KR970009147B1 - 꾸지뽕나무 모상근 배양에 의한 후라보노이드계 항암물질의 생산방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

꾸지뽕나무 모상근 배양에 의한 후라보노이드계 항암물질을 생산방법

본 발명은 민간에서 사용되고 있는 약용식물의 하나인 뽕나무과 식물인 꾸지뽕나무 모사은 배양에 의하여 여러가지 암세포주에 대해 세포독성을 나타내는 것으로 밝혀진 유용 후라보노이드(flavonoid) 화합물인 제리쿠드라닌(gericudranin)화합물의 생산 방법에 관한 것이다

제리쿠드라닌 물질은 몇몇 그람양성세균 및 그람음성세균에 항균력을 나타낼 뿐만 아니라, 특히 간암세포, 폐암세포, 대장암세포, 자궁암세포, 피부암세포, 중추신경계 암세포 등 각종 암세포주에 대해 강한 항암활성을 나타내는 물질로 유 등에 의해 최초로 분리되었다(대한민국 특허출원번호 제92-18255호 참조).

상기 제리쿠드라닌 물질의 추출에 이용되는 약용식물로는 뽕나무과에 속하는 다년생 목본 소교목으로 민간에서 고혈암, 간장질환, 여러가지 암질환 등의 악성질환에 그 뿌리와 줄기를 달여 먹으면 효과가 있는 것으로 알려져 있는 꾸지뽕나무(정민섭, 신교민 공저 ; 도해향약(생약)대사전, 신물편, 영림사, 1990년)를 사용할 수 있다. 또한 문헌에 의하면 꾸지뽕나무는 소염, 진통, 혈행개선 및 여러가지 악성종양에 효과가 잇는 것으로 보고되어 있다(후꾸시마 ; 함암중약의 임상적 응용, 치의약 출판사, 1987년).

현재까지 응용 생리활성 물질을 함유하는 자원식물의 대부분은 자연에서 채취하거나 또는 포장에서 재배한 것을 사용하여 왔다. 그러나 이들 자원식물의 남획이나 환경오염으로 자연 생태계의 파괴등에 기인한 유용식물의 멸종, 기후, 병·해충 및 지정학적 이유 등에 기인하여 균일한 품질의 원료를 안정적으로 공급하는데는 한계가 있다.

따라서 자원식물의 재배나 야생채취에 대한 대안의 하나로 식물세포 조직배양 기술에 의한 유용 생리활성물질 생산이 대두하게 되었다. 그러나, 식물세포 조직배양 기술은 식물을 탈분화시킨 세포상태로 배양하는 것으로, 탈분화된 세포배양의 경우 외부에서 인위적으로 성장호르몬을 첨가하여야 원활한 세포생육을 유지할 수 있고, 유용 대사산물 생산능에 있어 유전적으로 불안정성을 나타내는 경우가 많다.

이에 본 발명자들은 모상근 배양 등을 통하여 자체적으로 성장호르몬을 조절할 수 있는 식물기관 상태로 식물세포를 배양하면 그 안정성이 유지됨을 알게 되어 본 발명에 이르게 되었다.

따라서, 본 발명은 꾸지뽕나무에서 유도해낸 뿌리(모상근)를 식물세포 조직배양 기술을 이용, 생물반응기에서 배양함으로써 뿌리 세포로 하여금 유효성분인 후라보노이드계 항암물질을 기존의 식물체보다 더욱 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명을 보다 구체적으로 설명하면, 무균 발아시킨 꾸지뽕나무에 식물 병원균의 일종인 아그로박터 라이조게네스(Agrobacter thizogenes, 기탁번호 ATCC 43057)를 감염시켜 유도해낸 모상근을 식물 성장 호르몬 무첨가 배지에서 배양한 후 유용 후라보노이드를 분리·추출함을 포함하는 후라보노이드를 생상하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 꾸지뽕나무의 모상근을 흡착제를 첨가하여 배양시킴으로써 항암활성물질인 제리쿠드라닌 후라보노이드의 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시태양을 따르면 상기 모상근을 식물 성장 호르몬 무첨가 쎈크 앤드 힐데브란드 배지(시그마시약 카나로그 번호, 에스 6765)에서 25~30℃ 에서 30~40일동안 배양시킨 후 상기 배양액을 메탄올 등의 알코올로 추출하고, 추출액을 감압농축한 후 염산등의 강산으로 가수분해시키고 다시 에틸 아세테이트로 추출한 추출액을 재차 알코올로 용해시킨 후 고성능 액체 크로마토그래피시켜하기 구조식을 갖는 제리쿠드라닌 에이(A) 및 비(B)를 얻는다.

본 발명은 모상근을 진탕 배양하며, 배지는 식물 조직 배양시 통상적으로 사용되는 것들을 사용할 수 있다. 후라보노이드의 생산성을 향상시키기 위해 첨가되는 흡착제로는 비이온형 흡착 수지, 예를 들면 엑스에이디(XAD) 흡착제를 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면 자연에서 채취한 꾸지뽕나무로 부터 얻을 수 있는 제리쿠드라닌 물질 생산량보다 3내지 5배 이상, 특히 흡착제를 첨가할 경우에는 7.5배 내지 17배 이상의 많은 양의 제리쿠드라닌을 생산할 수 있는 특징이 있다.

한편, 꾸지뽕나무 모상근 뿐만아니라 뽕나무과에 속하는 식물의 모상근도 사용할 수 있으며 이를 배양하여 항암 활성물질인 제리쿠드라닌을 분리·정제하는 본 발명의 정제방법은 당해 분야의 통상의 지식을 가진자에게 자명한 방법으로 변형시킬 수도 있음은 물론이며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

이하 본 발명의 내용을 구체적인 실시예를 들어 다음과 같이 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명이 실시예에 의거 한정되는 것은 아니다.

실시예 1) 모상근 배양에 의한 후라보노이드계 항암활성물질의 생산

식물조직 배양시 통상적으로 이용하고 있는 식물성장 호르몬 무첨가 센크앤드 힐데브란트배지(시그마시약 카다로그 번호 에스 6765)를 1/3로 희석한 후 250㎖ 삼각플라스크에 50㎖를 가하고 멸균한 다음, 꾸지뽕나무에 식물병원균의 일종인 아그로박터 라이조게네스(Agrobacter rhizogenes, 기탁번호 ATCC 43057)를 감염시킨 후, 꾸지뽕나무 뿌리로부터 유도된 모상근 0.18g(습제 중량)을 접종하여 25℃, 100rpm의 조건에서 30일간 진탕배양하였다. 상기와 같이 배양하여 모상근 배양물 0.211g(건체중량)을 얻었다. 얻어진 모상근 배양물 0.2g을 80% 메탄올 5㎖ 용액으로 하루밤 침출하여 활성물질을 추출하고 추출액을 감압농축하여 메탄올을 제거하였다. 상기에 2N 염산 5㎖를 가하고 100℃에서 30분간 가수분해한 후 에틸아세테이트 5㎖를 가하여 추출한 추출물을 감압농축시킨 후 재차 메탄올에 용해하여 고속 액체크로마토그래피(오디에스 컬럼 4.6ψ×150m, 28% CH₃CN1㎖/분)로 정량하였다.

이상과 같이 실시하여 하기 표 1과 같이 모상근 건체중량당 각각 0.11%의 항암활성을 갖는 제리쿠드라닌 에이 및 비 화합물을 생산할 수 있었다.

실시예 2) 흡착제 첨가에 의한 제리쿠드라닌 후라보노이드 항암활성물질의 생산

상기 실시예 1)의 배양조건에서 모상근 비이온형 흡착물질인 엠버라이트 엑스에이디 수지(Amberlite XAD resin)를 배지 부피당 10%가 되게 첨가한 후 동일조건으로 배양하여 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 비이온형 흡착 물질 무첨가시보다 약 2내지 3배 이상의 많은 제리쿠드라닌 후라보노이드 항암 활성물질을 생산할 수 있었다.

즉, 자연으로부터 채취한 꾸지뽕나무 뿌리중의 제리쿠드라닌 에이 및 비 함량은 각각 건체 중량당 0.02, 0.08 퍼센트 정도 함유 되어 있으나(대한민국 특허출원번호 제18255호(1992)), 배양 모상근 세포의경우 상기 후라보노이드 함유량은 흡착제 무첨가 배양의 경우 제리쿠드라닌 에이가 모상근 생산량의 0.11%로 자연에서 채취한 꾸지뽕나무 뿌리에 비하여 5배, 제리쿠드라닌 비가 0.12%로 4배 이상 함유되었고 흡착제로서 엑스 에이 디-7 수지를 첨가 배양하였을 경우 제리쿠드라닌 에이가 모상근 생산량의 0.35%로 자연에서 채취한 꾸지뽕나무 뿌리에 비하여 17배, 제리쿠드라닌 비가 0.78%로 7.5배 이상 함유되어 있었다.

이상의 실시예에서와 같이 꾸지뽕나무 모상근 세포 배양에 의하여 자연에서 채취한 식물체보다 휠씬 높은 수준으로 유용 후라보노이드의 생산이 가능하게 되었다.

Claims (3)

1. 뽕나무과에 속하는 꾸지뽕나무 식물체에 식물병원균 아그로박터 하이조게네스(Agrobacter rhizogenes, 기탁번호 ATCC 43057)를 감염시켜 식물세포로 부터 유도된 모상근을 조직 배양시킴을 포함하는, 제리쿠드라닌 유도체를 함유하는 후라보노이드를 생산하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 모상근 배양시 흡착제를 첨가함을 포함하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 흡착제가 비이온형 흡착수지인 방법.