CN102488779A - 鹿茸草提取物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中医药领域，公开了鹿茸草提取物在制备预防和治疗心肌缺氧缺血疾病药物中的应用。本发明采用DPPH法测定鹿茸草提取物对氧自由基的清除能力，结果显示鹿茸草提取物可以剂量依赖的方式清除氧自由基。采用H₂O₂致心肌细胞损伤模型检测鹿茸草提取物对H₂O₂致大鼠心肌细胞氧化损伤存活率及心肌细胞形态的影响。结果显示鹿茸草提取物可以剂量依赖性的提高心肌细胞存活率，同时明显改善心肌细胞形态，抑制过氧化损伤。此外，鹿茸草提取物还能明显降低大鼠心肌细胞内LDH和MDA的含量。体内实验还表明鹿茸草提取物能降低冠脉结扎致大鼠心肌梗死面积。因此本发明提供了鹿茸草提取物在制备预防或治疗心肌缺氧缺血疾病药物中的应用。

Description

鹿茸草提取物的应用

技术领域

本发明涉及中医药领域，具体的说是涉及鹿茸草提取物在制备预防和治疗心肌缺氧缺血疾病药物中的应用。

背景技术

鹿茸草，英文名：Antlerpilose grass，为玄参科鹿茸草属植物绵毛鹿茸草(Monochasma savatieri Franch)的全草，植株高15～40厘米，全体被银白色密绒毛。茎细而硬，呈丛生状分枝。叶对生或三叶轮生，密集，节间短缩；基部叶为鳞片状，长3～5毫米；上部叶为狭披针形，长1～2厘米，宽1～3毫米，全缘，先端渐尖，基部狭窄，无柄。花单生于叶腋，每花有2枚线形小苞片，着生于萼筒基部；花萼筒状，筒部长5～7毫米，上部4裂，裂片与萼筒近等长，有助9～10条；花冠淡红色，唇形，长2～2.5厘米。上唇兜状弯曲，2裂，裂片钝圆，下唇3裂，中间裂片较长，喉部有2钩；雄蕊4，二强；子房卵圆形，花柱细长。蒴果长圆形，先端尖锐，具4纵沟，包于萼内；种子黄色，多数，细小，扁椭圆形。花期4～5月。鹿茸草别名白头翁、千重塔、白头毛等，分布于江苏、浙江、江西、福建、台湾、湖南、广东等地，在中国江西省分布广泛，自南至北均有，常生于山坡向阳处、杂草中或林下，夏、秋季采收，鲜用或晒干。

鹿茸草味苦、性凉，具有清热解毒、凉血止血，祛风止痛等功效，中医临床常用于感冒，慢性支气管炎，咳血，吐血，便血，肺炎，牙龈炎，牙髓炎，乳痈，痈肿，小儿口疮，风湿关节痛等症的治疗。中成药品种“炎宁颗粒”即是以鹿茸草为主药，并与白花蛇舌草、鸭跖草进行配伍，具有清热解毒，消炎止痢等功效，用于治疗上呼吸感染，扁桃体炎，尿路感染等，临床疗效确切。

目前鹿茸草的化学成分研究有关报道较少，现有的文献报道鹿茸草包括环烯醚萜类、酚酸类(如4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、绿原酸等)、黄酮类、三萜类、有机酸类等化学成分。据文献报道鹿茸草中的这些绿原酸类、倍半萜内酯类成分、黄酮类物质有抗炎、杀菌等广泛的药理活性，可以用于治疗慢性气管炎。申请号为CN200910164330.3的中国专利公开了分离鉴定了鹿茸草提取物中的苯乙醇苷类成分，证明所述苯乙醇苷类成份及其组合物具有抗菌、抗炎等活性，可用于制备抗菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)、抗炎等疾病药物。然而，还未见鹿茸草及其提取物在心血管疾病的预防和治疗方面的相关研究报道。

大部分心血管疾病都与缺血、缺氧有关。心肌缺氧缺血的病理生理基础是心肌的血氧供应失衡，因冠状动脉粥样硬化导致冠状动脉狭窄堵塞或痉挛，使心肌得不到足够的血氧，导致心肌细胞老化、受损，引发心脏病。又如心肌梗死是由于冠状动脉闭塞、血流中断所引起心肌严重而持久的缺血所引起的心肌坏死。缺血、缺氧与心血管疾病互为因果，成为影响生命的直接杀手。因此，提供鹿茸草提取物在制备预防和治疗心肌缺氧缺血疾病药物中的新应用，对心肌缺氧缺血疾病的防治具有重要意义。

发明内容

本发明提供了鹿茸草提取物的新应用，即鹿茸草提取物在制备预防和治疗心肌缺氧缺血疾病药物中的应用。

过量的自由基在机体中引起一系列生物学反应，导致组织细胞、亚细胞和分子结构的破坏，并随着破坏层次逐渐扩展造成功能损伤，引起心血管疾病、癌症和衰老等，它是构成很多疾病的病理学基础。氧自由基也是引起急性心肌缺血损伤的主要因素。因此，本发明首先采用DPPH法测定鹿茸草提取物对氧自由基的清除能力。结果显示，鹿茸草提取物在15.625～500μg/mL范围内可以剂量依赖的方式清除氧自由基，其中在125μg/mL时氧自由基清除率为89.69％。表明本发明所述鹿茸草提取物具有清除氧自由基的作用，因此本发明提供了鹿茸草提取物在制备氧自由基清除剂中的应用。

H₂O₂是一种强氧化剂，可形成羟自由基，造成大鼠心肌细胞氧化损伤。H₂O₂致心肌细胞损伤模型是心肌缺血缺氧损伤中经典的细胞模型。本发明采用H₂O₂致心肌细胞损伤模型，检测了所述鹿茸草提取物对H₂O₂致大鼠心肌细胞氧化损伤存活率的影响。结果显示，所述鹿茸草提取物在37.5～600μg/mL的范围内可以剂量依赖性的提高心肌细胞存活率。表明鹿茸草提取物可抑制H₂O₂导致的心肌细胞氧化损伤。

大鼠心肌细胞未贴壁前呈圆形或椭圆形，培养4h后开始贴壁。贴壁后形态为梭形或不规则形，核仁清晰。单个细胞一般贴壁后即出现节律性搏动，搏动频率并不统一。心肌细胞培养24h后可完全贴壁，培养2-3天后可形成单层，并出现同簇细胞的同步搏动，收缩明显而有力。不同细胞簇的波动频率并不完全相同，慢的每分钟数次，最快的每分钟可达数百次以上。本发明采用H₂O₂损伤致心肌细胞损伤模型观察所述鹿茸草提取物对大鼠心肌细胞形态的影响，结果显示过氧化氢损伤后，细胞破损，部分细胞结构破坏严重，而150μg/mL和600.0μg/mL的鹿茸草提取物能明显改善心肌细胞形态，抑制过氧化损伤。结果表明鹿茸草提取物对大鼠心肌细胞缺氧损伤具有保护作用，可明显改善心肌细胞形态，抑制过氧化损伤。

大鼠心肌细胞经过氧化氢损伤后，细胞释放的过氧化脂质，如丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)等物质的含量会明显升高。本发明通过检测大鼠心肌细胞中MDA和LDH的含量考察鹿茸草提取物对H₂O₂致大鼠心肌细胞损伤的保护作用，结果显示，25-400μg/mL鹿茸草提取物能明显降低心肌细胞释放MDA和LDH的含量，表明鹿茸草提取物能抑制心肌细胞释放LDH和MDA，对H₂O₂致大鼠心肌细胞损伤具有保护作用。

因此本发明提供了鹿茸草提取物在制备H₂O₂致心肌细胞氧化损伤抑制剂中的应用。

心肌缺氧缺血疾病最根本的防治措施是改善血供，降低氧耗，通过清除或对抗有害物质对心肌的不良影响以保护心肌。在心肌缺血缺氧损伤的发病机制中氧自由基起关键作用。在缺血/再灌注期间可产生大量的氧自由基，氧自由基可导致脂质过氧化，破坏细胞膜，细胞内钙超载，引起心肌细胞损伤，造成心功能紊乱和引发心律失常。H₂O₂是体内氧化代谢的中间产物，同时又是一种活性氧，过量的H₂O₂会导致心肌细胞损伤。上述结果表明鹿茸草提取物具有清除氧自由基的作用同时对H₂O₂导致的大鼠心肌细胞缺氧损伤具有保护作用，可明显改善心肌细胞形态，抑制过氧化损伤，可达到预防和治疗心肌缺氧缺血疾病的目的。

另外，本发明采用SD大鼠，结扎冠状动脉造成急性心肌缺血缺氧模型，发现鹿茸草提取物能降低心肌梗死面积，对大鼠心肌缺血缺氧有保护作用。表明鹿茸草提取物对急性心肌缺血缺氧有保护作用。

因此本发明提供了鹿茸草提取物在制备预防或治疗心肌缺氧缺血疾病药物中的应用。其中，所述心肌缺氧缺血疾病为冠心病或心绞痛。

本发明所述鹿茸草提取物是指从绵毛鹿茸草提取得到的任何形式的提取物，包括但不限于本发明实施例中制备得到的鹿茸草提取物。在一个具体实施方式中按照申请号为CN200910164330.3的中国专利中的方法经含水有机溶剂从绵毛鹿茸草中提取，再经大孔树脂精制得到鹿茸草提取物。在另一具体实施方式中，所述鹿茸草提取物为绵毛鹿茸草经水煎，收集煎煮液，再经大孔树脂精制得到。

本发明还提供了一种预防或治疗心肌缺氧缺血疾病的药物制剂，由有效量的鹿茸草提取物和药学上可接受的辅料组成。本领域技术人员可将所述鹿茸草提取物直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如崩解剂、润滑剂、乳化剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用剂型如口服液、胶囊剂、涂剂、巴布剂、喷雾剂、注射剂、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂或滴丸剂。所述制剂可以通过以下方式中的适合方式给药：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、阴道给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。

本发明所述预防或治疗心肌缺氧缺血疾病的制剂的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病程严重程度以及诊治医师的主观判断。本领域的技术人员根据上述因素可以容易地决定使用剂量和使用方法。

附图说明

图1示实施例2鹿茸草提取物对自由基的清除能力的统计结果图；

图2示实施例4鹿茸草提取物对H₂O₂致心肌细胞损伤的保护作用的光学显微镜观察结果图(20×10)，其中图A为正常组；图B为模型组；图C为37.5μg/mL鹿茸草提取物处理组；图D为150μg/mL鹿茸草提取物处理组；图E为600μg/mL鹿茸草提取物处理组；

图3示实施例5鹿茸草提取物对H₂O₂致心肌细胞释放LDH含量影响的统计结果图；

图4示实施例5鹿茸草提取物对H₂O₂致心肌细胞释放MDA含量影响的统计结果图。

具体实施方式

本发明实施例公开了鹿茸草提取物在制备预防和治疗心肌缺氧缺血疾病药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1、鹿茸草提取物的制备

称取鹿茸草药材10kg，切碎，用20倍量50％乙醇分3次加热回流提取(8倍、6倍、6倍)，每次提取1.5小时，过滤，滤液合并，浓缩至每1ml相当于含1g生药材的量(浓缩温度65-70℃)。上AB-8型大孔树脂(柱床体积约5L)，上样后依次用3倍量蒸馏水、15％乙醇洗脱，60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱部分，蒸干即得鹿茸草提取物浸膏96g。

实施例2、鹿茸草提取物的制备

称取鹿茸草药材10kg，切碎，用26倍水量分3次加热煎煮(10倍、8倍、8倍)，每次煎煮2小时，过滤，滤液合并，浓缩至每1mL相当于含1g生药材的量(浓缩温度65-70℃)；滤液上预处理好的D101型大孔树脂(柱床体积约5L)，上样后依次用6倍量蒸馏水、10％乙醇洗脱，30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，蒸干得鹿茸草提取物浸膏110g。

实施例3、DPPH法测定鹿茸草提取物对自由基的清除能力

将实施例1制备的鹿茸草提取物加蒸馏水配成1mg/mL样品溶液，然后倍比稀释成500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL和15.625μg/mL六个浓度备用。同时以100μg/mL的维生素E(VE)溶液作为阳性对照。

分别取上述不同浓度的样品溶液100μL于96孔酶标板中，每个浓度做三个平行孔，然后分别加入100μL 1mM的DPPH试液，震荡30s，在37℃和517nm波长下测定各孔吸光值(Ap)。同时测定不加DPPH的样品溶液的空白吸收光值(Ac)和加DPPH但不加样品溶液(以100μL甲醇代替样品)的吸光值(A max)，实验重复三遍。按下述公式计算氧自由基的清除率，

自由基清除率(％)＝[1-(Ap-Ac)/A max]×100％

统计结果见图1。

由图1结果可见，实施例1制备的鹿茸草提取物在15.625～500μg/mL范围内可以剂量依赖的方式清除氧自由基，其中在125μg/mL时氧自由基清除率为89.69％。按上述方法测定实施例2制备的鹿茸草提取物对自由基的清除能力，结果显示，实施例2制备的鹿茸草提取物也可以剂量依赖的方式清除氧自由基，在125μg/mL时氧自由基清除率为85.32％。

实施例4、鹿茸草提取物对H₂O₂致大鼠心肌细胞氧化损伤存活率的影响

将实施例1制备的鹿茸草提取物加入在含有10％胎牛血清的DMEM培养基配成600μg/mL的样品溶液，然后倍比稀释成300μg/mL、150μg/mL、75μg/mL、37.5μg/mL和18.75μg/mL五个不同浓度备用。同时以终浓度为500μM的维生素E溶液作为阳性对照。

取大鼠心肌细胞(H₉C₂C₂-D，购于中国科学院细胞库)，调整细胞浓度为1×10₅个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后，随机分组进行实验。实验分为空白对照组，阳性对照组(维生素E，500μM)和鹿茸草提取物不同浓度组。加入鹿茸草提取物或培养基12小时后，加入H₂O₂(终浓度为200μM，临用配置，需避光)造模，造模24h后，每孔加入10μL 5mg/mL的MTT培养4h，倾去上清液，加入100μL的DMSO，振摇10min，用全自动酶标仪测定490nm处的吸光度值(OD490nm)，定量测定细胞存活率，结果见表1。

表1  鹿茸草提取物对心肌细胞存活率(％)的影响

注：*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组比。

由表1结果可见，实施例1制备的鹿茸草提取物在37.5～600μg/mL的范围内可以剂量依赖性的提高心肌细胞存活率。按上述方法测定实施例2制备的鹿茸草提取物对心肌细胞存活率的影响，结果显示实施例2制备的鹿茸草提取物也可以剂量依赖的提高心肌细胞存活率。

实施例5、鹿茸草提取物对大鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用的形态学观察

取大鼠心肌细胞(H₉C₂C₂-D，购于中国科学院细胞库)，在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5％CO₂条件下培养。培养至细胞达到85％～90％时，用0.5％胰酶消化细胞，按每孔3×10₅个细胞均匀加入6孔板中培养。将6孔板中培养24h的心肌细胞更换新培养液，然后每孔分别加入实施例1制备的不同浓度的鹿茸草提取物(37.5μg/mL，150.0μg/mL，600.0μg/mL)，空白对照加入相应的溶媒，12小时后分别在鹿茸草提取物组和空白对照组中加入200μL 200μmol/L的过氧化氢，24小时后观察细胞形态。

由图2可见过氧化氢损伤后，细胞破损，部分细胞结构破坏严重，而150μg/mL和600.0μg/mL的鹿茸草提取物能明显改善心肌细胞形态，抑制过氧化损伤。结果表明鹿茸草提取物对大鼠心肌细胞缺氧损伤具有保护作用。

实施例6、鹿茸草提取物对H₂O₂致大鼠心肌细胞中LDH和MDA含量的影响实验

大鼠心肌细胞(H₉C₂C₂-D，购于中国科学院细胞库)在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃和5％CO₂条件下培养。培养至细胞达到85％～90％时，用0.5％胰酶消化细胞，按每孔3×10₅个细胞均匀加入6孔板中培养。将6孔板中培养24h的心肌细胞更换新培养液，然后每孔做不同的药物处理：鹿茸草提取物低、中、高剂量组分别加入25.0μg/mL、100.0μg/mL和400.0μg/mL实施例1制备的鹿茸草提取物，正常组和模型组均加入等体积的PBS溶液，12h后在鹿茸草提取物低、中、高剂量组和模型组中加入200μL 200μmol/L的过氧化氢，24h后取其上清液按照丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所)说明书对大鼠心肌细胞中的MDA含量进行检测，统计结果见图3。

大鼠心肌细胞(H₉C₂C₂-D，购于中国科学院细胞库)在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃和5％CO₂条件下培养。培养至细胞达到85％～90％时，用0.5％胰酶消化细胞，按每孔3×10₅个细胞均匀加入6孔板中培养。将6孔板中培养24h的心肌细胞更换新培养液，然后每孔做不同的药物处理：鹿茸草提取物低、中、高剂量组分别加入25.0μg/mL、100.0μg/mL和400.0μg/mL实施例1制备的鹿茸草提取物，正常组和模型组均加入等体积的PBS溶液，12h后在鹿茸草提取物低、中、高剂量组和模型组中加入200μL 200μmol/L的过氧化氢，24小时后取其上清液，按照乳酸脱氢酶(LDH)测试盒(南京建成生物工程研究所生产)说明书对LDH含量进行检测，统计结果见图4。

由图3和图4结果可见，与模型组相比，鹿茸草提取物低、中、高剂量组MDA含量和LDH含量均有所降低，并且随着给药剂量的增加，MDA含量和LDH含量降低越多，均呈剂量依赖性。按上述方法测定实施例2制备的鹿茸草提取物对H₂O₂致大鼠心肌细胞中LDH和MDA含量的影响，结果显示实施例2制备的鹿茸草提取物也以剂量依赖的降低鼠心肌细胞中LDH和MDA含量。

实施例7、鹿茸草提取物对冠脉结扎所致大鼠急性心肌缺血损伤的保护作用

取SD大鼠，随机分为3组，假手术组、模型组和鹿茸草提取物(90mg/kg)组，每组8只。鹿茸草提取物组灌胃给予实施例1制备的鹿茸草提取物，假手术组、模型组灌胃给予等量的蒸馏水，每天一次，连续7天。末次给药45min左右，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，仰卧位固定，测量手术前心电图，经胸骨做横切口剪开皮肤，分离肌肉，从肋间取出心脏，结扎冠状动脉左前降支，挤出胸腔内空气，迅速缝合闭胸。术后24h，戊巴比妥钠麻醉大鼠，取血，取心脏，测定心肌梗死面积，结果见表2。

表2鹿茸草提取物对冠脉结扎大鼠心肌梗死面积的影响(

n＝8)

组别	剂量(mg/kg)	梗死面积(％)
			假手术组	-	1.51±2.05***
模型组	-	37.84+4.83
			鹿茸草提取物	90	24.10+5.12**

注：**P＜0.01，***P＜0.001与模型组比

由表2结果可见灌胃给药90mg/kg实施例1制备的鹿茸草提取物可以明显降低冠脉结扎所致大鼠心肌梗死面积。按上述方法测定实施例2制备的鹿茸草提取物对冠脉结扎所致大鼠心肌梗死面积的影响，结果显示实施例2制备的鹿茸草提取物也可明显降低冠脉结扎所致大鼠心肌梗死面积。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的应用及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.鹿茸草提取物在制备预防和治疗心肌缺氧缺血疾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述心肌缺氧缺血疾病为冠心病或心绞痛。

3.鹿茸草提取物在制备氧自由基清除剂中的应用。

4.鹿茸草提取物在制备H₂O₂致心肌细胞氧化损伤抑制剂中的应用。

5.根据权利要求1～4任意一项所述应用，其特征在于，所述鹿茸草提取物的制备方法为：取鹿茸草药材，粉碎成粗粉，用水、含1-4碳的低级醇、丙酮或它们的混合物提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液，浓缩，加水至相当于0.1-1.5克生药材/毫升，离心，收集澄清液，上预处理好的大孔吸附树脂柱，依次用水、10-15％乙醇、30-80％乙醇洗脱，收集30-80％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，然后经常规硅胶、反相硅胶柱层析，即得。

6.一种预防或治疗心肌缺氧缺血疾病的药物制剂，其特征在于，由有效量的鹿茸草提取物和药学上可接受的辅料组成。

7.根据权利要求5所述药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为口服液、胶囊剂、涂剂、巴布剂、喷雾剂、注射剂、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂或滴丸剂。

8.根据权利要求6或7所述药物制剂，其特征在于，所述鹿茸草提取物的制备方法为：取鹿茸草药材，粉碎成粗粉，用水、含1-4碳的低级醇、丙酮或它们的混合物提取2-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液，浓缩，加水至相当于0.1-1.5克生药材/毫升，离心，收集澄清液，上预处理好的大孔吸附树脂柱，依次用水、10-15％乙醇、30-80％乙醇洗脱，收集30-80％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，然后经常规硅胶、反相硅胶柱层析，即得。

Images