mℓ의 삼각플라스크에 각각 표 1의 배지 75 ml 및 14일 동안 배양한 택서스 치넨시스 SYG-1의 배양액 25mℓ을 넣은 다음, 배양개시와 함께 각각 AgN03를 1 μM, 2 μM및 4 μM을 첨가하고, 14일간 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양한 후 AgN03을 넣지 않고 계대배양하였다 (#1 계대). 14일 경과 후, 다시 AgN03을 넣지않고 계대배양하였다 (#2 계대). 14일 경과 후 세포건조중량이 약 11.8 g/ℓ인 배양액을 세포양을 2배로 농축하고, 3% 자당이 아닌 6% 자당을 함유하며 AgN034 μM가 포함된 표 1의 배지 75 ml에 농축된 세포배양액 25 ml을 넣고 24℃, 150 rpm의 조건으로 배양 하면서 팩리택셀 생산량과 세포건조중량을 측정하였다. 결과를 표 7 에 나타낸다.
본 발명에 의하여 , 식물세포 배양에 의한 팩리택셀 생산 기간을 단축시킬 수 있으며 , 팩리택셀 생산성을 향상시킬 수 있다.

Claims (3)

  1. 택서스(Taxus)속 식물세포를 배양하여 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체를 생산하는 방법으로, 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체 생산 단계 이전에, AgN031~6 μM 존재 하에서 상기 식물세포를 전배양하는 것으로 이루어지는 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체의 대량 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체 생산 단계에서 택서스속 식물세포를 건조중량으로 4 g/ℓ 이상의 농도로 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 팩리택셀 또는 기타 택센 유도체 생산 단계에서 사용되는 배지가 40g/ℓ 이상의 당을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
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