KR960010562B1

KR960010562B1 - 한국산 주목의 배양세포를 이용한 택솔의 생산방법

Info

Publication number: KR960010562B1
Application number: KR1019920014517A
Authority: KR
Inventors: 한기태; 박이근; 박덕훈; 박수남; 박종문; 김승정
Original assignee: 태평양화학 주식회사; 한동근
Priority date: 1992-08-12
Filing date: 1992-08-12
Publication date: 1996-08-02
Also published as: KR940003947A

Abstract

내용 없음.

Description

한국산 주목의 배양세포를 이용한 택솔의 생산방법

제1도는 택솔표준물질의 고속액체크로마토그램이다.

제2도는 주목의 배양세포추출물의 고속액체크로마토그램이다.

제3도는 택솔준물질과 주목의 배양세포추출물을 혼합한 용액의 고속액체크로마토그램이다.

제4도는 택솔 표준물질을 이용한 본 발명의 방법에 의해 얻어진 택솔의 바이오 분석도이다.

본 발명은 주목식물체로부터 식물체의 일부를 채취하여 배양세포를 만들고 이 세포를 배양하여 항암제인 택솔(taxol)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

하기에 표시된 구조식의 택솔은 주목과 주목속에 속하는 주목(Taxus cuspidate), 태평양주목(Taxus brevifolia)등의 잎, 줄기, 뿌리등에 존재하는 물질로 1971년 바니등(M. C. Wani, H. L. Taylor, M. E. Wall, P. Coggon, and A. T. McPhail, J. Am. Chem. Soc., 93, 2325, 1973)에 의해 그 화학구조가 처음으로 밝혀졌다.

택솔은 여러가지 암세포주에 대해서 뛰어난 항암활성을 나타내어 의약품으로 개발되고 있으며, 특히 자궁암에 대해서는 임상실험 페이즈 I 단계를 거쳐 페이즈 II 단계에 있다. 이 물질은 주목의 줄기껍질부분에 약 0.01 내지 0.02퍼센트 정도로 가장 많이 함유되어 있는 것으로 밝혀져 있으나, 주모근 정원수로 일부재배되는 외에는 성장속도가 매우 느려 지금까지 목재등과 같은 용도로써 환영받지 못한 식물로, 그 수가 매우 적다. 더구나, 주목으로부터 추출되는 택솔의 양이 너무 적고 (1g의 택솔을 얻기 위해 10,000g의 주목 껍질이 필요하다), 추출 방법이 까다롭고 생산량도 적다.

따라서 세계적으로 택솔을 대량생산하는 방법에 관하여 많은 연구가 행해지고 있다. 택솔을 생산하는 방법으로 현재 고려되고 있는 것은 합성법, 식물조직 배양법, 주목재배법 등이다. 합성법은 그 단계가 복잡하고 수율이 낮아 산업적으로 대량생산하기에는 부적절한 방법이며, 주목재배법은 기간이 20년이상 소요되는 등 어려운 점이 있다. 따라서 가장 희망적인 방법으로 검토되고 있는 것이 식물조직배양에 의한 생산법이다. 1991년 미국의 크리스텐등이 태평양주목(Taxus brevifolia)의 조직배양에 의한 생산에 관해 미국특허(Alice A. Christen, Donna M. Gibson, John Bland, Production of Taxol or Taxol-like Compound in Cell Culture, USP 5,019,504)를 획득한 바 있으나 이 방법에 따른 경우 적어도 한국산주목으로부터의 캘러스유도율이 불량하며 세포성장속도로 느리고 택솔의 생산량도 매우 낮은 결과를 보이고 있다.

크리스텐 등에 위한 미국특허 상에 기술된 방법에 따라 B5 배지를 이용하여 캘러스 유도를 행하는 경우 캘러스의 갈변이 심히여 캘러스 유도가 양호하지 못하며, 호르몬인 2,4-D를 0.5 내지 1ppm의 양으로 사용하는 경우 캘러스의 유도 속도가 느린 것이 발견되었다. 따라서, 이런 문제점을 개선하기 위하여 본 발명자들은 B5 배지보다 무기 염류의 농도가 비교적 낮은 화이트(White) 배지 또는 헬러(Heller) 배지를 사용하고 2,4-D의 농도를 5 내지 20ppm으로 높여 캘러스를 유도한 결과 갈변화가 적은 양호한 상태의 캘러스를 유도할 수 있었다.

그러나, 이렇게하여 얻어진 캘러스를 저염 농도의 배지에 계속하여 계대배양하면 성장 속도가 느리고 갈변화가 계속되는 경향을 보였다. 따라서, 이러한 문제점을 개선하기 위하여 연구한 결과, 유도된 캘러스를 고염농도의 변형 무라시게-스쿡 배지, 셍크-힐데브란트 배지 등에서 2,4-D의 농도를 0.5 내지 2ppm으로하여 계대 배양한 결과 세포가 왕성하게 자라고, 또한 캘러스 유도시 또는 계대 배양시에 코코낫 워터를 0.5 내지 5%의 농도로 배지에 첨가하여 사용하면 캘러스 유도 및 계대 배양에 보다 효과적임을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 한국산 주목을 세포 배양하여 택솔을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 (a) 한국산 주목(Taxus cusidata)의 생 조직 일부를 채취하여 멸균하는 단계 ; (b) 상기 (a) 단계에서 준비된 멸균 조직을 5~20ppm의 2,4-D 및 0.5~5%의 코코낫 워터를 함유하는 화이트(White) 또는 헬러(Heller) 배지에서 배양하여 주목 조직의 캘러스를 유도하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 유도된 캘러스를 0.5~2ppm의 2,4-D 및 0.5~5%의 코코낫 워터를 함유하는 무라시게-스쿡(Murashige-Skoog) 또는 셍크-힐데브란트(SH) 배지에서 계대 배양하여 캘러스를 증식하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 증식된 캘러스를 액체 배지에서 현택배양하여 세포 현탁액을 얻는 단계; 및 (e) 세포 현탁액의 상층액 및 세포로부터 택솔을 추출 회수하는 단계를 포함함을 특징을 하는 주목의 조직 배양에 의한 택솔 생산방법에 의해 달성된다.

본 발명의 상기한 목적, 기타 그외의 목적 및 특징들은 하기 발명의 상세한 설명에 의해 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 방법에 있어서, 조직배양의 식물종으로는 주목속에 속하는 한국산주목(Taxus cuspidata)을 사용하였다. 또한 배양세포 유도에 사용되는 식물체부위로는 주목의 잎, 줄기, 줄기껍질, 뿌르등 어느 부분을 사용하여도 관계가 없으나 줄기 또는 줄기 껍질부분 또는 줄기의 형성층을 이용하는 것이 유리하다.

따라서 본 발명에서는 줄기, 줄기껍질 또는 이들의 형성층을 사용한 방법을 가지고 설명하도록 한다.

배양액의 오염을 방지하기 위하여, 조직은 배양배지에 넣기 전에 반드시 표면멸균되어야 한다. 염소 표백처리와 같은 공지의 멸균법이 효과적이다. 덧붙여, 안정성을 확보하기 위하여 암피실린, 포스포마이신 같은 살균제를 사용할 수도 있다.

적절한 조건 하에서 식물 조직 세포는 분화하여 캘러스(Callus)라고 알려진 조직을 형성한다. 캘러스는 고체 배지에서 배양하거나, 또는 바람직하게는 배지에서 단일 세포 또는 적은 세포군의 세포 현탁액으로 배양할 수 있다. 케러스의 대산 산물인, 예를 들면 택솔이나 기타 알칼로이드유는 켈러스 세포나 배지에서 분리할 수 있다.

캘러스 유도에 적뫙한 배지는 표 1에 나타낸 것과 같은 조성을 갖는 배지중에서 MS, SH, 화이트 또는 헬러 배지 등이다. 캘러스의 대사 산물 생산에는 질소원 등의 배지 조성이 그 생산성에 중용한 역활을 한다. 나아가, 캘러스의 유도에는 성장 호르몬인 2,4-D의 농고가 매우 중요하며, 5내지 20ppm의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.

1~2개월간 배양하여 형성한 캘러스는 2,4-D가 0.5 내지 2ppm의 양으로 첨가된 고체 배지에서 2주 내지 2달 간격으로 계대 배양하여 캘러스의 갈변을 막고 양호한 성장을 유지할 수 있다. 계대 배양 배지로는 염농도가 높은 무라시게-스쿡, B5 또는 셍크-힐테브란트 배지가 바람직하다. 또한 캘러스의 유도 및 계대 배양시에 코코낫 워터를 0.5 내지 5%의 양으로 첨가하는 것이 바람직하다.

계대 배양한 배지를 액체 배지에서 배양하여 세표 현탁 배양액을 얻을 수 있다. 약 2주간 배양 후, 택솔의 생산성을 향상시키기 위한 유도물질을 첨가할 수 있는데, 예를 들면 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea) KCTC 1937을 이용한 수 있다.

이하, 비제한적인 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하다.

실시예 2

야외에서 재배하는 조목의 줄기를 형성된지 1년 이하 경과한 어린줄기, 1년 내지 3년 경과한 줄기, 3년 이상 오래된 줄기로 구분하여 채취하였다. 채취된 줄기를 실험실에서 비누로 세척하여 표면의 오물을 제거하고 수돗물로 세척하여 비뉴를 완전히 제거하였다. 준비된 줄기를 10센티 길이로 절단하여 250ml 삼각 플라스크에 넣고 70% 에탄올을 가하여 30초간 멸균한 다음 1% 차아염소산나트륨 용액에 30분간 담가 줄기의 표면을 살균하였다. 살균이 끝난 후 준비된 멸균 증류수로 5회 세척하여 소독액을 완전히 제거하였다. 락스용액에 트윈-80등을 100ml당 1 내지 2방울 가하여 사용하면 효과적이며 멸균시 감압하에서 실시하면 더욱 효과적이었다. 멸균단계가 끝난 후 줄기를 페트리디시에 옮겨놓고 날카로운 칼로 가는가지는 0.5 센티미터 크기로 절단하여 각종의 고체배지위에 치상하였으며, 굵은 가지는 칼을 이용하여 껍질을 벗겨내어 1평방센티미터 크기로 절단하여 각종의 고체배지위에 치상하였으며, 굵은 가지는 칼을 이용하여 껍질을 벗겨내어 1cm²크기로 절단하여 각종의 고체배지에서 치상하였다. 치상이 끝난 페트리디시는 배양실로 옮겨 한달간 배양하여 캘러스들 유도하였다. 배양실의 배양조건은 25^oC 암조건으로 하였다.

실시예 2

실시예 1에서 화이트 배지로부터 유도된 캘러스를 2,4-D 1ppm이 첨가된 화이트 고체배지에 옮겨 계대배양하였다. 계대배양 간격은 2주 내지 2개월로 하였고, 계대배양중인 캘러스는 생체중량이 10g 정도 되면 액체배지에 옮겨 액체배양을 실시하였다. 액체배지는 250ml 플라스크에 70ml의 배지를 넣고 배양하였으며, 초기 세포 접종량은 생체중량으로 10g으로 하였고 배양기의 회전속도는 120rpm으로 하였다. 액체배지에서 1달간 키운 배양액은 동일조건에 배지에 접종량이 20%로 되게 조성하여 계속적으로 계대배양하였다.

실시예 3

실시예 1에서 유도된 캘러스를 다시 표 1의 2,4-D 1ppm이 첨가된 B5 고체 배지에 옮겨 계대배양을 하였다. B5 배지에 옮겨 배양할 경우 캘러스의 성장속도는 화이트배지에 비하여 빠르게 성장하였으며 갈변화되어 죽은 경향도 적었다.

실시예 4

실시예 3의 B5 배지를 표 1의 이사디 1ppm이 첨가된 무라시게-스쿡고체배지로 대치하여 동일하게 계대배양하였다. 이 경우에도 화이트배지에 비하여 성장 속도가 훨씬 빠르게 나타났다.

실시예 5

실시예 4의 B5 배지를 표 1의 2,4-D 1ppm이 첨가된 셍크-힐데브란트 고체 배지로 대치하여 동일하게 계대배양하였다. 이 경우에도 화이트 배지에 비하여 성장속도가 훨씬 빠르게 나타났다.

실시예 6

실시예 1 내지 5에서 2,4-D 대신 동일 농도의 초산나프탈렌산(α-Naphthalene acetic acid)으로 대치하여 배양하였다. 이 경우 2,4-D를 사용한 경우가 배양상태가 양호하고 성장속도 빨랐다.

실시예 7

실시예 3의 캘러스를 10g 취하여 70ml의 B5 액체배지를 넣은 250ml 플라스크에 넣고 현탁배양하였다. 현탁배양시 진탕속도는 120rpm으로 하였으며 배양 온도는 25^o로 하였다. 현탁배양세포는 작은 덩어리로 퍼져 성장하여 현탁배양에 양호하였다.

실시예 8

실시예 1 및 3 내지 7에서 배지에 코코낫 워터를 1% (부피 비율)의 양으로 첨가하여 배양하면, 캘러스의 유도 및 계대 배양 세포의 생육상태가 보다 양호하고 성장속도가 빨랐다.

실시예 9

실시예 7의 배양액을 14ml 취하여 56ml의 배지가 들어있는 250ml 삼각 플라스크에 넣고 현탁배양하였다. 2주간 배양한 후 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea KCTC-1937)의 멸균배양액을 첨가하여 1주간 배양하였다. 배양이 끝난 후 연과지로 여과하여 세포와 배양액을 분리하고 세포는 60^oC에서 하루동안 건조한 후 세포건량의 10배의 에탄올을 가하여 진탕하면서 택솔을 추출하였다. 4시간 추출훈 감압농축하여 건조시킨 후 물에 분산시키고 메틸레클로라이드를 가하여 추출하여 농축하고 1ml의 에탈올에 녹여 고속액체크로마토그라피를 이용하여 택솔의 함량을 분석하였다. 또한 배양액을 메틸렌클로라이드로 추출하여 감압건조시키고 1ml의 에탄올에 녹여 고속액체크로마토그라피를 이용하여 택솔의 함량을 분석하였다. 고속액체크로마토그라피의 분석조건으로는 칼럼 Ricrsorb RP-18, 용매 메탄올/물/메틸렌클로라이드=20/41/39로 하였다. 제1도에서 보는 바와 같이 클로마토그램에서 택솔표준물질은 13분대에서 피크가 나타나면 제2도의 캘러스 추출물의 크로마토그램에서도 동일하게 13분대에서 택솔피크가 검출되었다. 이를 좀더 정확히 확인하기 위해서 택솔과 캘러스 추출물을 약 1 : 4로 섞어 분석한 결과, 제3도의 크로마토그램과 같이 13분대의 택솔피크만이 크게 나타남을 확인할 수 있었다. 따라서 캘러스추출물에는 택솔이 함유되어 있음을 확인할 수 있었으며 그 함량은 배지 1리터당 약 0.1 내지 0.3mg이었다.

실시예 10

실시예 9에서 추출한 택솔은 다시 대량분리용 고속액체크로마토그라피를 이용하여 택솔분획만을 분취하여 순수한 택솔을 획들하였다. 분리한 택솔과 표준물질을 이용하여 하기와 같은 방법으로 분리정제된 마이크로튜블린을 이용하여 하기와 같은 방법으로 생물검정시험을 실시하였다.

[튜브린의 정제]

뉴블린의 분리는 아네스와 윌슨(Anes and Wilson)의 방법을 변형한 파렐과 윌슨(Farrell and Wilson)의 방법을 이용하였다(Biochemistry Vol.23, 1984, p3741~48). 소뇌를 2회 폴리머화하여 얻어진 튜블린은 사용전까지 -70^oC에서 펠릿상태로 보관하였다.

[택솔의 퓨브린의 폴리머화 유도에 의한 생물검정시험]

상기 방법으로 얻어진 튜블린을 완충용액(100mM MES, 1mM EGTA, 1mM MgSO₄, pH 6.6)에 현탁시켜 4^oC에서 15분간 디폴리머리제이션을 시킨 후 원심 분리하여 상등액을 사용하였다. 튜블린의 농도를 1mg이 되게 조절한 후 지티피를 최종농도가 1밀리몰이 되게 첨가하여 4^oC, 350나노메타의 파장에서 흡광도를 측적하였다. 4^oC에서의 흡광도 값이 안정되면 37^oC로 온도를 올려 폴리머화를 유발시킨 후 흡광도값의 증가가 둔화되었을때 택솔을 처리하여 350나노메타에서 흡광도값의 변화를 관찰하였다.

제4도에서 볼 수 있는 바와 같이 튜블린용액의 흡광도는 초기 약 60분 까지는 계속적으로 증가하나 이후 약 150분까지는 안정화되어 변화가 거의 나타나지 않았다. 이렇게 흡광도의 변화가 안정화되면 약 150분 경과시점에서 택솔을 처리하면 흡광도는 튜블린의 폴리머화에 의해 증가하는 것을 보였다. 택솔표준물질을 처리하였을 경우와 본 실험에서 캘러스로부터 분리한 택솔을 처리하였을 경우는 같은 경향으로 튜블린의 폴리머화를 촉진하는 것을 보였다. 따라서 캘러스로부터 분리한 물질은 택솔임을 확인할 수 있었다.

Claims

하기의 단계(a)~(e); (a) 한국산 주목(Taxus cuspidata)의 생 조직 일부를 채취하여 멸균하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 준비된 멸균 조직을 5~20ppm의 2,4-D 및 0.5~5%의 코코낫 워터를 함유하는 화이트(White) 또는 헬러(Heller) 배지에서 배양하여 주목 조직의 캘러스를 유도하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 유도된 캘러스를 0.5~2ppm의 2,4-D 및 0.5~5%의 코코낫 워터를 함유하는 무라시게-스쿡(Murashige-Skoog) 또는 셍크-힐데브란트(SH) 배지에서 계대 배양하여 캘러스를 증식하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 증식된 캘러스를 액체 배지에서 현택배양하여 세포 현탁액을 얻는 단계; 및 (e) 세포 현탁액의 상층액 및 세포로부터 택솔을 추출 회수하는 단계를 포함함을 특징을 하는 주목의 조직 배양에 의한 택솔 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 현탁 배양 시에 택솔의 생산을 증가시키기 위한 유도물질로서 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea KCTC-1937)의 멸균 배양액을 첨가함을 특징으로 하는 방법.