KR20140031835A - 식물 세포 배양으로부터 프로시아니딘의 생산 및 추출 - Google Patents

Abstract

단당류의 존재 하에서 생장하는 코코아 세포 배양으로부터 코코아 저중합체 프로시아니딘(cocoa oligomeric procyanidins) 제조 방법은 하기와 같이 프로시아니딘의 생산을 증가시킬 수 있다: 제 1 유속(a first rate)에서 코코아 저중합체 프로시아니의 생산하기 위해 충분한 세포의 배양; 및 제 1 유속보다 높은 제 2 유속(a second rate)에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하는 세포를 유도하기 위해 충분한 단당류를 세포에 도입. 본 방법은 세포로부터 코코아 저중합체 프로시아니딘을 추출하는 것을 추가적으로 포함할 수 있고, 단당류를 도입한 후 1 내지 21 일 사이에 추출이 이루어질 수 있다. 선택적으로, 단당류는 배지 부피의 약 0.5 % 내지 20 %의 양이 도입될 수 있다. 단당류는 포도당(glucose), 설탕(sucroses), 과당(fructoses), 또는 이와 같은 것들이 될 수 있다. 단당류는 지수 생장 상태(exponential growth state)의 마지막 단계 동안 또는 후에 도입될 수 있다.

Description

식물 세포 배양으로부터 프로시아니딘의 생산 및 추출{Production and Extraction of procyanidins from plant cells cultures}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2010년 10월 4일에 출원된 미국 가출원 제 61/389,629에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 축합된다.

폴리페놀(Polyphenols)은 식물, 과일 및 야채에 광범위하게 분포되어 있고, 인간 및 동물의 건강에 있어서 항산화제, 항돌연변이성 및 암 예방 활성을 포함하는 그들의 생리학적 기능 때문에 지속적인 관심을 받고있다(Salvia et al., J. Agric. Food Chem. 39: 1549-1552, 1991; Bomser et al., Cancer Lett., 135: 151-157, 1999; Zhao et al., Carcinogenesis, 20: 1737-1745, 1999). 역학적 연구는 폴리페놀 중에서, 플라보노이드(flavonoids)가 심장 질환의 위험을 줄일 수 있음을 제시하였다(Hertog et al., Lancet: 342: 1007-1011, 1993). 게다가, 식이(dietary) 플라반-3-올(flavan-3-ols) 및/또는 프로안소시아니딘(proanthocyanidins)은 실험 동물에서 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis) 및 관상동맥 심장 질환(coronary heart disease)을 감소시키는 것을 나타냈다(Tijburg et al., Atherosclorosis, 135: 37-47, 1997; Yamakoshi et al., Atherosclerosis, 142: 139-149, 1999). 이러한 효과의 원인이 되는 기작 중의 하나는 그들의 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein , LDL)의 산화 저해와 관련된다(Steinberg, Circulation, 85: 2337-2344, 1992).

카카오 식물(Theobroma cacao L., Sterculiaceae)의 종자는 폴리페놀이 풍부한 것이 알려져 있다(Porter et al., Phytochemistry, 30: 1657-1663, 1991). 코코아 및 초콜렛 생산품의 주요 성분인, 카카오 콩을 발효하고, 볶아서 제조되는 카카오 술(liquor)의 몇 가지 항산화제 성분은 플라반-3-올 및 프로시아니딘 저중합체(oligomers)로 특징된다(Sanbongi et al., J. Agric. Food Chem., 46: 454-457, 1998; Adamson et al., J. Agric. Food Chem., 47: 4184-4188, 1999).

테오브로마(Theobroma)의 다른 종 및 헤라니아(Herrania)와 같은 다른 속은 카카오 프로시아니딘의 원천(source)으로 알려져 있다. 20 개의 테오브로마의 다른 종이 기재되어 있지만 보통 12 개만이 인정되었다. 이것 중에, 9 개는 아마조니아(Amazonia)가 원산지이므로, 유전학적 분포의 중심은 지역의 서부에 나타난다(Giacometti, 1994, In “Neglected Crops: 1492 from a different perspective (J.E. Hernando Bermejo and J. Leon, Eds.)( Plant Production and Protection Series No. 26, FAO, Rome, Italy, p205-209).

테오브로마 속은 전형적으로 신열대구(neotropical)이고, 위도 18 °N 및 15 °S 사이의 서반구(Western Hemisphere)의 열대 우림에 분포되어있다. 대부분 종이 있는 지역은 코스타리카(Costa Rica) 및 북동부 콜롬비아(northeastern Colombia) 사이이다. 5 개 부문(section) 및 20 개의 종이 인정되었다. 테오브로마 그랜디플로럼(Theobroma grandiflorum)은 11 개의 종으로 구성된 글로소페탈럼(Glossopetalum) 부문에 속하고; 테오브로마 카카오(Theobroma cacao) 는 테오브로마 부문에 속하는 유일한 종이다.

테오브로마의 4개 종은 식용 과육의 생산자로서 기재되었다: 테오브로마 그랜디플로럼, 테오브로마 카누마넌스(Theobroma canumanense) Pires & Froes, 테오브로마 서빈카넘(Theobroma subincanum) Martius, (브라질의 Cupui 및 콜롬비아의 Cacau de monte) 및 테오브로마 트리컬러(Theobroma tricolor) Humb. & Bonpl., 은 서부 아마조니아부터 남부 멕시코(Mexico)까지 분포된 작은 나무이다. 초콜릿은 이러한 종의 종자들로 만들어진다(Giacometti, 1994, In “Neglected Crops: 1492 from a different perspective (J.E. Hernando Bermejo and J. Leon, Eds.) Plant Production and Protection Series No. 26, FAO, Rome, Italy, p205-209). 테오브로마 및 헤라니아의 몇몇 종의 콩은 유사한 프로시아니딘을 생산하며, 이러한 화합물은 콩으로부터 추출될 수 있는 것으로 보인다(Romanczyk et al., WO 97/36497).

코코아 콩 안의 폴리페놀은 자엽의 색소 세포 안에 저장되어 있다. 이러한 색소 세포 안의 안소시아닌(anthocyanins)의 양에 따라, 또한 폴리페놀-저장 세포(polyphenol-storage cells)로 불리며, 그들은 짙은 자주색이다. 폴리페놀의 세 그룹은 이러한 세포로 구별될 수 있다: 카테킨(catechins) 또는 플라반-3-올(flavan-3-ols)(~37 %), 안소시아닌(anthocyanins)(~4 %) 및 프로안소시아니딘(proanthocyanidins)(~58%). 주요 카테킨은 전체 폴리페놀량의 35 %로 구성된 (-)-에피카테킨(epicatechin)이다. 프로시아니딘(보통 프로안소시아니딘(proanthocyanidins)이라 언급됨)은 농축된 주요 연장 아단위(sub-unit)로서 에피카테킨(epicatechin)과 함께 응축한 이량체(dimmers), 삼량체(trimers) 또는 저중합체(oligomers)에 4→8 또는 4→6 결합하는 주로 플라반-3,4-디올(flacan-3,4-diols)이다(Romanczyk et al., WO 97/36497).

신선한 코코아 콩의 건조된 탈지 덩어리에서 수용성 폴리페놀의 전체 양은 15 내지 20 %이고(공기에 건조된 코코아 콩안의 동일한~6 %, 54 % 지방 및 6 % 수분을 포함하는), 및 발효된 콩 ~5 %이다. 따라서, 폴리페놀의 재료로서 코코아 콩을 이용하는 것의 주요 단점 중의 하나는 대부분 폴리페놀이 콩의 과정 동안 소실된다는 것이다. 굽거나 지방을 없애는 다른 단계 역시 소실을 유도한다. 따라서 코코아 가루는 신선한 콩 안의 전체 폴리페놀의 10 % 미만을 가지고 있다. 코코아 콩을 사용하는 것에서 또 다른 문제점은 테오브로마 카카오(Theobroma cacao)의 제한된 생장 범위이다. 이것은 따뜻하고, 습기가 있는 적도의 위도 약 20 °남쪽 및 북쪽지역에서만 생장한다. 저장 및 그들이 가공될 수 있고 폴리페놀이 추출될 수 있는 지역으로 운송 중에 콩의 폴리페놀량을 저장하는 것이 어렵다.

식물 세포 배양은 이러한 문제점을 극복할 수 있는 매력적인 대안이다. 식물 세포 배양은 최근에 플라보노이드(flavonoids)의 분리에 사용되었다. 프로시아니딘의 경우, 몇몇의 그룹이 배양으로부터 특정 성분들을 분리할 수 있었다. 예를 들면, 4→8 연결된 (-)-에피카테킨-, (+)-카테킨 및 갈산(gallic acid)은 로자(Rosa) 배양으로부터 분리되었다(Muhitch & Fletcher, Plant Physiol., 75:592?595, 1984). 현탁 배양(Suspension cultures) 및 크리토메리아 자포니카(Cryptomeria japonica)의 캘러스(calluses)는 프로시아니딘의 건조 중량의 26 % 만큼 생산하는 것이 알려졌고(Teramoto & Ishikura, Bot. Mag. Tokyo 98: 171-179, 1985; Ishikura & Teramoto, Agric. Biol. Chem. 47: 421-423, 1983), 슈도스가 멘시에시(Pseudotsuga mensiesii)의 현탁 배양은 프로시아니딘의 건조 중량의 40 % 만큼 생산하였다(Stafford & Cheng, Phytochemistry 19: 131-135, 1980). 또한, 연구들은 비티스 비니페라(Vitis vinifera)의 세포 현탁 배양의 프로시아니딘 생산을 보여준다(Decendit & Merillon, Plant Cell Rep. 15: 762-765, 1996; Waffo-Teguo et al., Phytochem. 42:1591-1593, 1996).

테오브로마 카카오의 조직 배양 연구는 식물의 영양계번식(clonal propagation)의 목적을 위해 몇몇의 실험실에서 개발되었던 체세포배형성(somatic embryogenesis)에 초점이 맞춰져 있었다. 테오브로마 카카오 체세포배형성의 첫번째 보고는 1977년 미성숙한 접합자배(zygotic embryo) 조직 외식(explant)을 이용한 방법을 기재한 Esan에 의한 것이다(Proc. 5th Int. Cacao Res. Conf. 1975. Ibadan: Cacao Res. Inst. Nigeria, 1977: 116-125, 1977). 유사한 방법은 후에 다른 이들에 의해 보고되었다(Pence et al., J. Am. Soc. Hort. Sci. 104: 145-148, 1979; Villalobos & Aguilar, Abstr. VII Int. Congr. Plant Tissue and Cell Cult., Amsterdam, Int. Assoc. for Plant Tissue Culture, pp 140, 1990). 그 후의 연구는 잎(Litz, In Dimick, P.S., Ed., Cacao biotechnology symposium. The Pennsylvania State University Press, University Park, PA, pp 111-120, 1986), 주심(nucellus) (Chatelet et al., C.R. Acad. Sci., Paris 315: 55-62, 1992; Figueira & Janick, Acta Hort. 336: 231-238, 1993; Sondhal et al., Acta Hort. 336: 245-248, 1993), 및 꽃잎(petals) 및 헛수술(staminodes) (Lopez-Baez et al., C.R. Acad. Sci., Paris 316: 579-584, 1993; Alemanno et al., Plant Cell Tiss. Organ Cult. 46: 187-194, 1996; Alemanno & Michaux-Ferriere, In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 33: 163-172, 1997)을 포함하는 꽃 외식(floral explants)을 포함하는 체조직(somatic tissues) 유래 조직 배양 방법의 개발에 초점이 맞춰졌다. 이러한 초기의 방법은, 성공적이긴 하지만, 모든 유전자형에 적용할 수 없었고, 재생된 식물의 빈도는 낮았다. 광범위한 유전자형을 번식시킬 수 있는 더 효과적인 방법이 또한 개발되었다(Li et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 34: 293-299, 1998; Maximova et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 38: 252-259, 2002). 하지만, 모든 기재된 방법은, 부정배(somatic embryos)를 생산하는 조직 배양 방법을 사용할 때, 현탁 세포를 증가시키는 방법은 나타내지 않았다.

테오브로마 카카오의 세포 배양을 개발하는 출판된 연구의 제한된 양이 있다. 이 연구의 대부분은 1970 년대 및 1980년대에 있었다(Hall & Collin, Annals of Bot. 39: 555, 1975; Jalal & Collin, Phytochem. 16: 1377-1380, 1977; Jalal & Collin, New Phytol. 83: 343-349, 1979; Tsai et al., J. Food Sci. 47: 768-773, 1982; Wen et al., J. Am. Oil Chemist’s Soc. 16: 1720-1724, 1984). 이러한 것 중 근소한 것이 테오브로마 카카오의 세포 배양에서 플라보노이드를 연구하였다. 예를 들면, Jalal 및 Collin (1979)은 캘러스의 플라보노이드 조성 및 세포 배양이 유사하였고, 원래 온전한 자엽의 것과 조금 다른 것을 보고하였다. 조직 배양 둘 다 (-)-에피카테킨, 루코시아니딘(leucocyanidins), 카페익(caffeic) 및 쿠마르산(coumaric acids)을 함유하였다. 메틸환(metylated)된 퓨린(purines), 테오브로민(theobromine) 및 카페인(caffeine)은 조직 배양에서 탐지되지 않았다. 하지만, Gurney et al . (J. Expt. Bot . 43: 769-775, 1992)은 테오브로마 카카오의 캘러스 및 현탁 배양이 그것의 체내에서 발견된 약 10% 농도로 카페인, 테오브로민 및 테오필린(theophylline)을 생산하는 것을 보고하였다.

최근에 가장 큰 생효율성(bioefficacy)을 갖는 것을 보이는 저중합체 프로시아니딘의 형성을 보고한 기존의 연구가 없었다. Jalal 및 Collin (New Phytol. 83: 343-349, 1979)은 테오브로마 카카오의 세포 배양에서 루코시아니딘(leucocyanidins)의 검출을 보고하였다. 하지만, 화합물을 검출하는 방법에 기반하여 루코시아니딘의 천연 또는 크기를 특정화하는 것은 불가능하다. 추가적으로, 조직 배양 방법은 테오브로마 또는 헤라니아(Herrania)의 다른 종에 대해 기재되지 않았다.

식물 세포 배양은 이러한 문제를 해결하는 매력적인 대안이다. 따라서, 폴리페놀을, 구체적으로는 프로시아니딘을 얻기 위한 추출 방법뿐만 아니라 식물 세포 배양 방법을 향상시키는 이점을 가진다.

도 1은 빠르게 생장하는 세포주의 사진을 포함한다.
도 2A - 2E는 테오브로마 카카오 세포에서 탄수화물 소비 및 프로시아니딘 생산성 및 수율을 보이는 일련의 그래프를 포함한다. 도 2A 및 도 2B는 비-꽃(non-floral) 및 꽃(floral) 조직 유래 현탁 배양(suspension culture)의 프로시아니딘 생산성(도 2B) 및 생산 수율(도 2A)를 보인다. 도 2C는 프로시아니딘 생산성이 향상되는 효과를 가지는 세포의 선택을 보인다. 도 2D는 프로시아니딘 생산 수율이 향상되는 효과를 가지는 세포의 선택을 보인다. 도 2E는 배지 XXVI에서 테오브로마 카카오 세포 배양의 탄수화물 분석을 보인다(표 1).
도 3은 다양한 접종 밀도(inoculum densities)의 배양에서 생물량(biomass)의 전형적인 시간 추이(time course)를 보이는 그래프를 포함한다.
도 4는 식물 생장 관련 조직 유래 세포의 세포 선택 과정에 따른 프로시아니딘 생산의 향상 정도를 보이는 그래프를 포함한다.
도 5A는 포도당(glucose)와의 배양에 대한 상승된 프로시아니딘 생산을 보이는 그래프를 포함한다.
도 5B는 다양한 농도의 포도당에 대한 상승된 프로시아니딘 생산을 보이는 그래프를 포함한다.
도 6은 추가적인 포도당의 첨가로 인한 MX1440-3496 세포주에서 프로시아니딘 생산이 향상된 두 첨가 사건(elicitation events)를 보이는 그래프를 포함한다.
도 7A는 호르몬의 제거 후 2 주간 배양액 1 리터당 프로시아니딘 생산의 상승을 보이는 그래프를 포함한다.
도 7B는 2가지 처리의 첨가물 효과를 보이는 그래프를 포함한다: 1 주간 호르몬의 제거 및 그 후 10주간 6 % 포도당을 세포에 첨가하는 2차 처리이며, 첨가는 배지에서 호르몬의 제거 이후 7 일에 한다.
도 8A-8C는 프로시아니딘 측정을 위한 부탄올-염산 가수분해 분석을 함께 보여준다. 프로시아니딘의 산 가수분해는 2 개의 단량체 형태인, (-)-에피카테킨((-)-Epicatechin) 및 분홍색의 시아니딘으로 그들의 분해를 유도한다. 각 시료에서 분홍색의 강도는 다른 세포주에서 얻은 프로시아니딘의 존재양을 보여준다(도 8A). 방법은 샘플의 신속한 스크리닝을 위해 96-웰 플레이트 형식으로 최적화하였다(도 8B) 시아니딘 흡수는 520 nm에서 측정하였고, 에피카테킨 흡수는 280 nm에서 측정하였다(도 8C); 정량은 시아니딘 흡광도 값으로 계산되었다.
도 9A - 9F는 테오브로마 카카오 세포 배양에서의 프로시아니딘 및 알칼로이드(alkaloids)의 일련의 크로마토그래피를 포함한다. 도 9A-9C는 다양한 표준 기준 물질(authentic standard compounds)의 HPLC LC-MS 분석을 보인다. 도 9D-9F는 다른 카페인 또는 테오브로민(theobromine)을 포함하지 않는 에피카테킨 및 카테킨의 신호를 보이는 테오브로마 카카오 현탁 세포의 HPLC LC-MS 분석을 보인다.
도 10A-10B는 현탁 세포 추출물의 일련의 HPLC 크로마토그램을 보이는 그래프를 포함한다: 형광 디텍터(fluorescence detector) 방식(도 10A); 또는 280 nm의 PDA 디텍터(PDA detector) 방식(도 10B). 표식 1 내지 12는 프로시아니딘의 중합화 정도를 나타낸다, 각각: 1, 단량체(monomers); 2, 이량체(dimers); 3, 삼량체(trimers); 4, 사량체(tetramers); 5, 오량체(pentamers); 6, 육량체(hexamers); 7, 칠량체(heptamers); 8, 팔량체(octamers); 9, 구량체(nonamers); 10, 십량체(decamers); 11, 십일량체(undecamers); 12, 십이량체(dodecamers).
도 11은 코코아 콩 추출물에 대조적으로 현탁 세포 추출물에서의 대사산물 추적량을 보여주는, 혼탁 세포 추출물 및 비발효(unfermentated) 코코아 콩 추출물의 테오브로민 및 카페인의 농도를 포함하는 크로마토그램을 포함한다.
도 12A는 다양한 수용성 용매에서 전체 프로시아니딘 수율의 비교를 보이는 그래프를 포함한다(일중, n=3).
도 12B는 추출 과정에서 저중합체 프로시아니딘(단량체 내지 십량체)의 전체 추출 속도의 비교를 보이는 그래프를 포함한다(n=2).
도 12C는 60 % 에탄올 및 70 % 아세톤 사이에서 추출한 프로시아니딘의 프로필(profiles)의 비교를 보이는 그래프를 포함한다.
도 13은 다양한 접종 밀도의 배양에서 생물량 밀도의 전형적인 시간 추이를 보이는 그래프를 포함한다.
도 14A-14B는 실온에서 23 시간 동안 산(acidic) 및 비-산(non-acidic) 추출 용매에서 이량체 프로시아니딘의 안정성 비교를 보이는 그래프를 포함한다.

요약

본 발명은 분리된 코코아 세포주, 상기 분리된 세포주로부터 얻은 추출물, 및 액체 배지에서 생장하는데 적합한 코코아 세포주를 발전시키는 방법을 밝힌 것에 관한 것이다. 또한 세포 배양액에서 프로시아니딘(procyanidins)을 높은 수준으로 생산하는 세포주 선별 방법 및 상기 세포 배양액으로부터 식품 성분( food ingredient), 식품 첨가제(food additives), 치료용 조성물, 또는 화장료 조성물을 생산하기 위한 프로시아니딘 추출 방법에 관련한 것이다. 추가적으로, 상기 분리된 세포주는 높은 농도의 프로시아니딘을 생산하는 것으로 선택되며 또한, 대체로 카페인(caffeine) 및 테오브로민(theobromine)을 함유하지 않는 것으로 선택될 수 있다. 일반적으로 코코아 제조물(preparation)에 매우 풍부한 카페인 및 테오브로민은 코코아의 쓴맛의 주된 원인인 코코아 내의 화합물이다. 이러한 화합물은 또한 개 및 다른 동물에게 있어서 코코아 생산품의 유독성의 주된 원인이기도 하다. 코코아 세포의 생장하는 세포 현탁배양을 위한 새로운 생장 조건 및/또는 배지(예를 들어, 액체 배지) 및 상기의 현탁세포에 의한 향상된 프로시아니딘 생산을 위한 액체 배지 조성을 추가적으로 밝히는 것에 관련된다.

하나의 실시예에서(In one embodiment), 본 발명은 구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없는 것으로 선택된 분리된 코코아 세포주를 포함한다. 즉, 분리화된 코코아 세포주에 의해 생산된 생산품은 구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없다. 결과적으로, 분리된 코코아 세포주로부터 유래한 제조물은 자연스럽게 구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없다. 하나의 실시예에서, 분리된 세포주는 현탁 세포 배양액에서 생장하기에 적합할 수 있다.

분리된 코코아 세포주는 근본적으로 코코아 식물의 어떤 한 부분에서 유래 될 수 있다. 예를 들어, 분리된 코코아 세포주는 적어도 하나의 꽃 조직(floral tissue) 또는 비-꽃의(non-floral) 식물 생장 관련 조직(vegetative tissue)으로부터 유래 될 수 있다. 꽃 조직의 예는, 꽃잎(petals), 꽃받침(sepals), 헛수술(staminodes), 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비-꽃 식물 생장 관련 조직은 마디(nodes), 절간(internodes), 어린 잎(young leaves), 성장한 잎(mature leaves), 줄기(stems), 뿌리(roots), 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

하나의 실시예에서, 상기 분리된 코코아 세포주는 200 mg/L 세포 충진 부피(packed cell volume)("PCV")보다 크거나, 프로시아니딘의 PCV가 200 mg/L 보다 크거나, 프로시아니딘의 PCV가 200 mg/L 보다 크거나, 300 mg/L PCV보다 크거나, 400 mg/L PCV보다 크거나, 또는 500 mg/L PCV보다 큰 수율을 나타낸다. 하나의 실시예에서, 상기 분리된 코코아 세포주는 세포 배양액 1 리터 당 프로시아니딘이 100 mg 보다 크거나, 200 mg 보다 크거나, 또는 적어도 250 mg보다 큰 수율을 가진다.

하나의 실시예에서, 코코아 세포 배양으로부터 코코아 저중합체 프로시아니딘의 제조 방법이 기재되어 있다.

하나의 실시예에서, 코코아 저중합체 프로시아니딘의 제조 방법은: (1) 제 1 유속(a first rate)에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하기 위해 충분한 시간 및 충분한 조건 하에서 세포의 배양하고, 및 (2) 제 1 유속보다 높은 제 2 유속(a second rate)에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하는 세포를 유도하기에 충분한 양의 단당류(monosaccharide)를 세포 내에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 단당류는 포도당(glucose), 설탕(sucroses), 과당(fructoses), 또는 이와 같은 것들이 될 수 있다. 단당류는 지수 생장 상태(exponential growth state)의 마지막 단계 동안 또는 후에 도입될 수 있다. 선택적으로, 단당류는 배지(culture medium) 부피의 약 0.5% 내지 20%의 양이 도입될 수 있다. 단당류는 세포주의 안정적인 유지, 과잉생산(overproduction)의 유도 및 세포 응집(aggregation)의 방지를 위해 첨가될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 코코아 저중합체 프로시아니딘의 제조 방법은: (1) 제 1 유속에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하기 위해 충분한 시간 및 충분한 조건 하에서 세포의 배양; 및 (2) 제 1 유속보다 높은 제 2 유속에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하는 세포를 유도하기 위해 무호르몬 배지 및 적절한 조건 하에서 세포를 배양을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 상기 방법은 제 2 유속보다 높은 제 3 유속(a third rate)에서 무호르몬 배지의 세포에 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하는 세포의 유도를 위해 적절한 양의 단당류를 도입하는 것을 포함할 수 있다.

상기 기재한 방법의 하나의 실시예에 따라, 세포로부터 추가적으로 코코아 저중합체 프로시아니딘을 추출하는 것을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 세포의 추출은, 구체적으로 잔틴 알칼로이드(xanthine alkaloids)를 함유하지 않는다. 잔틴 알칼로이드의 예는 카페인, 테오브로민, 및 테오필린(theophylline)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

따라서, 또한 다른 실시예에서, 코코아 저중합체 프로시아니딘의 제조 방법은: (1) 충분한 시간 동안 코코아 저중합체 프로시아니딘의 생산을 유도하는 충분한 조건 하에서 세포의 배양; 및 에탄올 추출 용액을 사용하여 세포에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 추출을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 추출 용액은 에탄올-기반(ethanol-based)이 될 수 있다. 하나의 실시예에서, 에탄올-기반의 추출 용액은 수용액일 수 있다. 또 다른 측면에서, 에탄올-기반의 추출 용액은 에탄올 외의 어떠한 유기용매도 함유하지 않는 것일 수 있다. 하나의 실시예에서, 추출 용매는 산성 추출 용액이 될 수 있다. 산성 추출 용액의 pH는 약 3 내지 약 6이다. 산성 추출 용액은 아세트산(acetic acid), 구연산(citric acid), 또는 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 상기 방법은 산화방지제(antioxidant)를 포함하는 산성 추출 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 몇 가지 사례에서, 산성 추출 용액의 산은 또한 산화방지제이다. 몇 가지 사례에서, 산 및 산화방지제의 분리는 추출 용액에서 사용된다.

상기 기재된 방법은 추가적으로 단당류의 도입 이후 1 일 내지 21 일 사이(예를 들어, 약 1 일 내지 약 10 일)에 세포로부터 코코아 저중합체 프로시아니딘을 추출하는 것을 포함할 수 있다. 선택적으로, 단당류는 배지 부피의 약 0.5 % 내지 20 %의 양이 도입될 수 있다. 하나의 측면에서, 배양은 무호르몬배지에서 배양될 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 방법은 탈지(defatting) 단계를 포함하지 않는다. 즉, 추출물(프로시아니딘, 폴리페놀(polyphenol), 등)은 탈지 단계를 거치지 않은 채 배양된 세포로부터 만들어질 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 방법은 하나 또는 이상의 하기 내용을 포함한다: 세포를 회수; 폴리페놀(polyphenol) 다량 함유 분획물(rich fraction)의 추출을 위해 세포 생물량(cell biomass)를 적절한 용매에 균질화(homogenizing); 용매-용매 추출 및/또는 크로마토그래피를 이용한 프로시아니딘 다량 함유 분획물의 분리; 또는 프로시아니딘 분획물의 건조 또는 농축.

하나의 실시예에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 하기 내용을 포함한다: 고체 생장 배지 위에서 캘러스(callus) 테오브로마 속(Theobroma sp .) 세포의 생장; 테오브로마 카카오(Theobroma cacao) 캘러스 배양물로부터 빠르게 생장하는 세포주의 선택; 또는 빠르게 생장한 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 테오브로마 속 세포의 현탁 배양(suspension culture) 개시.

하나의 실시예에서, 본 발명은 산소를 포함한, 용존 기체가 존재하는 발효조(fermenter) 또는 생물반응기(bioreactor vessel)에서 발효조 또는 생물반응기에서 액체 배양 배지에서 높은 농도의 용존 산소의 영향을 받는 코코아 세포 배양의 배양을 포함한다. 단독 또는 공기의 혼합 또는 정제된 기체의 산소로서의 산소는 발효조 또는 생물반응기에 분사교란기(sparger)를 통해 생장 단계(growth phase) 및 유도기(elicitation stage)(예를 들어, 단당류의 도입 이후 또는 무호르몬 배지에 세포의 도입 이후) 동안에 상승된 생장 및 생산을 위해 공급될 수 있다. 용존 산소의 농도는 세포의 일차 또는 이차적인 대사적 요구에 의존하여 세포에 전달된다. 하나의 실시예에서, 코코아 세포를 배양하는 단계는 생장기 동안 포화 공기 1 % 내지 400 %(예를 들어, 1 % 내지 200 %)의 용존 산소 농도에서 수행된다. 또 다른 실시예에서, 코코아 세포를 배양하는 단계는 유도기 동안 포화 공기 1 % 내지 400 %(예를 들어, 1 % 내지 200 %)의 용존 산소 농도에서 수행된다.

상기 및 다른 목표, 특징 및 이점은 하기의 서술로부터 좀더 분명해질 것이며, 수반하는 도표에 관련하여 진행된다.

상세한 설명

본 발명은 분리된 코코아 세포주, 상기 분리된 세포주로부터 얻은 추출물, 및 액체 배지에서 생장하는데 적합한 코코아 세포주를 발전시키는 방법을 밝힌 것에 관한 것이다. 또한 세포 배양액에서 프로시아니딘(procyanidins)을 높은 수준으로 생산하는 세포주 선별 방법 및 상기 세포 배양액으로부터 식품 성분( food ingredient), 식품 첨가제(food additives), 치료용 조성물, 또는 화장료 조성물을 생산하기 위한 프로시아니딘 추출 방법에 관련한 것이다. 추가적으로, 상기 분리된 세포주는 높은 농도의 프로시아니딘을 생산하는 것으로 선택되며 또한, 대체로 카페인(caffeine) 및 테오브로민(theobromine)을 함유하지 않는 것으로 선택될 수 있다. 일반적으로 코코아 제조물(preparation)에 매우 풍부한 카페인 및 테오브로민은 코코아의 쓴맛의 주된 원인인 코코아 내의 화합물이다. 이러한 화합물은 또한 개 및 다른 동물에게 있어서 코코아 생산품의 유독성의 주된 원인이기도 하다. 코코아 세포의 생장하는 세포 현탁배양을 위한 새로운 생장 조건 및/또는 배지(예를 들어, 액체 배지) 및 상기의 현탁세포에 의한 향상된 프로시아니딘 생산을 위한 액체 배지 조성을 추가적으로 밝히는 것에 관련된다.

Ⅰ. 약어

2,4-D : 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)

2iP : 6-(γ,γ-디메틸라릴아민)퓨린 (6-(γ,γ-dimethylallylamine) purine)

B5 : 갬보그 B5(Gamborg’s B5)

BA : 벤질아데닌 (Benzyl adenine)

CP : Chee 및 Poole

DKW : Driver 및 Kuniyuki Walnut

FAB/MS : 팹-질량분석 (Fast atom bombardment/mass spectrometry)

HCl : 염산(hydrochloric acid)

HPLC : 고속액체 크로마토그래피 (High performance liquid chromatography)

H2SO4 : 황산 (Sulfuric acid)

IAA : 인돌아세트산 (Indole acetic acid)

IBA : 인돌뷰티르산 (Indole butyric acid)

LC : 액체크로마토그래피 (Liquid chromatography)

LSIMS : 액체 2차 이온화법 (Liquid secondary ion mass spectrometry)

MS : 질량분광학(Mass spectroscopy)

MS 배지 : 무라시게 및 스쿠그 배지 (Murashige and Skoog medium)

MS 비타민 : 무라시게 및 스쿠그 비타민(Murashige and Skoog vitamins)

MS 염 : 무라시게 및 스쿠그 염 (Murashige and Skoog Salts)

NAA : 1-나프탈렌 아세트산 (1-Naphthalene acetic acid)

NMR : 핵자기공명(Nuclear magnetic resonance)

NN : 니취 및 니취 (Nitsch and Nitsch)

PCV : 압축세포용적(Packed cell volume)

PDA : 광 다이오드 어레이 (Photodiode array)

QL : 퀴오린 및 레포이브레 (Quiorin and Lepoivre)

RI : 굴절률(Refractive index)

rpm : 분당 회전 수 (revolutions per minute)

SH : 솅크 및 힐데브란트 (Schenk and Hildebrandt)

TDZ : 티디아주론(thisdiazuron)

TLC : 박층크로마토그래피 (thin layer chromatography)

vvm : 분 당 배양 부피당 가스 부피(volume of gas per volume of culture per minute)

WPM : 맥카운’s 우디 식물 배지(McCown’s Woody Plant Medium)

Ⅱ. 용어

특별히 명시한 것이 없으면, 기술적인 용어는 기존의 사용에 따라 쓰인다. 본 발명의 다양한 실시태양의 검토를 가능하게 하기 위해, 하기의 특정 용어의 설명을 제공한다:

항산화제는 자유 라디칼(free radicals)로 인한 것과 같은 산화적인 손상(산소로 인한 손상)을 감소시키는 물질이다.

캘러스(callus)는 박막(thin-walled) 덩어리, 미분화된 식물 세포, 영양 배지에서 상처를 입히는 것(wounding) 또는 배양의 결과로서 발생된 것이다.

카테킨(Catechins)은 자연적으로 식물에서 발생하는 폴리페놀릭 화합물(polyphenolic compounds)이다. 또한, 그들은 플라반-3-올(flavan-3-ols)이라 불린다.

코코아는 테오브로마 카카오(Sterculiacae 목) 유래 종자이며, 주로 두 품종으로 구성된다: Criollo 및 Forestero는 몇몇의 아변종(subvarities)으로 분류된다. 트리니타리오(Trinitario)로 불리는 세번째 그룹은 Criollo 및 Forestero의 잡종(cross between)이다. 본 발명에서 포함하는 다른 종은, 예를 들면, 테오브로마 그랜디플로럼(Theobroma grandiflorum), 테오브로마 오보바텀(Theobroma obovatum), 테오브로마 스페시오섬(Theobroma speciosum), 테오브로마 서브인카넘(Theobroma subincanum), 및 테오브로마 실베스트리스(Theobroma sylvestris)이다.

플라보노이드(Flavonoids)는 특유의 삼량체 이종고리식의 핵을 포함하는 화합물 군 중 어떤 것이며, 보통 배당체의(glycosidic) 형태를 발생하며, 종종 색소로서 식물에 광범위하게 분포되어 있다.

폴리페놀(Polyphenols)은 그들의 화학적 구조에 따라 분류될 수 있는 4000개 이상의 화학적으로 독특한 플라보노이드를 포함하는 생체플라본류(bioflavonoids)로 알려져 있는 물에 용해되는 식물 색소이다. 폴리페놀 단량체는 카테킨(catechin), 에피테킨(epicatechin), 루코시아니딘(leucocyanidin)을 포함한다. 폴리페놀 저중합체는 프로시아니딘(procyanidins)을 포함한다.

프로시아니딘은 2개 및 15개 단위보다 큰 범위에 이르는 카테킨 단위가 이어져 구성된 중합 화합물이다. 또한, 프로시아니딘은 보통 프로안소시아니딘(proanthocyanidins) 또는 응축한 탄닌(tannins)으로 불린다.

현탁 배양(suspension culture)은 액체 영양 배지에서 조절된 조건하에 원핵세포 또는 진핵세포가 생장되는 과정이다.

조직 배양은 배양 배지에서 살아있는 조직을 유지하고 생장시키는 기술 또는 과정이다.

크산틴(Xanthines), 크산틴의 유도체(3,7-디하이드로-퓨린-2,6-디온(3,7-dihydro-purine-2,6-dione))는 보통 약한 흥분제 및 기관지 확장제로서의 효과가 이용되는 알칼로이드(alkaloids)군이다. 메틸화 크산틴 유도체는 카페인(caffeine), 파라잔틴(paraxanthine), 테오필린(theophylline) 및 테오브로민(theobromine)(주로 초콜릿 안에서 발견되는)을 포함한다. 이러한 화합물은 포스포디에스터라제(phosphodiesterase) 및 아데노신(adenosine)을 저해한다.

특별히 설명된 것이 없으면, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및 과학적인 용어는 보통 당업계의 당업자에 의해 이해되는 것으로서 같은 의미를 갖는다. 단수형 명사 “하나(a),” “하나(an),” 및 “상기(the)” 는 특별히 지시하지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다. 유사하게, 상기 단어 “또는”은 맥락에서 분명히 지시하지 않으면 “및”을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 이유로 “A 또는 B를 포함하는”은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명에서 기재된 것과 유사한 또는 동일한 방법 및 물질은 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 하기에 적합한 방법 및 물질이 기재되어있다. 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 다른 본 발명에서 언급된 참조문헌은 그들의 전체가 참조로서 포함된다. 분쟁의 경우, 상기 본 명세서는 용어의 설명을 포함하여 조절할 것이다. 게다가, 상기 물질, 방법 및 실시예는 오직 실례가 되며, 한정하려는 것이 아니다.

III . 본 발명의 실시예

분리된 코코아 세포주, 상기 분리된 세포주로부터 얻은 추출물, 및 액체 배지에서 생장하는데 적합한 코코아 세포주의 개발, 고수율의 프로시아니딘을 생산할 수 있는 세포 배양 방법의 방법 및 배지로부터 이 화합물들을 효과적으로 추출하는 방법은 이 가치있는 화합물의 생산을 유효하게 증가시킬 수 있다. 프로시아니딘을 생산하는 세포 배양의 사용은 프로시아니딘의 손실을 감소하기 위해 코코아 콩을 처리하기 위한 새로운 방법의 개발에 대한 힘든 작업을 필요로 하지 않는다. 또한, 세포 배양은 작물의 생산이 중단될 수 있는 환경적인 조건에 영향을 받지 않는다. 상기 세포 배양 및 방법은 하기에 기재되어 있다.

본 발명은 구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없는 것으로 선택된 분리한 코코아 세포주를 제공한다. 즉, 분리된 코코아 세포주에 의해 생산된 생산품은 구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없다. 결과적으로, 분리된 코코아 세포주로부터 유래한 제조물(예를 들어, 분해물(lysates), 추출물(extracts), 기타)은 자연스럽게 구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없다. 이것은 용액 추출의 사용으로 코코아 세포 제조물로부터 카페인 및 테오브로민이 반드시 제거되어야 하는 전형적인 코코아 세포 제조물이다. 상기 용매 추출은 비용이 많이 들며 시간 소비적이다. 추가적으로, 상기 용매 추출은 일반적으로 처리된 코코아 세포 추출물에 잔여 독성을 남길 가능성이 있는 강력한 용매(예를 들어, 헥산)을 사용한다. 하나의 실시예에서, 분리된 코코아 세포주는 현탁 세포 배지에서 생장하기에 적합할 수 있다.

분리된 코코아 세포주는 근본적으로 코코아 식물의 어떤 한 부분에서 유래 될 수 있다. 예를 들어, 분리된 코코아 세포주는 적어도 하나의 꽃 조직 또는 비-꽃의 식물 생장 관련 조직으로부터 유래 될 수 있다. 꽃 조직의 예는, 꽃잎, 꽃받침, 헛수술, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비-꽃 식물 생장 관련 조직은 마디, 절간, 어린 잎, 성장한 잎, 줄기, 뿌리, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

하나의 실시예에서, 상기 분리된 코코아 세포주는 200 mg/L 세포 충진 부피("PCV")보다 크거나, 프로시아니딘의 PCV가 200 mg/L 보다 크거나, 프로시아니딘의 PCV가 200 mg/L 보다 크거나, 300 mg/L PCV보다 크거나, 400 mg/L PCV보다 크거나, 또는 500 mg/L PCV보다 큰 수율을 나타낸다. 하나의 실시예에서, 상기 분리된 코코아 세포주는 세포 배양액 1 리터 당 프로시아니딘이 100 mg 보다 크거나, 200 mg 보다 크거나, 또는 적어도 250 mg보다 큰 수율을 가진다.

본 발명은 구체적으로 잔틴 알칼로이드가 없는 코코아 폴리페놀 제조물을 제조하는, 코코아 폴리페놀을 생산하기 위해 충분한 시간 및 충분한 조건 하에서 현탁 배양의 테오브로마 또는 헤라니마 세포의 생장 및 세포 현탁 배양으로부터 코코아 폴리페놀의 회수를 포함하는 방법을 제공한다. 구체적인 실시예에서, 테오브로마 또는 헤라이나 세포는 코코아 프로시아니딘을 생산하기 위해 충분한 시간 및 충분한 조건 하의 현탁 배양에서 자라며(예를 들어, 저중합체 프로시아니딘)(예를 들어, 1 내지 3 주), 세포 현탁 배양으로부터 코코아 프로시아니딘을 회수한다. 이러한 방법의 실시예에서, 결과된 코코아 폴리페놀(또는 프로시아니딘) 제조물은 구체적으로(또는 전적으로, 몇 가지 경우에서) 검출 가능한 카페인 및/또는 테오브로민이 없다.

또한, 본 발명은 카카오 세포의 세포 혼탁 배양의 생산 방법을 제공한다. 이러한 방법의 실시예는 고체 생장 배지 위의 성숙하지 않은 테오브로마 속 꽃 기관 또는 테오브로마 속 식물 물질 유래의 생장하는 캘러스와 관련된다; 테오브로마 속 캘러스 배양으로부터 빠르게 생장하는 세포주의 선택; 및 빠르게 생장한 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 세포의 현탁 배양 개시. 실시예로서, 성숙하지 않은 테오브로마 카카오 꽃 절편은 헛수술(staminodes), 꽃받침(sepals) 및 꽃잎(petals) 기반의 절편으로부터 선택된 몇 가지 경우이다. 다른 구체적인 예로서, 테오브로마 속 식물 물질은 어리거나 또는 성장한 잎, 줄기(stems), 분열 조직(meristem), 마디(nodes), 또는 절간(internodes)으로부터 선택되나, 이에 한정하지 않는다. 몇 가지 예시에서, 식물 세포 배양은 꽃 세포 배양보다 프로시아니딘을 더 생산할 수 있는 것으로서 선호될 수 있다. 카카오 세포의 상기 세포 현탁 배양은 구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없는 것으로부터 생산될 수 있는 세포 및 추출물과 같이 선택될 수 있다.

또한, 구체적으로 하기 기재한 방법 중 어떠한 하나를 사용하여 생산된 잔틴 알칼로이드(xanthine alkaloid)가 없는 코코아 폴리페놀(예를 들면, 프로시아니딘) 제조물을 제공한다. 구체적인 실시예에서, 코코아 폴리페놀(예를 들면, 프로시아니딘) 제조물은 검출이 가능한 농도의 잔틴 알칼로이드(제조물은 잔틴 알칼로이드가 없다)가 없다. 특히, 실시예에 한정하지 않고, 코코아 폴리페놀 제조물은 프로시아니딘을 함유하며(예를 들어, 저중합체 프로시아니딘) 구체적으로 카페인 및/또는 테오브로민이 없다. 구체적으로, 실시예에 한정하지 않으며, 상기 언급된 코코아 폴리페놀은 직접, 화장용, 치료용 또는 동물 치료용 조성물로 사용될 수 있다.

실시예를 통해, 코코아 폴리페놀 제조물은 추출물의 중량 또는 부피의2 % 미만의 테오브로민 및 0.5 % 미만의 카페인을 함유하는 경우, 구체적으로 잔틴 알칼로이드가 없는(구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없는) 것으로 여겨진다. 상세하게, 실시예에 한정되지 않고, 코코아 폴리페놀 제조물은 추출물의 중량 또는 부피의 1.5 % 미만, 1 % 미만, 0.5 % 미만, 또는 0 %의 테오브로민 및/또는 0.25 % 미만, 1 % 미만, 0.5 % 미만, 또는 0 %의 카페인을 함유한 경우, 구체적으로 잔틴 알칼로이드가 없는(구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없는) 것으로 여겨진다. 다른 실시예에서, 코코아 프로시아니딘 제조물은 구체적으로 2 % 미만의 테오브로민 및 0.5 % 미만의 카페인을 함유하는 경우, 구체적으로 잔틴 알칼로이드가 없는 것으로 여겨진다. 상세하게, 실시예에 한정되지 않고, 코코아 폴리페놀 제조물은 추출물의 중량 또는 부피의 1.5 % 미만, 1 % 미만, 0.5 % 미만, 또는 0 %의 테오브로민 및/또는 0.25 % 미만, 1 % 미만, 0.5 % 미만, 또는 0 %의 카페인을 함유한 경우, 구체적으로 잔틴 알칼로이드가 없는 것으로 여겨진다. 가장 바람직하게는 구체적으로 잔틴 알칼로이드가 없는 농도는 0 % 테오브로민 및 0 % 카페인(제조물은 잔틴 알칼로이드가 없다)이다. 본 발명에 기재된 대표적인 제조물은 추가적으로 고안되고 및/또는 카테킨(catechin), 에피카테킨(epicatechin) 및 프로시아니딘 저중합체를 함유하는 본 발명의 방법으로 생산되었다. 상세한 실시예에서, 저중합체는 이량체(dimer) 내지 십이량체(dodecamer)이다. 예를 들어, 몇몇의 제조물에서 저중합체는 이량체(dimers), 삼량체(trimers), 사량체(tetramers), 오량체(pentamers), 육량체(hexamers), 칠량체(heptamers), 팔량체(octamers), 구량체 (nonamers), 또는 이들의 둘 또는 그 이상의 혼합물을 포함한다.

또한, 코코아 폴리페놀은 코코아 프로시아니딘인 제조물이 구상되었다. 본 발명에서 제공되는 코코아 폴리페놀 제조물은 액체 형태, 건도 형태, 또는 동결 건조 형태로서 제공될 수 있다. 코코아 폴리페놀은 건조 또는 동결건조 세포의 형태로부터의 추출 없이 제공될 수 있다.

하나의 실시예에서, 현탁 배양에서 추가적인 포도당의 첨가는 현탁 배양이 프로시아니딘의 생산을 증가시키는데 사용된다. 지수 생장 상태(exponential growth stage) 후에 세포 배양으로 포도당을 첨가하는 것은 프로시아니딘 생산을 증가시킬 수 있는 것이 발견되었다. 이와 같이, 포도당은 프로시아니딘의 생산을 상승시키는 유도제로 사용될 수 있다. 포도당은 다른 당(sugar)로 대체될 수 있다. 포도당은 배지의 중량 또는 부피의 약 0.5 % 내지 약 20 %, 더욱 바람직하게는 약 1 % 내지 약 10 %, 더욱 바람직하게는 약 2 % 내지 약 8 %, 더욱 바람직하게는 약 3 % 내지 약 6 %, 가장 바람직하게는 배지의 중량 또는 부피의 약 5 또는 6 %의 양을 첨가할 수 있다. 선택적으로, 포도당은 설탕(sucrose) 또는 과당(fructose)와 같은 다른 단당류로 대체될 수 있다. 포도당 또는 다른 단?류는 프로시아니딘의 생산을 증가시키기 위하여 세포 배양 중 어떠한 시간에도 첨가될 수 있다. 단당류는 접종(seeding) 후 1 내지 21 일에 도입될 수 있으며 프로시아니딘의 추출 전 한번 또는 여러 번 도입될 수 있다. 하나의 실시예로, 단당류의 첨가는 접종 후 1 내지 7 일에 첨가되며 다시 접종 후 7 내지 21 일에, 더욱 구체적으로는 접종 후 5 내지 8 일에 첨가되고 그 후 다시 12 내지 18 일, 및 더욱 구체적으로 약 7 일 및 다시 약 14 일에 첨가될 수 있다. 다른 실시예로, 단당류의 첨가는 지수 생장 상태의 마지막 상태(late stage) 전, 후, 및/또는 후에, 바람직하게 지수 생장 상태의 마지막 상태 또는 후에 될 수 있다. 세포는 포도당 첨가 후 1 내지 21 일, 또는 더욱 바람직하게 단당류 첨가 후 10 일경에 프로시아니딘이 추출될 수 있다.

또한, 구체적으로 본 발명에 기재된 어떠한 하나의 방법을 사용하여 생산된 무호르몬 코코아 폴리페놀(예를 들어, 프로시아니딘) 제조물을 제공한다. 구체적인 실시예에서, 코코아 폴리페놀 제조물은 호르몬의 검출 가능한 농도가 없다. 이러한 무호르몬 조성물의 관련된 생산 방법은 무호르몬 세포 배지에 1 일 내지 3 주 동안 세포를 배양하는 것을 포함한다. 의외적이고 예상치 못하게, 무호르몬 배지에서 생장한 세포는 추출물에서 프로시아니딘의 충분한 양을 생산하였다. 무호르몬 배지의 사용은 세포 배지의 추출물에서 호르몬 농도를 감소시키는데 유용할 수 있다. 세포 배양은 무호르몬 배지가 세포 매양 추출물의 감소된 호르몬 함량과 함께 프로시아니딘의 생산에 사용할 수 있는 무호르몬 배지와 같은 적절한 범위 내에서 실행 가능하다. 의외적이고 예상치 못하게 무호르몬 배지의 사용은 또한 프로시아니딘 생산의 상승을 가져오는 것을 발견하였다. 그런 이유로, 무호르몬 세포 배양은 추출 전에 호르몬 함량 정도를 감소시키며 및 프로시아니딘의 생산 증가를 위해 사용될 수 있다. 세포 배지의 호르몬 부족은 분화하지 않은(undifferentiated) 세포에 유용할 수 있다.

세포 배양 방법은 접종 또는 그 이후 어떠한 시간에 세포 배지로부터 호르몬을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 호르몬을 제거하는 방법은 세포로부터 세포 배양 배지의 제거 및/또는 세포는 구체적으로 호르몬을 함유하지 않는 세포를 무호르몬 배지에 도입하는 것을 포함한다. 하나의 측면에서, 호르몬은 접종 후 1 내지 14 일 사이에, 더욱 구체적으로 접종 후 1 내지 7 일 또는 접종 후 7 내지 14 일에 세포로부터 제거될 수 있다. 세포는 추출에 앞서 호르몬 없이 1 내지 3 주 동안, 더욱 바람직하게는 1 내지 2 주, 및 가장 바람직하게는 호르몬 없이 배양 후 1 주일 동안 배양될 수 있다. 무호르몬 배양 배지로의 접종은 25 %일 수 있다.

하나의 실시예에서, 프로시아니딘을 생산하는 세포는 포도당이 첨가되기 때문에 호르몬 없이 배양될 수 있다. 무호르몬 배지 및 첨가의 포도당은 독립적으로 프로시아니딘 생산의 향상을 보이므로, 놀랍고 예상치 못하게 포도당이 첨가되어 추가적으로 프로시아니딘의 생산을 증가시키는 무호르몬 배지를 넘어 무호르몬 배지 또는 첨가되는 포도당 단독으로도 사용된다. 흔히 세포 배양에서 다수의 다양한 조절은 예상치 못한 결과를 가져왔기 때문에, 상승된 프로시아니딘 생산의 결과는 놀랍고 예상하지 못했다. 그러나, 이 경우에 포도당을 첨가한 무호르몬 배지의 혼합은 구체적으로 추가로 무호르몬 배지 또는 단독으로 추가되는 포도당의 증가는 상승된 프로시아니딘 생산과 결합되어 부가적 효과를 가졌다. 세포 배양으로부터 호르몬 제거 단계, 포도당의 도입 및 프로시아니딘의 추출은 위에서 언급한 바와 같이 포도당 도입의 특징 및 무호르몬 배지에서의 배양과 함께 수행될 수 있다.

추가적으로, 포도당이 투여되기 전에 처음 세포가 무호르몬 배지에서 생장하는 무호르몬 배지의 배양 및 포도당의 존재에서 배양하는 것의 조합은 동시에 가능하다. 배양 기술은 하기 중 하나를 포함할 수 있다: 1 주 동안 세포로부터 호르몬을 제거, 포도당을 첨가, 그 후 프로시아니딘 추출 전 1 내지 21 일 동안 대기; 2 주 동안 세포로부터 호르몬을 제거, 포도당을 첨가, 그 후 프로시아니딘 추출 전 1 내지 21 일 동안 대기; 3 주 동안 세포로부터 호르몬을 제거, 포도당을 첨가, 그 후 프로시아니딘 추출 전 1 내지 21 일 동안 대기; 1 주 또는 그 이상 동안 세포에서 호르몬을 제거, 간격을 떨어뜨려 1 내지 14 일 에 두 번 또는 그 이상 양의 포도당을 첨가, 그 후 프로시아니딘 추출 전 1 내지 21 일 동안 대기; 접종 후 0 내지 14일 동안 세포로부터 호르몬을 제거, 상기 언급된 대로 포도당을 첨가, 그 후 프로시아니딘 추출 전 1 내지 21 일 동안 대기; 또는 이와 유사한 다른 배양 방법.

하나의 실시예에서, 프로시아니딘을 얻는 추출 과정은 세포 배양으로부터 단량체-십량체(decamer) 프로시아니딘의 추출 효율을 상승시키는 추출 용매로서 에탄올을 사용하였다. 이제, 환경 오염을 일으키는 것으로 알려진 아세톤에 비해 더욱 환경 친화적인 에탄올이 사용될 수 있다. 또한, 에탄올 추출은 재회수 및 재사용이 가능하다. 반면에, 아세톤은 재회수가 어렵다.

하나의 실시예에서, 프로시아니딘을 얻는 추출 단계는 또한 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 구연산(citric acid)과 같은 산화방지제(antioxidant)가 될 수 있는 산의 존재에서 진행될 수 있다. 산화방지제의 특성을 가지는 산성의 추출 용매는 산화적 분해(oxidative degradation)의 감소로 인해 프로시아니딘의 추출을 향상시킬 수 있다. 또한, 추출 효율은 세포 안으로의 투과성(penetration) 및 프로시아니딘의 유리(liberation)추출이 상승된 용매 덕분에 증가된다. 대체적으로 산 및 별개의 산화방지제가 사용될 수 있다.

세포 배양은 상기 언급된 코코아 폴리페놀(예를 들머, 프로시아니딘)을 생산하는 현탁 세포 배양의 사용과 마찬가지로, 언급된 방법의 어떠한 하나로서 생산되는 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양으로 수행될 수 있다.

하나의 실시예에서, 구체적으로 잔틴 알칼로이드가 없는 코코아 폴리페놀 제조물의 제조 방법은 코코아 폴리페놀을 생산하기 위해 충분한 시간 및 충분한 조건 하에서 생장하는 테오브로마 또는 헤라니아 세포 및 세포 혼탁 배양으로부터 코코아 폴리페놀을 회수를 포함할 수 있다. 본 방법의 실시예에서, 결과된 코코아 폴리페놀 제조물은 구체적으로(또는 전적으로, 몇 가지 경우에서) 검출이 가능한 카페인 및/또는 테오브로민이 없다. 다른 구체적인 실시예에서, 발효된 콩 꼬투리(fermented pods)로부터 만들어진 코코아 폴리페놀 제조물에 있는 것과 같은 제조물은 50 % 미만의 카페인 및/또는 테오브로민의 농도를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 발효된 콩(fermented beans)으로부터 만들어진 코코아 폴리페놀 제조물에 있는 것과 같은 세포-배양으로 만들어진 제조물은 30 % 미만, 20 % 미만, 15 % 미만, 10 % 미만, 또는 5 % 미만의 카페인 및/또는 테오브로민의 농도을 포함한다. 언급된 방법의 구체적인 실시예에서, 테오브로마 또는 헤라니아 세포는 코코아 프로시아니딘을 생산하기 위해 충분한 시간 및 충분한 조건 하에서 현탁 배양으로 생장되며, 및 세포 현탁 배양으로부터 코코아 프로시아니딘을 회수한다.

상기 제공된 대표적인 방법에서, 테오브로마 또는 헤라이나 세포 현탁 배양은 고체 생장 배지 위의 성숙하지 않은 테오브로마 또는 헤라니아 꽃 절편 또는 테오브로마 또는 헤라니아 식물 물질 유래의 캘러스 생장, 테오브로마 또는 헤라니아 캘러스 배양으로부터 빠르게 생장하는 세포주의 선택, 및 빠르게 생장한 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 세포의 현탁 배양 개시하는 것을 통해 생산된다.

어떠한 제공된 방법으로의 코코아 폴리페놀 생산(프로시아니딘을 포함하는)은 세포 회수; 폴리페놀 다량 함유 분획물(rich fraction)의 추출을 위해 세포 생물량(cell biomass)를 적절한 용매(예를 들어, 에탈올 추출용매)에 균질화(homogenizing); 프로시아니딘 다량 함유 분획물(예를 들면 용매-용매 추출 및/또는 크로마토그래피를 이용하여)의 분리; 및 선택적으로 건조, 동결건조 및 프로시아니딘 분획물의 농축을 포함한다. 몇 가지 경우에서 세포의 회수는 원심분리, 여과(filtration), 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 실시예는 카카오 세포의 세포 현탁 배양 생산 방법이다. 본 방법의 실시예는 고체 생장 배지 위의 성숙하지 않은 테오브로마 또는 헤라니아 꽃 절편 또는 테오브로마 또는 헤라니아 식물 물질 유래의 캘러스 생장, 테오브로마 또는 헤라니아 캘러스 배양으로부터 빠르게 생장하는 세포주의 선택, 및 빠르게 생장한 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 세포의 현탁 배양 개시하는 것을 포함한다. 실시예를 통하여, 성숙하지 않은 테오브로마 카카오 또는 헤라니아 꽃 절편은 몇 가지 경우에서 헛수술, 꽃받침 및 꽃잎 기저 절편으로부터 선택되었다. 구체적으로 다르게는, 테오브로마 카카오 또는 헤라니아 식물 물질은 어리거나 또는 성숙한 잎, 줄기, 절간, 분열조직, 또는 절간으로부터 선택되었으나, 이에 한정하지 않는다.

선택적으로, 카카오 세포의 세포 현탁 배양 생산 방법은 플라스크, 다른 적합한 배양 기구, 또는 생물반응기 내에서 생장하는 것을 포함한다. 예를 들어, 몇가지 경우에서 생장은 기구 또는 생물 반응기에서 및 배치(batch), 유가식배치(fedbatch) 또는 연속적 방식(continuous mode)으로 이루어진다.

또한, 고안된 본 발명은 코코아 폴리페놀 또는, 더욱 구체적으로, 프로시아니딘을 생산하는 현탁 세포 배양의 사용과 마찬가지로, 언급된 방법의 어떠한 하나로서 생산되는 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양이다.

세포 배양은 상기 언급된 코코아 폴리페놀(예를 들머, 프로시아니딘)을 생산하는 현탁 세포 배양의 사용과 마찬가지로, 언급된 방법의 어떠한 하나로서 생산되는 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양으로 수행될 수 있다.

또 다른 실시예는 이러한 연구는 코코아 폴리페놀 혼합물 및 자연스럽게 구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없는, 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양으로부터 추출된 코코아 폴리페놀 제조물을 제공한다. 용어 "자연스럽게 구체적으로 카페인 및 테오브로민이 없는"과 관련하여 "자연스럽게"는 LH-20 크기 제와 크로마토그래피(size exclusion chromatography)와 같은 정제 과정을 통하여 가페인 및 테오브로민이 상대적으로 없는 것이 일어나지 않는 것을 나타낸다. 이와 같이, 본 발명에서 언급된 공정으로 얻는 1차 세포 배양 추출은 구체적으로 추가적인 정제 없이 카페인 및/또는 테오브로빈이 없을 수 있다. 그러나, 일차 추출물로부터 원하는 농도보다 많은 카페인 및/또는 테오브로빈이 얻어진 경우, 추가적인 정제가 수행될 수 있다.

추가적인 실시예는 헥산(hexane) 또는 다른 유기용매를 사용하여 탈지(defatting) 과정을 거치치 않는 코코아 폴리페놀 추출 제조의 방법이다. 에탄올은 이 공정에서 유기용매로 여기지 않는다. 이와 같이, 본 발명에서 언급한 코코아 폴리페놀 제조물(예를 들어, 프로시아니딘)은 헥산을 사용하지 않고 만들어진다(예를 들어, 추출된다). 코코아 폴리페놀 추출물은 구체적으로 또는 온전히 헥산 또는 아세톤 또는 이와 같은 어떠한 유기용매를 함유하지 않을 수 있다.

본 발명에서 제공되는 코코아 폴리페놀 제조물은 식품용 조성물, 및/또는 치료용 조성물, 및/또는 동물 치료용 조성물, 및/또는 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

IV. 코코아 조직 배양

본 발명에 기재된 방법은 테오브로마 또는 헤라니아의 세포 배양로부터 프로시아니딘을 효과적으로 분리하는 것이다. 구체적으로, 테오브로마 또는 헤라니아 세포 현탁 배양은 코코아 콩으로부터 추출된 프로시아니딘과 유사한 프로시아니딘의 일반적으로 분리하는 것이 수립되었다. 더욱이, 본 발명에서 제공된 방법은 이러한 프로시아니딘의 풍부한 세포 배양 재료 생산의 결과를 가진다. 이러한 방법의 대표적인 장점은: 기후적 조건의 조절로 인한 신뢰할 수 있고, 지속적인 생물량(biomass)의 재료(source); 추출 과정 동안 프로시아니딘의 분해를 최소화하는 빠르고 효율적인 분리 과정; 코코아 콩으로부터 분리되는 프로시아니딘의 조성물과 유사한 세포 배양으로부터 분리된 프로시아니딘; 세포 배양 프로시아니딘 생산성을 조작하고 최적하는데 유용한 기술을 포함한다.

일반적으로, 기재된 본 발명에서 테오브로마 또는 헤라니아 식물의 다양한 조직 유래 캘러스 배양의 수립이다. 수립된 캘리(calli)는 다양한 유형의 세포 배양 배지를 이용하여 현탁 배양에서 재배되는 것에 사용된다. 안정한 현탁 세포 배양이 진행될 때 세포는 추출되며 알려진 흡광분석(spectrophotometric) 방법에 의해 프로시아니딘 컨텐츠(content)가 분석되고, 동시에 HPLC-MS 방법은 개별적인 프로시아니딘의 확인에 사용된다. 이러한 분석으로부터, 바람직한 프로시아니딘을 생산할 수 있는 현탁 배양은 추가적인 생산성의 최적화를 위해 선택된다.

코코아 배양의 생성

코코아 배양을 생성하는 과정은 보통 본 발명에 기재되어 있으며, 상세한 모범적인 프로토콜은 실시예에 기재되어 있다. 요약하자면, 세부 사항은 알려진 변수에 따라 당업계의 당업자에 의해 달라질 수 있으나, 프로시아니딘을 생산하는 세포 배양의 개시는 체세포 배발생(aomatic embryogenesis)로 기재되는 다양한 식물 부분, 예를 들면, 꽃잎, 꽃받침, 헛수술 등 또는 마디, 절간, 어린 잎, 성숙한 잎과 같은 비-꽃 식물 생장 관련 조직 중 어느 것으로부터 유래된 절편으로부터 캘러스 및 현탁 배양을 수행함으로써 달성된다. 현탁 배양은 신선한 배지로 상기 배양된 세포의 부분을 주기적 이동함으로써 신선한 현탁 배양 배지에서 유지된다. 이동 주기 및 접종 밀도는 배지에서 세포의 생장 능력 및 당의 소비로부터 결정된다.

하나의 실시예는 충분한 조건 하에서 상기 배양을 개시하고 충분한 생산 배지를 세우는 프로시아니딘-생산 배양 개시에 관련한 프로시아니딘의 함량을 조절하고, 그 후 프로시아니딘의 분리에 적절한 양의 시간 동안 생산적인 세포 배양의 규모를 확대하는 방법을 제공한다. 따라서, 조건을 바꾸는 것은 배양을 개시하거나, 상기 배양에서 프로시아니딘의 조작된 양을 유도하는 생산하는 배양을 수립하는 것을 필요로 한다. 상기 식물 세포 배양 미세환경의 물리적 측면(예를 들면, 빛 조사) 및/또는 화학적 측면(예를 들면, 배지 조성물 또는 화학적 유도인자)은 바람직한 변경된 양을 달성하기 위해 달라질 수 있다.

예를 들면, 현탁 배지의 탄수화물(예를 들면, 설탕(sucrose) 또는 포도당) 농도는 배양에서 프로시아니딘의 양을 증가시키기 위해 증가시킬 수 있다. 또한, 질소원(예를 들면, 질산암모늄(ammonium nitrate))은 식물 세포 배양에서 2차 대사산물의 생산을 위해 조작될 수 있다(참조 Neera et al., Phytochemistry. 31(12): 4143-4149, 1992). 따라서, 테오브로마 또는 헤라니아 세포 배양 배지에 질소원 농도의 감소는 배양에서 프로시아닌딘의 생산을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 추가로, 특정한 아미노산(글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 및 세린(serine)과 같은)의 확산은 2차 대사 산물의 생산에 현저히 영항을 줄 수 있다. 결과적으로, 테오브로마 또는 헤라니아 현탁 배양안의 이러한 아미노산의 농도는 프로시아니딘의 생산을 강화하기 위해 증가시킬 수 있다. 추가적으로, 호르몬은 테오브로마 또는 헤라니아의 현탁 배양에 의한 프로시아니딘의 생산을 증가시키는배지로부터 제거될 수 있다.

또한, 조명 조건은 테오브로마 또는 헤라니아의 세포 배양 안의 조작된 프로시아니딘 양을 달성하기 위해 변할 수 있다. 예를 들면, 조명은 조사 또는 빛의 노출 길이를 증가시킴으로써 변화될 수 있으며, 이로 인해 프로시아니딘 생산이 증가된다. 빛 조사의 파장은 프로시아니딘의 증가된 생산을 달성하기 위해 변화될 수 있다. 예를 들면, 자외선(UV light)은 식물 세포 배양에서 안소시아닌(anthocyanin) 생산을 유도하는 것으로 알려져 있다(Meyer, J. Biotechnology 93: 45-57, 2002).

식물 세포 배양 미세환경의 조작에 대해 당업계에 알려진 다른 조작은 본 설명의 범위 내에서 고려되며 관련 기술의 당업자에 의해 수행될 수 있다.

추가적으로, 코코아 세포는 본 발명에 기재된 대로 배양될 수 있다. 예를 들어, 배양은 프로시아니딘의 추출에 앞서 같은 지점에서 포도당이 첨가될 수 있다. 포도당은 설탕, 과당, 또는 이와 같은 다른 당으로 대체될 수 있다. 포도당은: 접종(seeding)시; 접종 후 1 내지 7 일; 접종 후 7 내지 14 일; 접종 후 14 내지 21 일; 또는 이들의 조합으로 세포 배양에 도입될 수 있다. 다른 실시예에서, 배양은 프로시아니딘의 추출에 앞서 무호르몬 배지에서 생장될 수 있다. 배양에서 무호르몬 배지는: 접종시; 접종 후 1 내지 7 일; 접종 후 7 내지 14 일; 접종 후 14 내지 21 일; 또는 이들의 조합으로 세포에 도입될 수 있다.

배양으로부터 코코아 세포의 회수

프로시아니딘을 생산하는 테오브로마 또는 헤라니아 세포 배치(batch)는 본 발명에 기재된 대로 배양되었고, 세포는 프로시아니딘의 추출을 위해 회수되었다. 현탁 세포의 회수는 몇 가지 방법에서, 본 발명에 기재된 실시예에서 수행될 수 있다.

세포 배양이 정지기(stationary phase)에 도달하고, 프로시아니딘의 바람직한 생산량에 도달하면, 배양은 컨테이너(container) 안에 농축된 덩어리(compact mass)로 가라앉게 되며, 일반적으로 고체 세포 생물량 뒤에 남겨지는 배지는 옮길 수 있다. 세포 생물량은 그 후 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 마찬가지로 옮긴다. 그 대신에, 상기 세포 현탁은 원심분리될 수 있으며, 상기 상층액(배지)를 제거한 다음 세포 덩어리를 세척하고 다시 원심분리하여 액체를 제거한다. 세 번째 선택 사항(option)은 배지를 제거하기 위해 세포 배양 현탁액을 여과하는 것이다. 이러한 방법 중 어떤 것은 작은 ml부터 배양의 몇 천 L 규모 부피의 생산 범위의 세포 배양 부피까지 적용될 수 있다.

추출 과정

시료와 추출 용매의 표면적을 증가, 및 전체 시료에서 대표적인 추출 부분을 보장하도록 세포를 균질화(homogenize) 및 분해(break up)하기 위해 회수한 세포 덩어리는 파쇄(crushed), 가공(milled) 또는 제분되었다.

프로시아니딘은 불안정한 화합물이다. 따라서, 세포 생물량가 추출 전에 저장되는 것이 필요하다면, 동결 보존이, 예를 들면 액체 질소와 함께 동결되는 것이 바람직하다.

테오브로마 또는 헤라니아 세포 배양로부터 전체 폴리페놀의 추출은 코코아 콩으로부터 전체 폴리페놀을 추출하는데 사용한 방법과 몇 가지 주요한 차이점을 제외하고 유사하다. 코코아 콩의 경우, 콩을 간 후의 개시 단계는 상기 갈린 조각을 탈지(defat)하는 것이다(nibs). 이 과정은 결과적으로 폴리페놀을 잃는다. 세포 배양은 콩보다 더 많은 지방을 가지 않으므로, 이러한 단계가 필요하지 않다. 이 단계를 제거하는 것은 세포 배양으로부터 추출 단계 동안 폴리페놀의 손실을 감소시킨다.

또한, 탈지는 헥산과 같은 용매를 요구하며, 최종 추출물에서 용매의 흔적이 발견된다. 이것은 코코아 콩으로부터 생산된 추출물 안에서 불쾌한 냄새(odor)를 유발하며, 용매는 독성이 있을 수 있거나 식품 성분과 같은 특정한 사용에 바람직하지 않을 수 있다. 세포 배양 생물량 유래 추출물에 대한 본 발명에 기재된 방법은 용매의 사용을 제거하므로(헥산과 같은), 결과 추출물에서 용액 오염 또는 불쾌한 냄새가 없다.

대표적인 방법에서 폴리페놀은 70 내지 80 % 메탄올 수용액(aqueous methanol) 또는 70 % 아세톤 수용액(aqueous acetone), 또는 그들의 조합과 함께 갈리고, 균질환된 세포로부터 추출된다. 또한, 물 및 에탄올이 사용되었으며, 이러한 용매를 사용하여 저중합체의 프로시아니딘만이 부분적으로 추출되며, 높은 분자량의 폴리머(polymers)는 전혀 추출되지 않는다(Grayer, In J.B. Harborne, Plant Phenolics (Vol. 1), pp 283-323, 1989. San Diego, Academic Press, Inc.; Lee & Widmer, In L.M.L. Nollet, Handbook of Food Analysis (Vol. 1), pp 821-894, 1996, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.).

하나의 실시예에서 추출 용매는 에탄올을 포함한다. 에탄올은 중량 또는 무게의 약 25 % 내지 100 %, 더욱 바람직하게는 50 % 이상, 더욱 바람직하게는 75 % 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 에탄올을 포함하는 수용액 조성이 될 수 있다. 구체적인 50 % 에탄올, 60 % 에탄올, 70 % 에탄올, 및 80 % 에탄올을 포함하며, 도면 12는 60 % 에탄올이 우수함을 보인다. 이 실시예에서, 에탄올 추출용매는 다른 알코올 또는 케톤(ketones)을 함유하지 않는다.

하나의 실시예에서, 추출 용매는 유기용매 수용액과 같은, 물 및/또는 에탄올과 함께 다른 알코올 또는 케톤을 포함할 수 있다. 실시예는 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol), 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트(ethylacetate) 또는 이들의 조합을 포함한다. 유기용매 수용액은 약 25 % 내지 약 99 %의 물을, 더욱 바람직하게는 약 30 % 내지 90 %, 또는 훨씬 더욱 바람직하게는 50 % 이상의 물을 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 추출용매는 세포 덩어리의 양에 의존하여 다양한 양의 가공(processed) 또는 비가공된(unprocessed) 세포와 혼합된다. 추출 용매의 양은 세포 덩어리의 50 %, 더욱 바람직하게는 약 75 % 또는 그 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 100 % 또는 그 이상, 및 훨씬 더욱 바람직하게는 세포 덩어리의 질량 및 부피의 200 % 이상이 될 수 있다. 물론, 더 많은 부피의 추출 용매가 사용된다.

하나의 실시예에서, 추출 용매는 산화방지제 산과 같은 산을 포함한다. 산의 예는 아세트산(acetic acid), 구연산(citric acid), 또는 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함한다. 산은 추출액 조성물의 부피 또는 추출 용매 부피의 약 0.05 % 내지 10 %, 더욱 바람직하게는 약 0.75 & 내지 약 5 %, 더욱 바람직하게는 추출액 조성물의 부피 또는 추출 용매 부피의 약 0.1 % 내지 약 1 % 또는 약 2 %로 존재할 수 있다.

미량 성분에 대한 완전한(exhaustive) 추출 후, 개별적인 프로시아니딘은 희석된 농도로 추출물 내에 존재할 수 있다. 농도는 낮은 온도(40℃ 이하) 및 프로시아니딘의 분해를 최소화하도록 감소된 압력하에서 이루어진다(Lee & Widmer. In L.M.L. Nollet, Handbook of Food Analysis (Vol. 1), pp 821-894, 1996, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.).

이 시기의 테오브로마 또는 헤라니아의 세포 배양으로부터 추출된 폴리페놀은 상대적으로 깨끗하며 즉시 분석이 가능하다. 본 발명에 기재된 방법의 한 가지 장점은, 세포 배양 유래 테오브로마 또는 헤라니아 폴리페놀 추출물이 콩의 폴리페농 추출물에 비해, 우선, 검출할 수 없는 불순물(예를 들면, 카페인 및 테오브로민) 농도를 갖는 것이다. 하지만, 카페인 및 테오브로민과 같은 미량 불순물을 제거하는 추가적인 정화(clean-up)가 유익할 수 있다. 이러한 불순물 흔적조차 제거하기 위한 추출물 정화가 가능하다. 이러한 정화단계는 혼화되지 않는(non-miscible) 용액이 있는 액체-액체 칸막이(partitioning) 및 Sephadex LH-20의 컬럼 크로마토그래피(column chromatography), 폴리아미드(polyamide), 엠버라이트(Amberlite) XAD-2, 예비 HPLC, 및 상업적으로 일회용의 카트리지(cartridges)를 이용한 고체상 추출(solid phase extraction, SPE)를 포함할 수 있다(Grayer, In J.B. Harborne, Plant Phenolics (Vol. 1), pp 283-323, 1989. San Diego, Academic Press, Inc.; Markham & Bloor, In C.A. Rice-Evans and L. Packer, Flavonoids in Health and Disease, pp 1-33, 1998, Basel, New York, Hong Kong, Marcel Dekker, Inc.). 대부분의 플라보노이드(flavonoids)가 이러한 용매에서 제한된 용해능을 가지므로, 테오브로민 및 카페인의 제거는 보통 클로로포름(chloroform) 또는 염화 메틸렌(methylene chloride)과 함께 추출로 이루어질 수 있다.

분석 과정

테오브로마 또는 헤라니아 세포 배양 유래 프로시아니딘의 검출 및 분석에 대해 사용된 분석적 기술은 콩 유래 추출물에 사용된 것과 유사하다. 코코아 프로시아니딘의 확인은 대부분 저중합체의 분리를 위한 다양한 크로마토그래피 기술을 사용한 후, 구조적 특징에 대한 독립적인 방법을 사용하여 이루어졌다. Quesnel (Phytochemistry 7: 1583-1592, 1968), 및 Jalal 및 Collin (Phytochem. 16: 1377-1380, 1977)은 종이 크로마토그래피(chromatography) 및 TLC 방법을 이용하여 코코아 내의 프로시아니딘을 확인하였다. 하지만, 코코아에서 프로시아니딘이 있음이 알려진 인정한 이러한 연구에도 불구하고, 상기 프로시아니딘의 입체특이적 구조는 설명되지 않았다. Porter et al. (Phytochemistry 30: 1657-1663, 1991)는 컬럼 크로마토그래피, TLC, HPLC 및 음이온(negative ion) FAB/MS 을 사용하여 저중합체(oligomers)부터 칠량체(heptamers)까지 프로시아니딘의 존재를 밝히기 위해 코코아 내의 프로시아니딘의 조사를 수행하였다. 추가적으로, 그들은 NMR을 사용하여 사량체(tetramer)까지 프로시아니딘의 구조를 확인하였고, 주로 (-)-에피카테킨((-)-epicatechin)으로 구성된 것을 발견하였다. 저중합체부터 팔량체(octamers)까지 코코아 프로시아니딘의 증거는 프로시아니딘 저중합체를 특정화 하기 위해 컬럼 크로마토그래피, 역상 HPLC, 및 양이온 LSIMS의 조합을 이용한 Clapperton et al. (Proceedings, 16th International Conference of Groupe Polyphenols, Lisbon, Portugal; Groupe Polyphenols: Norbonne, France, Vol II, pp 112-115, 1992)에 의해 보고되었다. 이 연구는 거대한 프로시아니딘 저중합체를 확인하는 수단으로서, 양이온 LSIMS의 사용 및 나트륨 부가물(adducts)의 사용을 기재하였다. 불행히도, 이러한 모든 방법은 힘들고(laborious), 구조적 정보를 얻기 위해 긴 제조 시간을 요구하며, 높은 처리량(throughput) 분석 및 다수의 세포 배양 시료 스크리닝에 적당하지 않다. 또한, 이러한 방법은 작은 시료에 적합하지 않다.

현재 공개된 문헌에 대해, 본 발명자들은 테오브로마 또는 헤라니아 세포 배양 유래 프로시아니딘의 추출물에 대한 높은 처리량 소규모(microscal) 방법, 프로시아니딘 단량체 및 저중합체의 빠른 분리를 위한 역상(reverse phase) HPLC방법, 및 그들의 분자적 특징에 기반한 프로시아니딘 저중합체의 동시적 확인을 위한 질량 분광기(spectroscopy, MS) 방법을 개발하였다.

테오브로마 또는 헤라니아 세포 배양의 대규모( large - scale ) 공정 최적화

대규모 세포 배양은 상업적 과정의 개발에서 중요한 기술이다. 이것은 미생물 발효에서 사용되는 것과 유사한 큰 탱크(tank)에서 수행될 수 있다. 이러한 탱크에서 생산성 향상은 대규모에서 세포의 생장 및 생산 특징에 기반한 생체분자(Biomolecular) 요인(factor)을 결정하고, 프로시아니딘 생산성을 향상시키것이 유동적인 대량 생물공정(bioprocess)을 최적화함으로써 이루어질 수 있다. 생체분자 요인은 생합성 과정에서 배지 성분, 유도인자(elicitors) 및 전구체를 포함한다. 대규모 과정의 목적은 더 작은 규모에서 최적화되었던 조건을 대규모에서 재현하는 것이기 때문에, 대규모 과정 이전에, 이러한 요인들은 플라스크-규모 과정에서 시험 되어야한다. 하지만, 대량 생물반응장치 배양에서 조건은 플라스크-규모 배양에서 테오브로마 또는 헤라니아 현탁 세포와 다를 수 있다. 배양의 대규모운동(macrokinetic)은 수송(transport) 제한으로 인한 현탁된 세포에 영향을 미치는 환경적 조건 변화에 영향을 받는다. 예를 들면, 생장 동역학(growth kinetics)의 기준은 규모에 독립적이지만, 용기에서 세포 배양의 전체적인 생장은 기체의 이동 및 용해된 영양분 및 대사산물의 규모에 의존하기 때문에 규모 의존적이다(Dicosmo & Misawa, Plant Cell Culture Secondary Metabolism, pp11-44, 1996. Boca Raton, Florida, CRC Press LLC). 따라서, 코코아 프로시아니딘 생산을 위한 생물반응기 공정의 규모 확대에서, 생장 속도, 생산물 형성 속도, 영양분 흡수 속도 및 호흡률의 기본적인 데이터의 산출을 위해 다수의 기본적인 실험이 수행되었다.

일반적으로, 식물 세포 배양에서 높은 생산성은 세포 농도 및 특정 생산성을 증가시킴으로써 이루어질 수 있다. 최대 세포 농도는 영양분 공급, 기질 당 생물량의 수율 및 수분(water content)에 의존한다. 기초 데이터에 기반하여, 추가적인 환경 요인들이 생물량를 증가시키기 위해 한번에 변경될 수 있는 하나 또는 복수의 요인들에 의해 변경된다. 따라서, 대부분 폴리페놀이 비-생장(non-growth) 관련 화합물이기 때문에, 두 단계 배양이 고려될 수 있다. 단일 단계 과정은 이상적으로 단일 생장률 및 짐작컨대 단일 발달 단계에 배양을 제한하기 때문에, 이 작업(operation)은 몇몇 발달 단계가 비-생장 관련 화합물의 생산이 전제된 경우 적합하지 않을 것이다. 통기율(aeration rate), 교반 속도, 다른 혼합에 관련된 변수 및 심지어 배지 조성의 변수는 생장 단계 및 생산 단계에 대해 개별적으로 최적화된다. 그러나, 최적화한 모든 조건을 유지하는 동안 과정의 규모를 확장하는 것은 불가능하다. 선택은 가장 중요하게 여겨지는 변수에 관하여 만들어져야 한다.

또한, 탄소 및 질소원의 연관된 양이 2차 대사 산물의 생합성 및 세포 생장을 향상시키는데 중요한 역할을 하기 때문에, 생장 및 생산에서 첨가하는 탄소 및 질소원의 효과는 탄소 및 질소 소비의 기초 공학(basic engineering) 데이터에 기반하여 조사되었다(Basaria, Current Biology, 2: 370-374, 1990). 그 후, 산소 및 이산화탄소의 공급이 조사될 수 있다. 산소뿐 아니라, 이산화탄소는 식물 세포 배양에서 세포 생장 및 2차 대사 산물 생산을 개선하는 것으로 보고되었다(Thanh et al., Biologia Plantarum, 50: 752-754, 2006; Tate & Payne, Plant Cell Reports, 10: 22-25, 1991). 식물 세포의 산소 요구량은 세포 생장 단계에서 비교적 낮지만, 대사 산물의 합성 동안 현저히 증가할 수 있다. 이러한 가스의 농도은 테오브로마 또는 헤라니아 세포의 반응기 배양에서 그들의 최적화된 사용으로 조절된다. 대규모 발효에서, 실험적 규모에서 도입될 수 있는 동일한 양의 기체(공기, 산소 등)를 도입하는 것은 불가능하다. 따라서, 질량 이동 계수 상수(mass transfer coefficient constant)는 생물반응기 과정에서 표면의 기체 속도 상수(gas velocity constant)를 만들기 위해 유지되어야만 한다.

산소는 탄소원의 대사 과정에서 중요한 역할을 하며 생물(organism)의 생장 및 생산물 형성 동역학에 의존하여 도입될 수 있다(Shuler & Kargi, Bioprocess Engineering: Basic Concepts, Second Edition, 2002. Upper Saddle River, NJ, USA, Prentice-Hall, Inc.). 높은 용존 산소 농도의 반응기 내 식물 세포의 배양은 이전에 탁산(taxane) 생산을 통해 기재되었다(예를 들어, U.S. Patent No. 7,264,951 참고). 코코아 세포 배양의 생장 및 생산에서 높은 용존 산소 기체 농도의 효과는 10 L 내지 20 L의 에어-리프트(air-lift) 생물 반응기 뿐 아니라 기체-7.5 L 내지 30 L의 기계적인 교반 반응기를 포함하는 다양한 종류 및 크기의 생물 반응기로 개발되었다. 본 발명자들은 높은 용존 산소 농도의 가스 체제(regimes)는 대규모 코코아 세포 생장 및 높은 폴리페놀 생산을 필요로 함을 발견하였다. 생물 반응기에 공급된 공기 및 정제된 산소의 조합(blend)에서, 생장 및 배양 유도 단계 동안에 코코아 세포 현탁의 필요 조건에 의존하여 최적화된 주입구(inlet) 가스 체제의 산소의 범위는 약 1 % 내지 100 % 이다. 생장 단계 및 유도 단계 동안 코코아 세포 배양 배지의 용해된 산소 농도는 공기 포화도의 1 % 내지 공기 포화도의 400 % 범위일 수 있다. 스퍼저(sparger)를 통해 생장 단계 동안 생물반응기 내로 공기/산소 혼합물로서 제공되는 산소 부분은 기체 혼합물의 1 % 내지 100 %의 범위이다. 유도 단계 동안 생물반응기 내로 공기/산소 혼합물로서 제공되는 산소 부분은 기체 혼합물의 1 % 내지 100 % 범위, 바람직하게는 25 % 내지 100 %의 범위이다.

대사 산물 형성 및 방출을 활성화하는 유도 인자의 사용은 중요한 과정 전략이다. 높은 생산물 농도, 예를 들면 용적측정의(volumetric) 생산성,에 도달하는데 필요한 과정 시간을 감소시키는데 매우 유용하다. 또한, 유도(elicitation)는 새로운 화합물의 형성을 유도할 수 있다(Payne et al., Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, pp333-351, 1995, New York, John Wiley & Sons, Inc). 몇몇의 생물(biotic)/비생물(abiotic) 후보물 유도의 최적화는 그들을 처리해야 하는 때, 어떤 용량이 가장 좋을 수 있는지, 얼마나 오랫동안 세포가 노출되어야 하는지, 및 세포가 회수되는 때를 최적화하기 위해 대규모 반응기 배양에서 시험되었다. 각 유도인자는 생합성 과정에서 효소의 다른 종류를 유도할 수 있기 때문에, 유도인자의 복합적인(multiple) 처리를 이용한 상승적(Synergistic) 효과는 생산성을 향상시키는 것에 시험되었다.

반응장치 작업 방법은 생장, 생산 및 그들의 상호작용(relationship)에 대한 세포 역학(dynamics)에 의존한다. 앞서 기재한 바와 같이, 본 발명의 표적 화합물은 비-생장 관련으로, 두 단계 배양 과정이 고려되어야 한다. 따라서, 유가식배치(fed-batch) 배양은 구체적으로 생산 시간이 생물량가 생장하는 것에 요구되는 시간에 비해 길 때 매력적인 선택이며, 이러한 경우에, 생물량 집단(train)에서 더 적은 수의 생물만응기의 결과로, 계속해서 생물반응기의 부피가 더 큰 단계가 가능하다.

V. 프로시아니딘의 사용 및 투여량

본 발명에 공개된 방법에 의해 유도된 프로시아니딘은 치료용, 식품용 또는 화장료 목적을 위해 개체에 투여될 수 있다. 개체는 인간 또는 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 쥐(mouse) 또는 랫(rat)과 같은 가축 포유 동물일 수 있다.

치료용 사용에 관해, 상기 프로시아니딘은 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), 심장혈관계 질환(cardiovascular disease), 암, 혈압조절 및/또는 고혈압과 같은 몇몇의 장애 또는 질환을 치료 또는 예방하는 것에 사용될 수 있다. 예를 들면, 프로시아니딘은 종양이 발생할 위험이 있는 개체, 종양을 가지는 개체 또는 기존에 종양을 치료하는 개체에 투여될 수 있다. 종양의 치료는 상기 종양의 수술적 제거, 화학요법, 면역치료 또는 방사선 치료를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 실시예에서, 본 발명의 공개된 방법에 의해 유도된 프로시아니딘은 적어도 하나의 첨가제와 조합되어 종양 치료 전, 동시, 또는 후에 개체로 투여한다. 또한, 첨가제는 본 발명에 기재된 다른 물질일 수 있으며, 종양 생장을 저해 또는 감소시킨다. 그 대신에, 첨가제는 종양 생장을 저해하는 개체의 능력을 개선하는 물질 또는 종양 치료 과정 동안 개체가 감염에 대항하는 것을 돕는 물질(항생제와 같은)일 수 있다. 예를 들면, 첨가제는 사이토카인(cytokine)과 같이 면역계를 자극하는 물질일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 방법에 의해 유도된 프로시아니딘은 어떤 종류의 종양이 발생하는 위험이 있는 개체 또는 어떤 종류의 종양을 가지는 개체에 투여될 수 있다. 상기 종양은 양성 종양 또는 악성 종양일 수 있다. 상기 종양은 상피성 암(carcinoma), 육종(sarcoma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma) 또는 신경계(nervous system) 종양을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 종양은 유선 종양(breast tumor), 간 종양(liver tumor), 췌장 종양(pancreatic tumor), 위장 종양(gastrointestinal tumor), 결장 종양(colon tumor), 자궁 종양(uterine tumor), 난소 종양(ovarian tumor), 자궁 경부 종양(cervical tumor), 고환 종양(testicular tumor), 전립선 종양(prostate tumor), 뇌 종양(brain tumor), 피부 종양(skin tumor), 흑색종(melanoma), 망막 종양(retinal tumor), 폐 종양(lung tumor), 신장 종양(kidney tumor), 골 종양(bone tumor), 골육종(osteosarcoma), 비인두 종양(nasopharyngeal tumor), 갑상선 종양 (thyroid tumor), 백혈병(leukemia), 또는 림프종(lymphoma)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 본 발명에서 제공된 방법에 의해 유도된 프로시아니딘 종양 생장을 방지하거나 저해하기 위해 충분한 양이 개체에 투여될 수 있다.

다른 실시예에서, 프로시아니딘은 예방을 위해 아테롬성 동맥 경화증, 심장혈관계 질환 또는 고혈압이 발달되는 위험이 있는 개체에 투여될 수 있다. 대신에, 프로시아니딘은 아테롬성 동맥 경화증, 심장혈관계 질환 또는 고혈압과 같은 존재하는 질환을 치료하기 위한 개체에 투여될 수 있다. 조성물은 함께 투여되거나 또는 항종양 물질, 항산화제, 또는 아테롬성 동맥경화증, 심장혈관계 질환, 혈압 조절 및/또는 고혈압에 관련한 증상 또는 상태를 완화하는 물질이 순차적으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에서 제공된 방법에 의해 유도된 프로시아니딘은 식품용 조성물로 이용될 수 있다. 액체 형태로 경구 투여될 때, 액체는 물-기반, 우유-기반, 차-기반, 과일 주스-기반 또는 그들의 어떤 조합일 수 있다. 내부 투여를 위한 고체 및 액체 제형은 추가적으로 진한 감미료를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 공개된 발명에 의해 유도된 프로시아니딘은 개체의 피부 질 또는 외관(appearance)을 개선하는 화장료 조성물로 쓰일 수 있다. 개선된 피부 외관, 질감(texture), 및 습기는 상기 프로시아니딘 조성물을 외부로(externally), 내부로(internally) 또는 이들의 조합으로 투여함으로써 이루어질 수 있다. 허용가능한 운반체(carrier)는 조성물의 구성분에 대하여 용액, 운반체, 희석액(diluent) 또는 분산제(dispersant)로서 다양하게 작용할 수 있고, 적절한 희석에서 피부의 표면에 균일하게 적용하게 할 수 있다. 또한, 허용 가능한 운반체는 피부로 조성물의 침투를 가능하게 할 수 있다.

본 발명에서 공개된 방법에 의해 유도된 프로시아니딘을 포함하는 조성물은 약학적 생산물, 식품 생산물 및 음료 조성물을 포함하는 넓은 범위의 완성된 생산물에 유용하며, 제약업계의 당업자에 잘 알려진 표준(standard) 기술에 따라 제조될 수 있다. 활성 물질을 포함하는 약학적 조성물은 선택된 투여의 특정 형식에 따라 적합한 고체 또는 액체 운반체와 만들어질 수 있다. 이 문헌에서 유용한 약학적 허용가능한 운반체 및 첨가제는 일반적이다.

예를 들면, 비경구 제형(parenteral formulations)은 보통 약학적 및 생리학적으로 허용가능한 물, 생리적인 염분, 다른 안정된 염용액, 덱스트로오즈(dextrose) 수용액, 글리세롤(glycerol) 또는 이와 유사한 것과 같은 유체 운반체인 주입가능한 유체를 포함한다. 포함될 수 있는 첨가제(Excipients)는, 예를 들면 인간 혈청 알부민(albumin) 또는 혈청 제조물과 같은 다른 단백질이다. 또한, 바람직하게는, 투여되는 상기 프로시아니딘 조성물은 습윤(wetting) 또는 유화제(emulsifying agents), 방부제(preservatives), 및 pH 완충제 및 이와 유사한 것들, 예를 들면 초산나트륨(sodium acetate) 또는 소르비탄 모노라우린산염(sorbitan monolaurate)과 같은 미량의 비-독성 보조제를 포함할 수 있다.

주입 가능한 유체에 더하여, 국소 및 경구 제형이 적용될 수 있다. 경구 제형은 액체(예를 들면, 시럽, 음료, 용액 또는 현탁액), 또는 고체(예를 들면, 가루, 정제(pill), 정제(tablets) 또는 캡슐(capsules))일 수 있다. 고체 조성물을 위해, 기존의 독성이 없는 고체 운반체는 만니톨(mannitol), 락토스(lactose), 전분 또는 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate)의 약학적 등급을 포함할 수 있다. 국소 제조물은 점안액(eye drops), 연고(ointments), 크림, 분무 및 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 국소 투여에 적합한 본 발명의 제형은 상기 조성물의 구성분에 대해 용매, 운반체, 희석액 또는 유처리제(dispersant)로 혼합되며, 적합한 희석에서 피부의 표면에 구성분의 균일하게 적용하게 할 수 있다. 또한, 허용가능한 운반체는 피부로 조성물의 침투를 가능하게 할 수 있다.

프로시아니딘 조성물의 투약 형태(dosage form)는 선택된 투여 형태에 의해 결정된다. 이러한 투약 형태를 제조하는 실제 방법은 알려져 있거나, 또는 당업계의 숙련된 기술자에 의해 정할 것이다.

본 문헌의 방법에 의해 유도된 상기 프로시아니딘 조성물은 인간 또는 가축 포유동물에 그들의 세포에 효과적이도록 국소적, 경구, 정맥주사(intravenously), 근육내(intramuscularly), 복강내(intraperitoneally), 비강내(intranasally), 피부내(intradermally), 척수내(intrathecally), 및 피하(subcutaneously)로와 같은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여 및 투약 방법(dosage regimen)의 특이적 형식은 상세한 경우를 고려하여 당업계의 기술자에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 개체, 질환, 관련된 질환 단계 및 처리가 예방적인지). 치료는 매일 또는 한 달에 며칠에 걸쳐 화합물의 복수 투여, 또는 1년까지 포함할 수 있다.

이러한 조성물은 이러한 투여를 필요로 하는 개체에 투여량 및 의료, 영양 또는 수의업계의 당업자에 의해 알려진 기술로 특정 개체의 연령, 성, 무게 및 상태, 및 투여 경로와 같은 요인을 고려하여 투여될 수 있다.

치료용, 식품용, 화장료 및 가축 사용에 대한 조성물의 제조물, 투여량 및 투여는 당업계에 잘 알려져있다(예를 들면, U.S. Patent Nos. 5,554,645, 5,853,728, 6,194,020, 6,312,753, 6,998,417, 7,122,574, 7,314,634, 7,320,797 참조, 및 U.S. Patent Application Publication No. 2007/0148107, 이것은 본 발명에 참조로서 포함된다).

하기 실시예는 확실한 특정한 특징 및/또는 실시예를 설명하기 위해 제공된다. 이러한 실시예는 특정한 특징 또는 하기 실시예로 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 꽃 조직으로부터 테오브로마 카카오 캘러스 유도 및 분화

조밀한 캘러스 응집체는 [D+]-포도당([D+]-glucose)을 탄소원으로써 사용하여 조절된 조건 하에서 옥신(auxin) (2mg/L 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)(2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D))), 사이토카닌(cytokinin) (0.005 mg/L 디스디아주론(thisdiazuron)(TDZ)) 및 다른 첨가제(250mg/L L-글루타민(L-glutamine), 100mg/L 미오이노시톨(myo-inositol))로 강화된 최고 농도의 드라이버 및 쿠니유키 윌넛(Driver and Kuniyuki walnut (DKW)) 배지를 사용하여 만들었다(표 1의 배지 1). 배지는 pH 5.8을 맞춘 후에 오토클레이브(autoclave)로 멸균하였다. 미숙한 테오브로마 카카오 꽃 물질의 시료는 재배한 많은 식물에서 수집하였다. 배양의 오염을 막기 위해서, 상기 물질을 배양 배지에 도입하기에 앞서 표면 멸균하였다. 상기 물질은 첫째로 1 % (w/v) 소듐 하이포클로라이트(sodium hypochlorite)에 20 분 간 담구고 5 분 마다 부드럽게 교반하였다. 멸균 조건에서 상기 물질을 제거해서 멸균한 탈염수로 3 회 세척하였으며, 각 세척 동안 부드럽게 교반하였다. 최종 세척물을 제거하여 꽃봉오리(flower buds)만을 멸균한 페트리 플레이트(petri plates)에 옳겼다. 꽃봉오리는 멸균한 칼을 사용해서 기저에서부터 꽃의 1/3길이 위치를 횡단하여 절단하였다. 헛수술(staminodes), 꽃받침(sepal) 및 꽃잎 기저 절편(petal base explants)은 절단 말단의 개구부를 통해 추출하였다.

상기 추출한 물질은 고체 캘러스 유도 배지 위에 도말하였다. 약 50개의 조직을 각자 플레이트에 걸쳐 전체 표면에 분포하였다. 페트리 플레이트는 파라필름(parafilm)으로 봉하였으며 14 일 동안 25℃에서 어두운 곳에서 유지하였다. 10 일 후에 상당한 캘러스 형성을 확인하였다. 캘러스 유도 배지 위에 꽃 부분을 두고 14 일 내에, 캘러스는 절편으로부터 분리하였으며 외식표 1에 기재된 대로, 배지 I, II 및 III의 캘러스 분화 배지 상에 두었다. 4 주간의 간격 동안, 옅은 노랑색을 띄는 빠르게 자라는 세포주를 계대배양하여 선별하였다(도 1).

실시예 2. 식물 생장 관련 조직으로부터 테오브로마 카카오 캘러스 유도 및 분화

캘러스는 탄소원으로 포도당(20 g/L)을 사용하여 옥신(auxin)(2mg/L IAA 및 4 mg/L IBA), 사이토카닌(cytokinin)(0.005 mg/L TDZ), 및 L-글루타민(L-glutamine)(250 mg/L)을 첨가한 무라시게-스쿠그(MS) 배지에서 수립되었다(배지 XXVII, 표 1). 배지는 pH 5.8을 맞춘 후에 오토클레이브로 멸균하였다. 테오브로마 카카오 식물 물질(어린 및 성숙한 잎, 마디, 절간)의 시료는 다수의 온실 재배 식물에서 수집하였다. 배양의 오염을 막기 위해서, 상기 물질을 배양 배지에 도입하기에 앞서 표면 멸균하였다. 상기 물질은 첫째로 70 % 에탄올에 1 분간 담가둔 다음, 25 % 표백제에 10 분간 담구고 5 분 마다 부드럽게 교반하였다. 멸균 조건에서 상기 물질을 제거해서 멸균한 탈염수로 3 회 세척하였으며, 각 세척 동안 부드럽게 교반하였다. 잎은 5 mm 정사각형으로 마디 및 절간은 1 내지 2 mm 원통으로, 및 절편체는 고체 배지 포함 플레이트 위에 두었다. 플레이트는 25℃ 어두운 곳에서 유지하였다. 오염의 신호를 매일 관찰하였고, 오염된 물질은 제거하였다. 4주 후 캘러스 형성을 확인하였다. 6주 후에, 캘러스를 절편으로부터 분리하였고, 상기 기재한 캘러스 분화 배지 및 XXVII(표 1) 나타낸 배지에 두었다. 그러나, 개시 후에, 캘러스는 매우 빠르게 분화 및 확립되었다. 새로이 형성된 세포를 캘러스의 표면으로부터 분리하였고, 2 주 간격으로 새로운 배지에 계대배양(subculture)하였다. 연한 노랑 내지 밝은 갈색을 보이는 빠르게 자라는 세포주를 계대배양하여 선별하였다.

코코아 캘러스를 확립한 후에, 높은 옥신 함유량이 XXVII 배지에서 세포 생장을 지연시켰고, 순차적인 세대에서 스트레스를 받는 세포임을 나타내는 매우 갈색의 캘러스를 형성하였으므로, 캘러스의 지속가능성에 낮은 농도의 옥신의 영향을 시험하는 것이 필요했다. 세포 현탁 발생에서 배지 유지의 후속의 영향뿐 아니라 코코아 캘러스를 유지하는 그들의 능력을 위해 다양한 배지를 시험하였다. XXVII 배지는 포도당의 MS배지에 6 mg/L 의 옥신(2 mg/L IAA 및 4 mg/L IBA), 2X MS 비타민 및 250 mg/L 의 글루타민이 추가되고, 7 g/L 한천을 갖는다. 예를 들면, 배지 내의 옥신을 4 mg/L (2 mg/L IAA 및 2 mg/L IBA, 표 1의 배지 XXVIII) 및 2 mg/L IBA 형태의 옥신(표 1의 배지 XXIX)을 감소시켰다.

4 mg/L 으로 옥신을 감소시키는 것은 캘러스을 색을 진한 갈색 내지 밝은 갈색에서 노란색으로 개선하였다. 캘러스 세포 생장은 활발한 수준으로 되돌아 갔다. 세포 현탁 배양은 동일하게 배지 XXVII에서 계대배양한 건강한 캘러스로부터 확립한 것으로 확립하였다.

2 mg/L 옥신이 있는 배지에서 캘러스의 색은 변하였고, 세포 생장은 활발한 수준으로 되돌아 갔다. 그러나, 이러한 칼리(calli)는 동일한 배지로 계대배양하였을 때, 배지 XXVIII의 캘러스에 비해 캘러스 세포 생장이 감소하였다.

2 mg/L 옥신으로 감소시킨 후에, 생장에서 글루타민의 제거(표 1의 배지 XXXI)와 결합하는 추가적 MS 비타민의 제거 효과(표 1의 배지 XXX)를 기록하였다. 이러한 두 개 배지 유래의 캘러스는 배지 XXIX에서 캘러스 유래의 생장 특징에서 차이점을 보이지 않았다. 그러나, 프로시아니딘의 생산에 관해서 배지에서 추가적 비타민의 존재는 유익하다는 것에 주목하였다. 코코아 식물 캘러스를 유지하는데 가장 좋은 배지는 배지 XXVIII이고, 세포 현탁의 용이한 수립 및 프로시아니딘의 생산성 유지 뿐만 아니라, 캘러스의 장기간 지속가능성을 가능하게 한다.

실시예 3: 테오브로마 그랜디플로럼 ( Theobroma grandiflorum ) 및 테오브로마 오보바텀 ( Theobroma obovatum ) 캘러스 유도 및 증식

테오브로마 그랜드플로럼 및 테오브로마 오보바텀의 캘러스 배양을 테오브로마 코코아에 대한 실시예 1 및 2와 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 확립하였다.

실시예 4: 현탁 개시

세포 현탁 배양은 실시예 1에 기재한 꽃 절편으로부터 생장된 하얀색 새로운 칼리를 20개의 다른 종류의 액체 배지 25 ml을 포함하는 125 ml 삼각 플라스크(Erlenmeyer flasks)에 접종함으로써 확립하였다(표 1의 배지 IV 내지 XXIII). 플라스크는 실리콘 발포 고무 마개(foam caps)로 봉하였으며, 완전히 어두운 곳에서 54 일 간 24 ± 1℃로 온도가 조절된 방에서 회전 진탕과 함께 120 rpm으로 교반하였다. 계대배양은 필요에 따라 매주 또는 격주로 옮겼다. 과립 또는 좋은 세포 현탁을 형성한 배양은 유지하였지만, 현탁 배양을 형성하지 않은 배양은 제거하였다. 세포 생장 14일 후에, 새로운 25 ml의 배지가 포함된 새로운 125 ml 플라스크로 세포의 10 %(v/v)를 옮기고, 그 후 격주로 계대배양하였다. 배지 VIII는 현탁된 세포 개시에서 세포 증식에 가장 좋은 성과(14 일째에 45 %의 PCV)를 보였다.

비-꽃(식물생장과 관련된) 조직(혹, 절간, 어린 잎, 성숙한 잎)의 현탁액을 생장시키기 위해, 실시예 2에서 유도된 칼리(calli)를 기재된 꽃 절편과 유사한 방법으로 액체 배지에 옮겼다. 사용된 배지는 염의 유형(DKW 염 보다 MS 염이고, 이는 더 많은 암모늄(ammonium) 및 질소원, 및 더 낮은 황산염(sulfate)을 포함한다)에 관하여 조절 유지 배지 VIII와 다른 배지 XXIV이며, 2,4-D 대신에 옥신으로서 2 mg/L IAA 및 4 mg/L IBA 및 강한 MS 비타민을 포함하였다(표 1). 이 배지는 식물 생장 조직을 개시한 고체 배지와 유사하나, 겔화(gelling) 첨가제인 한천을 포함하지 않는 배지 XXVIII이다. 배지 VIII에서 칼리를 개시하고 전체 탄수화물원을 소비하는 데에 대개 2 내지 3 주가 소요된 것에 반해, 이 배지에서, 현탁 배양은 빠르게 수행었으며 칼리는 7 일 만에 배지 내의 모든 당을 소비하였다. 비-꽃 조직의 수립된 이 현탁액의 프로시아니딘 생산성은 또한 꽃 조직으로부터 생장한 현탁액보다 높았다(1.1 g 전체 프로시아니딘/배양액 L) (도 2A 내지 2B).

실시예 5. 세포 생장, 세포 선택 및 꽃 조직-유래 현탁세포 배양의 배지 최적화

본 실시예는 현탁액의 세포 생장을 증가시키기 위해 사용한 방법을 설명한다.

세포 배양 생산성은 세포 생장율의 기능 및 세포 생장 정지의 밀도에 따라 증가한다. 최적화 접종 밀도를 결정하기 위해, 테오브로마 카카오 세포의 현탁 배양을 10, 15 및 20 % (v/v) 의 초기 세포 밀도에서 시작하였고, 14 일 동안 생장하였다. 도 3는 접종 밀도의 기능에 따라 생물량 밀도의 전형적인 시간 추이를 보여준다. 10 %의 세포 밀도로 개시된 배양은 생장이 현저히 지체됐으며, 14 일 안에 최대 밀도에 도달하지 않았다. 배지VIII에서 15 % 및 20 %의 세포 밀도로 개시된 배양은 13 일 안에 밀도의 두 배가 되었으며, 14 일 이내에 40 - 43 %의 최대 평균 세포 밀도에 도달하였다. 하지만, 어떤 배양은 세포 선별 과정 후 14 일에 60 % 이상 압축 세포 용적(PCV)을 보였다.

배지 VIII 및 배지 I는 배지 VIII가 피타젤(Phytagel)을 포함하지 않는 것을 제외하고 동일한 방법이다. 모든 배지는 배지 구성물의 배치 간 변수를 유도할 수 있는 몇몇의 저장 용액을 사용하여 준비된 DKW 염 및 비타민에 기반하였다. 따라서, 배지 XXXII를 전혼합된 DKW 기본 염(Phytotechnology Laboratories, LLC, Catalogue # D190)을 사용하여 만들으며, 배지 VIII 및 배지 XXXII 사이의 현탁 세포 생장을 비교하였다. 두 배지에서 세포의 생장에서 현저한 차이점은 없었다. 따라서, 배지 XXXII는 꽃 조직 유래 현탁 배양의 유지에 관례적으로 사용하였다.

생물량의 증가, 당의 소비, 및 프로시아니딘의 생산성은 배양의 매 7 일마다 측정하였다. 이 결과는 바람직한 세포 선택 과정에서 매우 중요하다. 잘-생장하는 세포는 PCV 및 당 소비 수치를 기반하여 우선적으로 선택하였으며, 및 잘-생산하는 세포주는 그 후 프로시아니딘 생산 수율을 기반하여 잘-생장하는 세포주 사이에서 선택하였다. 높은 생물량 및 높은 프로시아니딘 생산 수율은 배치 순환(cycle)의 생산성을 증가시킬 수 있다. 세포 선별 과정 이전의 평균 프로시아니딘 생산성은 52 mg 프로시아니딘/배양액 L였으나, 세포 선별 과정의 1 년 후 251 mg/L의 수준으로 향상되었으며, 가장 높은 수준의 달성은 배양액 1 리터 당 1.6 mg 프로사아니딘이었다. 또한, 가장 높은 생산 수율은 5.0 g/ PCV L를 넘도록 증가하였다.

배지 XXV는 B5 주요염 및 MS 부가염을 사용하여 개발하였고, 따라서 배지의 암모늄 이온(ammonium ions)의 농도 감소를 보통 유지 배지인 배지 VIII와 비교하였다. 탄수화물원은 60 g/L 설탕(sucrose)였으며 호르몬은 2 mg/L 2,4-D 및 0.005 mg/L TDZ와 비교하여 0.1 mg/L NAA 및 0.2 mg/L 키네틴(kinetin)이었다. 2 주의 공정 후에, 배지 XXV에서 시험한 현탁액은 생장을 보이지 않았으나, 프로시아니진은 컨트롤 배지 VIII보다 4 배 높은 수준으로 현탁액에 축적되었다(22 mg/L인Medium VIII와 비교하였을 때, 배지 XXV는 95 mg/L를 넘었다). 이것은 옥신과 비교하였을 때, 사이토키닌(cytokinin)의 과잉과 관련하여, 배지 내의 질산염(nitrate)/암모늄 이온의 높은 비율에 기인할 수 있다.

배지 XXVI은 MS 염, 30 g/L 설탕, 및 1.5 mg/L의 2,4-D를 첨가하여 만들었다. 배지 내에서 현탁 배양 이동은 컨트롤 배지 VIII에서 13 일째에 4 배 높은 수준의 프로시아니딘의 더 높은 축적을 보였다(22 mg/L인 배지 VIII와 비교하였을 때, 배지 XXVI는 87mg/L). 세포 생장은 두 배지 사이에서 상대적으로 유사하였으나(60 % PCV내지 25 % PCV인 배지 XXVI와 비교하였을 때, 배지 VIII는 61 % PCV 내지 22 % PCV), 세포가 단백질을 탄수화물원으로서 선호하는 것을 보이는 당의 소비는 다르다.

유사한 조사를 테오브로마 그랜디플로럼(Theobroma grandiflorum) 및 테오브로마 오보바텀(Theobroma obovatum)으로 수행하였다. 세포 배양 생산성은 세포 생장 정지시 세포 생장률 및 밀도에 따라 증가하였다. 최적 접종 밀도를 결정하기 위해, 테오브로마 그랜디플로럼 및 테오브로마 오보바텀 세포의 현탁 배양을 10, 15 및 20 % (v/v) 의 초기 세포 밀도로 개시하였고, 14 일 동안 생장하였다.

일반적으로, 배양을 짧은 생장기간을 가지거나 또는 최대 세포 밀도가 더 이르게 도달하는 높은 밀도로 개시하였다. 10 %의 세포 밀도로 개시된 배양은 생장에서 현저한 지체를 보이고, 14일 이내에 최대 밀도에 도달하지 않았다. 15 % 및 20 %의 세포 밀도로 개시된 배양은 13 일 이내에 두 배의 밀도가 되었으며, 14 일 이내에 40 - 43 %의 최대 세포 밀도에 도달하였다. 이 생장률은 기존에 보고된 타서스 속(Taxus sp)과 같은 다른 식물 세포 현탁 배양에 비해 느리다. 하지만, 테오브로마 세포 배양의 세포 생장은 하기 실시예 6에 기재된 추가적인 생장 배지 및 엄격한 세포 선별의 최적화로서 증가할 수 있다.

실시예 6. 세포 생장, 세포 선택 및 식물 생장 관련 조직-유래 현탁세포 배양의 배지 최적화

생물량의 증가, 당의 소비, 및 프로시아니딘의 생산성은 배양의 매 7 일마다 측정하였다. 이 결과는 바람직한 세포 선택 과정에서 매우 중요하다. 잘-생장하는 세포는 PCV 및 당 소비 수치를 기반하여 우선적으로 선택하였으며, 및 잘-생산하는 세포주는 그 후 프로시아니딘 생산 수율을 기반하여 잘-생장하는 세포주 사이에서 선택하였다. 높은 생물량 및 높은 프로시아니딘 생산 수율은 배치 순환(cycle)의 생산성을 증가시킬 수 있다. 새로이 만들어지는 세포 현탁 배양은 대개 세포의 이종(heterogeneous) 혼합물이다. 이 이질성은 대규모 현탁 배양에서 균형적이지 않은 세포 생장 및 바람직한 대사 산물의 불안정한 생산 양식을 유도한다. 대규모 생산에 적합한 동일한(homogeneous) 세포 배양은 이러한 이종 혼합물로부터 유래될 수 있다. 폴리페놀 및 이 과정을 보조하는 세포의 생장을 검출하기 위해 선별적이고 빠른 스크리닝을 개발하였다. 실시예 8에 기재된 부탄올-HCl(butanol-HCl) 가수분해 방법을 폴리페놀 축적을 확인하기 위해 사용하였으며, 압축세포용적(PCV(%) = 세포 부피 × 100/전체 배양 부피)를 생물량 기준으로 적용하였다. 탄수화물 소비율은 세포 대사를 기준으로 굴절률(refractive index)(Brix%)로 측정하였다.

식물생장과 관련된 조직(혹) 유래 현탁 배양은 실시예 2 및 4에 기재된 칼리로부터 유래하였다. 하나의 잘 생장하는 세포주(MX1440-3496)를 선별하였고, 기본 배지(DKW 염 대 MS 배지) 종류 및 호르몬의 양 및 종류가 다양한 세 가지 다른 배지에서 생장하였다(표 1의 배지 XXXII, XXXIII 및 XXXIV). 배지 XXXII 및 배지 XXXIV에서 압축세포용적(PCV)은 7 일 째에 33.7 ± 4.7 % 및 25.7 ± 4.0 % 였으며, 이는 배지 XXXIII(47.6 ± 6.6 %) 보다 느리게 생장하는 것을 보였다. 세포 생장률은 세포 배양 과정에서 부피적 생산성 최대화에 상당히 중요하다. 또한 배지 XXXIII는 소비된 배지의 굴절률(RI)로 측정된 탄수화물 소비율이 우수했다. 배지 XXXIII 내 초기 포도당 농도(2 %)는, MX1440-3496 세포주의 포도당 소비율이 지수 생장 단계 후기로 돌입함에 따라 3 %로 맞추었다. 따라서, MX1440-3496 세포주의 추가적인 세포 선별 과정에 대한 유지 배지로서 배지 XXXV를 선택하였다.

크거나(clumpy) 덩어리 세포 응집체의 선별은 낮은 배양 성과를 유도하기 때문에, 크거나 덩어리 또는 응집체를 형성하지 않는 잘-생장하는, 순도 높은(fine) 세포는 용적 생산량을 증가시키고 응집된 세포를 제거하기 위해 각 계대배양 시간에 바람직하게 선별하였다. 따라서, 선별된 세포는 주로 노산-색의 순도 높은 세포 형태를 가지며, 순도 높은 현탁 배양은 더 나은 생장 및 동일한 현탁 배양의 생산을 유도한다. MX1440-3496 세포주는 15 일 동안 분열 시간(doubing time)으로 생장하였으나, 분열 시간은 실행가능한 10 일 감소하는 것을 보였다(도 3). 전체 프로시아니딘 생산 수준은 세포 선별 과정 전에 초기에 0.5 g/L PCV 였으나, 세포 선별 과정과 함께 8.9 배(4.7 g/L PCV)로 증가하였다(도 4).

실시예 7: 테오브로마 캘러스 배양 및 현탁 배양 유래 폴리페놀의 추출

본 실시예는 실시예 1 - 4에서 개발된 테오브로마의 캘러스 및 배양의 현탁 세포로부터 폴리페놀을 추출하기 위해 개발된 방법을 설명한다. 이 실시예의 실험은 구체적으로 테오브로마 카카오의 배양을 사용하였다. 폴리페놀을 0.1 % H₂SO₄을 포함하는 1.5 ml 50 % (v/v) 에탄올(ethanol)과 함께 약 0.25±0.04 g 신선한 칼리의 무게 및 0.1 % H₂SO₄을 포함하는 1.5 ml 80 % (v/v) 메탄올(methanol)과 함께 0.1±0.003 g 현탁된 세포의 건조 무게(상층액 배지가 없는)로부터 추출하였다. 세포는 미세원심분리 튜브(2.0 ml)에 두었고, 1 분 동안 비드 밀(bead mill) 균질기로 균질화하였다. 상기 균질체(homogenate)를 3500 rpm 에서 20 분 동안 원심분리하였고, 상층액만을 다른 미세원심분리 튜브로 옮겼다.

선별되기 위해 많은 수의 현탁된 세포 배양이 필요할 때, 하기와 같은 더욱 높은 처리량 방법을 사용하였다: 분석되는 세포 배양의 각 플라스크로부터, 96-깊은 웰 플레이트로 1ml을 분주하였다. 96-깊은 웰 플레이트로 옮기기 전에 시료의 압축세포용적를 기록하였다. 각 웰의 세포는 원심분리기에서6000 rpm에서 4분 동안 원심분리함으로써 펠렛(pellet)화하였다. 각 웰로부터 상기 상층액을 제거하였고, 플라스틱 이동 파이펫(pipet)으로 제거하였다. 다음으로, 추출 용액(80:20 메탄올:물)의 0.5 mL 및 텅스텐(tungsten) 카비드(carbide) 비드(bead)를 각 웰에 더하고,고, 세포를 15 Hz 에서 2 분 동안 갈기 위해 상기 플레이트를 Mixer Mill 에 두었다. 그 후, 상기 플레이트는 원심분리기로 옮겼고, 세포 잔해는 6000 rpm 에서 4 분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다.

실시예 8: 배양 내 폴리페놀 생산의 예비 분석

프로시아니딘 분석 반응을 수행하기 위해 사용된 방법은 원래 Swain 및 Hillis (J. SCI. Food Agric. 10:63, 1959) 방법 및 Porter et al . (Phytochemistry, 25(1):223, 1986) 방법에 매우 근접하여 비슷하게 만들어졌다. 부탄올-HCl 추출 분석은 테오트로마 카카오 현탁된 세포의 추출물에서 폴리페놀을 측정하기 위해 사용하였다. 폴리페놀을 메탄올 수용액 추출물 0.1 ml 및 부탄올-HCl 시약(95:5 v/v) 1.0 ml을 혼합하고, 용액을 퀴아젠 깊은 웰 블럭(Qiagen deep well block)(Valencia, CA, USA)에서 75℃에서 60 분 동안 가열함으로써 (-)-에피카테킨((-)-epicatechin) 단량체(monomers) 및 시아니딘(cyanidin)으로 가수분해하였으며 가수분해된 시료 내 시아니딘의 존재는 분홍색의 형태로 나타난다. 흡광도(absorbance)는 280 및 520 nm에서 확인하였으며, 프로시아니딘 함유량은 Chromadex, Inc. (Irvine, CA)에서 구입한 프로시아니딘 B2(procyanidin B2)의 다른 농도를 사용하여 보정곡선(calibration curve)을 사용하여 형성된 시아니딘의 양에 기초하여 계산하였다. 더 밝은 분홍색은 현탁 배양의 더 높은 프로시아니딘의 양을 나타낸다(도 5A). 본 방법에 기초한 몇몇의 현탁 배양의 프로시아니딘의 양의 범위는 250 mg/L 내지 1000 mg/L이다.

실시예 9. 세포 선택 및 꽃 조직-유래 현탁 세포 배양의 배지 최적화

생물량의 증가, 당의 소비, 및 프로시아니딘의 생산성은 배양의 매 7 일마다 측정하였다. 이 결과는 바람직한 세포 선택 과정에서 매우 중요하다. 잘-생장하는 세포는 PCV 및 당 소비 수치를 기반하여 우선적으로 선택하였으며, 및 잘-생산하는 세포주는 그 후 프로시아니딘 생산 수율을 기반하여 잘-생장하는 세포주 사이에서 선택하였다. 높은 생물량 및 높은 프로시아니딘 생산 수율은 배치 순환(cycle)의 생산성을 증가시킬 수 있다. 세포 선별 과정 이전의 평균 프로시아니딘 생산성은 52 mg 프로시아니딘/배양액 L였으나, 세포 선별 과정의 1 년 후 251 mg/L의 수준으로 향상되었으며, 가장 높은 수준의 달성은 배양액 1 리터 당 1600 mg 프로사아니딘이었다. 또한, 가장 높은 생산 수율은 5000 mg/ PCV L를 넘도록 증가하였다.

배지 XXV는 B5 주요염 및 MS 부가염을 사용하여 개발하였고, 따라서 배지의 암모늄 이온(ammonium ions)의 농도 감소를 보통 유지 배지인 배지 VIII와 비교하였다. 탄수화물원은 60 g/L 설탕(sucrose)였으며 호르몬은 2 mg/L 2,4-D 및 0.005 mg/L TDZ와 비교하여 0.1 mg/L NAA 및 0.2 mg/L 키네틴(kinetin)이었다. 2 주의 공정 후에, 배지 XXV에서 시험한 현탁액은 생장을 보이지 않았으나, 프로시아니진은 컨트롤 배지 VIII보다 4 배 높은 수준으로 현탁액에 축적되었다(22 mg/L인Medium VIII와 비교하였을 때, 배지 XXV는 95 mg/L를 넘었다). 이것은 옥신과 비교하였을 때, 사이토키닌(cytokinin)의 과잉과 관련하여, 배지 내의 질산염(nitrate)/암모늄 이온의 높은 비율에 기인할 수 있다.

배지 XXVI은 MS 염, 30 g/L 설탕, 및 1.5 mg/L의 2,4-D를 첨가하여 만들었다. 배지 내에서 현탁 배양 이동은 컨트롤 배지 VIII에서 13 일째에 4 배 높은 수준의 프로시아니딘의 더 높은 축적을 보였다(22 mg/L인 배지 VIII와 비교하였을 때, 배지 XXVI는 87mg/L). 세포 생장은 두 배지 사이에서 상대적으로 유사하였으나(60 % PCV내지 25 % PCV인 배지 XXVI와 비교하였을 때, 배지 VIII는 61 % PCV 내지 22 % PCV), 세포가 단백질을 탄수화물원으로서 선호하는 것을 보이는 당의 소비는 다르다(도면 2E).

실시예 10: 생산성 향상을 위한 포도당 첨가

본 실시예는 포도당의 보충적인 첨가를 통해 카카오 현탁 배양의 프로시아니딘 생산성의 증가를 위한 프로토콜의 개발을 설명한다.

식물 2차 대사 산물은 생장 배지부터 생산 배지까지 배지를 변화함으로써 유도할 수 있다. 배지 최적화를 위해, 탄소원 또는 질소원은 모두 중요한 요인이다. 포도당 형태의 추가적 탄수화물을 꽃 및 식물 생장 관련 조직 유래 현탁 배양으로부터 프로시아니딘 생산을 증가시키기 위해 지수 생장 단계의 말기에 이용할 수 있다.

프로시아니딘 생산성의 현저한 개선을 포도당 첨가에 의해 꽃 조직-유래 현탁 세포주 (MX1241-58)로부터 얻었다. 7일 동안, 배양은 실시예 5에 기재된 정상 배양 조건 하에 정상적으로 XXXII 배지에 유지하였다. MX1241-58 세포 배양은 포도당 첨가 전 7 일 째에 수집하였으며, 평균적으로 이것의 PCV 및 RI는 49.5±3.5 % 및 0.2 이었다.

상기 평균 프로시아니딘 생산 수준은 189.5±17.7 mg/L PCV 이었다. 7일 째에, 50 % 포도당 저장 용액 5 ml을 RI를 3 % 이상 조정하여 상기 현탁 배양에 첨가하였고, 그 후 배지의 포도당 농도가 0.5 % 이하인 경우 반복하였다. 포도당 첨가 후에, 플라스크 안의 배양을 현탁물 안의 농축된 포도당을 분산시키기 위해 약 10 초 동안 손으로 힘차게 흔들었고, RI를 다시 측정하였을 때 평균적으로 3이었다. 다른 배양 일(7, 11, 16 및 21에)에 3-4회 포도당 첨가 및 한 번에 신선한 배지 첨가(25 일)하여, 프로시아니딘 생산 수준은 4.4 g/L PCV 까지 증가하였고, 이는 이것의 초기 값 보다 24배 더 높았으며, PCV 는 49.5±3.5% 부터 69.0±1.4% 까지 증가하였다.

이것의 생산 수준을 개선하기 위해 유사한 처리를 세포주 MX1440-3496 (실시예 6에 기재된)에 적용하였다. 이 실험은 포도당 첨가에 대한 세포주의 반응을 시험하기 위해 만들었다. MX1440-4496 세포주는 실시예 6에 기재된 배지 XXXIII에서 유지하였다. 6 일째에, MX1440-3496 세포주의 6개 플라스크를 무작위적으로 선택하였고, 각 3 개의 플라스크씩 2 세트를 분류하였다. 3개의 플라스크 한 세트에 50 % 포도당 저장 용액을 처리하였고, 다른 3개 플라스크는 처리하지 않고 남겼다. 6 일 째에 모든 6개의 플라스크에 대해 포도당 첨가에 앞선 측정은 평균적으로 45% PCV, 0.3±0.1 RI, 2.41±0.19 g/L PCV 프로시아니딘 생산이었다. 5 mL 50% 포도당 저장 용액을 처리된 프라스크 세 개에 첨가하였다. 포도당 첨가 후에 처리된 플라스크의 RI는 6.0±1.1 로 증가하였고 평균 PCV는 39.7±0.6% 이었다.

플라스크를 수집하여 포도당 첨가 후 1, 3, 4, 5 및 6일에서 그들의 PCV, RI 및 프로시아니딘 생산을 측정하였다. 처리되지 않은 플라스크는 현저한 RI 변화를 보이지 않았고, 45 %부터 53±3.6%까지 PCV의 경미한 증가를 보였다. 그들의 생산은 처리 후 6 일째에 2.83±1.17 g/L PCV에 머물렀다. 이와 대조적으로, 상기 처리된 플라스크는 6 일째에 지속적으로 증가하는 PCV에서 53±2.7%로 증가를 보였다. RI는 현저히 0 일째에 6±1.1부터 6 일째에 2.0±1.3까지 이어지는 일(day) 당 0.6 내지 0.8 단위로 떨어졌다. 또한, 그동안에 그들의 생산은 5 일째에 포도당 첨가 전에 2.42±1.93 g/L PCV에서 12.93±2.24 g/L로 증가하였다. 포도당 처리는 증가한 프로시아니딘 생산 및 도 5A에서 나타낸 바와 같이 프로시아니딘 생산에 대한 세포 배양 과정을 위한 현저한 개선을 나타내는 이러한 생산 특징을 유도한다.

또한, 3 %, 5 %, 및 6 %의 포도당을 첨가한 MX1440-3496 세포 균주로부터 향상된 프로시아니딘 생산량을 얻었다. 본 실험은 포도당 첨가에 따른 세포주를 실험하도록 만들었다. MX1440-3496 균주는 실시예 6에 기재한 것과 같이, 배지 XXXV에 유지하였다. 4 일째, MX1440-3496 세포 균주의 플라스크 12 개를 임의적으로 선택하여 세 개씩 4 세트로 나누었다. 세 세트는 다양한 농도(배지 부피의 3 %, 5 %, 및 6 %)의 포도당을 첨가하였으며 네 번째 세트에는 전혀 첨가하지 않았다. 각각의 플라스크에서 포도당의 농도는 각각 RI가 3, 5 및 6일 때 굴절계(refractometer)를 사용하여 확인하였다.

4 일째에 모든 6 개의 플라스크에 대해 포도당 첨가에 앞선 측정은 평균적으로 45 % PCV, 0.7±0.1 RI, 13.5±1.0 g/L PCV 프로시아니딘 생산이었다. 플라스크를 수집하여 포도당 첨가 후 3, 6, 8 및 9 일째에 그들의 PCV, RI 및 프로시아니딘 생산을 측정하였다. 처리되지 않은 플라스크는 현저한 RI 변화를 보이지 않았고, PCV의 경미한 증가를 모였다. 그들의 생산은 처리 후 9 일째에 12.8 ± 3.1 g/L PCV에 머물렀다. 이와 대조적으로, 처리된 플라스크는 RI가 일(day) 당 0.7 단위로 현저히 떨어져 9 일째에 0.07 ± 1.3까지 감소하는 것을 보였다. 또한, 그들의 생산은 지속적으로 상승하여 구체적으로 6 %로 처리한 세트는 포도당 첨가 전 13.5 ± 1.0 g/L PCV에서부터 처리 9 일째에 40.6 ± 4.12 g/L PCV로 유의적인 상승을 보였다. 포도당의 첨가는 상승한 프로시아니딘 생산을 가져오며 포도당 처리는 증가된 프로시아니딘 생산 및 도 5A에서 나타낸 바와 같이 프로시아니딘 생산에 대한 세포 배양 과정을 위한 현저한 개선을 나타내는 이러한 생산 특징을 유도한다.

현탁 배양에서 프로시아니딘 생산을 상승시키는 다른 방법은 도출하여 반복하였다. 7 일 및 13 일에, 포도당을 첨가하였으며 그들의 RI는 6 % 브릭스(Brix)까지 상승하였다. 반복된 도출은 현탁 세포가 프로시아니딘 화합물을 지속적으로 생산하도록 하였다. 첫 번째 도출 전에, 프로시아니딘 생산은 3.2 ± 0.1 g/L PCV였으나, 13 일에 13.6 ± 1.3 g/L PCV 및 20 일에 29.5 ± 2.8 g/L PCV로 상승하였다. 포도당의 반복된 첨가는 포도당의 첨가를 화살표로 표시한 도면 6에서 보이는 바대로, 코코아 현탁 세포 배양을 통한 상승된 프로시아니딘 생산에 관한 단순하고 효과적인 방법을 제공한다.

매 계대배양시 반복된 세포 선별은 잘-생장하며 잘-생산하는 균주를 모으며 그 후 배지 XXXV에서 3 %의 초기 포도당 농도를 4 내지 5 일부터 제한하기에 알맞다. 이는 세포에게 매우 심각한 스트레스를 제공하며 그들은 현탁 배양에서 더욱 응집되기 시작한다. 전형적인 응집은 대규모 생산 시스템으로 규모를 상승하는 과정에서 장애(hindrance)가 된다. 따라서, 3 %의 초기 포도당 농도는 탄수화물 제한으로부터 어떠한 스트레스도 주기 않기 위해서 4 %(배지 XXXVII)까지 상승한다. 4 %의 포도당 농도는 생물반응기 배양뿐 아니라 플라스크 현탁 배양에서 응집 현상 없이 세포주가 더욱 안정적으로 유지될 수 있도록 한다.

실시예 11. 무호르몬 배지 내 세포의 회수 및 유도

본 실시예는 2 주 동안 호르몬을 함유하지 않는 배지에서 세포의 생장 및 프로시아니딘의 생산을 설명한다. 실시예 2 및 4의 방법으로 생산된 세포는 2 주 동안 배지 XXXVI에서 배양하였다(표 1). 이 배지는 기본 배지, 배지 XXXV에 더하여 호르몬을 아지지 않는다(표 1). 초기 접종은 25 %로 설정하였다. 세포는 7 일 동안 호르몬이 없는 배지에서 생장하였으며 7 일 이전에 다른 무호르몬 배지로 두 번째 계대배양을 하였다. 생장 및 생산 결과는 신선한 배지로 옮기고 6 일째에 기록하였다. 세포의 생장은 45 내지 50 %에서 35 내지 40 %로 10 내지 15 %가 감소한 것으로 보인다. 그러나, PCV 1 리터당 생산은 컨트롤 세포에 비교하여 2.5 내지 3 배 증가하였다. 전체 부피적 생산은 컨트롤 세포의 ~ 2 내지 2.5 배였다. 이는 도면 7A에 나타난 대로 배지로부터 호르몬의 제거 이후 생산성이 유지되는 능력을 보인다. 이는 조절적 관점(standpoint)에서 생산의 마지막 주부터 호르몬을 제거하는 것이 유효한 효과인 공정의 측면에서 효과적인 결과이다.

포도당 유도와 함께 무호르몬 배지에서 생장하는 세포의 상승효과 가능성을 실험하였다. 세포는 무호르몬 배지 TC3015에서 1 주 간 생장하였다. 배양 7 일째에, 컨트롤 및 처리 세포 모두는 초기 3.0에서부터 0 내지 0.6의 RI를 가졌다. 이 시점에서, 세포는 6 % 포도당을 첨가하고 추가로 7 일 동안 생장하도록 하였다. 시료는 유도 후 0 및 7 일째에 얻었다. 호르몬 제거 및 포도당 유도에서 추가적인 효과가 있음을 보였다. PCV 1 리터당 생산은 유도제를 처리한 컨트롤 세포에서 ~ 2.5 배 상승한 반면에 무호르몬 배지 및 유도제(예를 들면, 포도당)의 첨가를 모두 처리한 세포에서 배수가 ~ 4 배였다. 호르몬의 제거는 거의 2 배로 생산이 상승하였으며 그 후 이 세포를 유도한 후 추가로 2 배 더 상승하였으므로, 두 가지 처리를 함께한 유의적인 부가적 효과를 가진다(도면 7B).

실시예 12. 신선한 코코아 세포 또는 갈린 동결건조 세포로부터 폴리페놀의 소규모 추출

배지를 가지지 않는 코코아 세포(0.5 mL) 또는 50 mg의 갈린 코코아 세포는 Qiagen, Inc의 96 웰 블럭(96 well block) 내의 2.0 ml의 마이크로-튜브(micro-tubes) 또는 1.2 ml 튜브에 모았다(sampled). 산성(0 내지 2 %의 구연산(citric), 아세틱(acetic) 또는 아스코르빅(ascorbic)) 수용액 추출 용매(30 내지 80 %의 아세톤, 에탄올, 메탄올)의 적절한 부피를 코코아 세포에 각각 첨가하며 그 후 추출된 프로시아니딘을 초음파분쇄기(ultrasonicator) 및 비드밀(BeadMill)에 두었다. 시료는 4 분 동안 6000 rpm에서 원심분리하였다(RCF 5996). 상층액은 0.45 ㎛의 멤브레인 필터(membrane filter)에서 여과할 수 있으며 분석 전에 동일한 추출 용매 수용액을 사용하여 10 배로(만일 필요하다면) 희석할 수 있다. 잔여 추출물은 추가적인 분석을 위해 -20℃ 냉동고에서 보관하였다. 도면 12는 다양한 용매 시스템의 결과를 나타낸다.

실시예 13. 테으브로마 카카오 캘러스 및 현탁 세포 유래의 폴리페놀 분석

프로시아니딘 분석 반응을 수행하기 위해 사용된 방법은 원래 Swain 및 Hillis (J. SCI. Food Agric. 10:63, 1959) 방법 및 Porter et al. (Phytochemistry, 25(1):223, 1986) 방법에 매우 근접하여 비슷하게 만들어졌다. 부탄올-HCl 가수분해는 테오트로마 카카오 현탁된 세포의 추출물에서 프로시아니딘을 측정하기 위해 사용하였다. 프로시아니딘을 에탄올, 메탄올 또는 아세톤 수용액 추출물 0.1 ml 및 부탄올-HCl 시약(95:5 v/v) 1.0 ml에 혼합하고, 용액을 퀴아젠 깊은 웰 블럭(Valencia, CA, USA)에서 75℃에서 60 분 동안 가열함으로써 (-)-에피카테킨단량체 및 시아니딘으로 가수분해하였다. 가수분해된 시료 내 시아니딘의 존재는 빨간색의 형태로 나타난다. 흡광도(absorbance)는 280 및 520 nm에서 확인하였으며, 프로시아니딘 함유량은 Chromadex, Inc. (Irvine, CA)에서 구입한 프로시아니딘 B2의 다른 농도를 사용하여 보정곡선을 사용하여 형성된 시아니딘의 양에 기초하여 계산하였다. 더 어두운 빨간색은 현탁 배양의 더 높은 프로시아니딘의 양을 나타낸다(도 8A 내지 8C).

LC 분석을 물(Milford, Massachusetts, USA)을 이용하여 수행하였다 연합 HPLC 시스템은 CTC 해석 PAL 오토샘플러(autosampler)(Leap Technologies, Carrboro, NC, USA), 600S 조절장치로 물이 공급되는 Waters 626 및 190 내지 780 nm로 스캐닝(scanning)하는 Waters 2996 포토다이오드-어레이 검출기(photodiode-array detector, PDA)로 장비를 갖췄다. 구배 용리(Gradient elution)를 물-0.1 % 포름산(formic acid)(용액 A) 및 아세토니트릴(acetonitrile)-0.1 % 포름산(용액B)과 함께 분당 0.3 ml의 지속적인 흐름 속도에서 수행하였다. 용액 B의 하기 비율과 함께 직선 경사도를 적용하였다(t(분), %B): (0, 7), (5, 15), (20, 75), (25, 100), (35, 100), (35.1, 7) (45, 7). 컬럼은 Ultra Aqueous C18 column (100 x 2.1 mm i.d., 3.5 ?) (Restek, Bellefonte, PA. USA)이다. (+)-카테킨((+)-catechin), (-)-에피카테킨, 및 프로시아니딘(이량체 내지 육량체(hexamer))의 단량체를 280 nm에서 확인하였다. Waters Quattro Micro 3부로 된-4중극(triplequadrupole) 질량 탐지기(mass detector)(Milford, Massachusetts, USA)를 MS 데이터를 수득하기 위해 사용하였으며 MassLynx™ software를 사용하여 분석하였다. m/z 150 부터 1800 까지 스캐닝하여 완전한 정밀검사 데이터 습득을 수행하였다. 카테킨, 에피카테킨에 대한 확실한 표준을 Chromadex. Inc (Irvine, CA)에서 구입하였고, 희석하여 대사 산물을 검출 및 정량하기 위해 새로운 보정곡선을 만들었다.(도면 9A 내지 9C).

세포 추출물의 전체 폴리페놀 함유량은 폴린-시오칼토 반응(Folin-Ciocalteau assay)를 사용하여 측정하였다(waterhouse.ucdavis.edu/phenol/folinmicro website; and Slinkard, K.; Singleton,V.L. Total Phenol Analysis:Automation and Comparison with Manual Methods. American Journal of Enology and Viticulture 1977, 28: 49-55). 실시예 #9에 기재된, 세포 배양 추출물은 20 ㎕의 추출물을 얻어 폴린-시오칼토 시약 100 ㎕를 물 1.58 ml에 더하여 첨가하여 전체 폴리페놀 함유량을 분석하였다. 반응은 300 ㎕ 탄산 나트륨(sodium carbonate) 용액을 첨가하여 정지하였다. 결과 용액은 765 nm에서 측정하였으며 세포 추출물 내 전체 폴리페놀의 농도를 결정하기 위해 같은 반응으로 분석하였던 다양하게 희석된 갈릭산(gallic acid) 용액의 보정곡선과 비교하였다.

정량할 수 있는 프로시아니딘의 HPLC 분석은 Waters 2795 분리 모듈(separation module), Waters 996 PDA 탐지기 및 Waters 474 스캐닝 형광 탐지기(scanning fluorescence detector)로 구성된 정상 HPLC시스템으로 수행하였다. 코코아 세포 추출물의 프로시아니딘의 특정화 및 분리 조건을 Kelm et al . (U.S. Pat. Appl. No. 2007075020)에 조정된 Develosil Diol 컬럼(column) (250×4.6 mm ID, 5 μ 입자 크기), 분리 동안의 분석의 향상된 과정, 및 극성 단량체 및/또는 저중합체의 분리(U.S. Pat. No. 0075020)를 이용하여 얻었다. 두 부분으로 이뤄진 이동 상은 용매(A), 아세토니트릴(acetonitrile):아세트산(acetic acid)(98:2, v/v) 및 용매(B), 메탄올:물:아세트산(95:3:2, v/v/v)로 구성된다. 직선 구배 용리는 하기와 같이 0.8 mL/분 유속으로 30℃에서 수행하였다: 0 내지 35 분, 100 내지 60 % A; 35 내지 40 분, 60 % A; 40 내지 45 분, 60 내지 100 % A. 저중합체 프로시아니딘의 분리는 형광 탐지(276 nm에서 자극 파장, 316 nm에서 배출 파장), 280 nm에서 UV탐지로 확인하였다(도면 10A). (Lazarus et al. J. Agric. Food Chem. 47 (1999), 3693) 및 PDA(도면 10B).

분석 방법의 목적은 신선한 코코아 세포 또는 동결-건조 세포에서 10 개의 다른 개별적 프로시아니딘의 정량화이다. 정량 가능한 프로시아니딘은 단량체, 이량체(dimmers), 삼량체(trimers), 사량체(tetramers), 오량체(pentamers), 육량체(hexamers), 칠량체(heptamers), 팔량체(octamers), 구량체(nonamers) 및 십량체(decamers)이다.

신선한 코코아 세포, 동결-건조된 코코아 세포 및 코코아 세포 추출물로부터 제조된 시료는 엠파워(Empower) 2의 내부의 HPLC 방법을 실시하여 프로시아니딘 정량화를 분석하였다. 저중합체 프로시아니딘의 보정곡선은 실내 표준 저장 용액(in-house standard stock solution)을 이용하여 만들었다. 표준 세트(set of standards)는 실내 정제 표준 화합물(in-house purified standard compounds)을 사용하여 20, 40, 80, 및 100 ug/ml의 단계적 희석으로 만들었다. 이 표준 보정 곡선은 10 개의 표적 화합물(단량체 내지 십량체)의 정량화 기초이다.

실시예 14. - 테오브로민 및 카페인 분석

LC/MS 분석 방법을 이용하여, 개별적인 탈지된 테오브로마 카카오 종자 내 주요 알칼로이드, 테오브로민 및 카페인의 수준을 각각 25.2 mg/g 건조 중량 및 4.6 mg/ g 건조 중량으로 결정하였다. 대조적으로, 테오브로마 카카오 현탁 세포는 측정 가능한 카페인(도면 9C 및 9F) 또는 테오브로민(도면 9B 및 9E)를 생산하지 않지만 종자(도면 9A 및 9D)에 비교한 수준의 카테킨 및 에피카테킨을 생산한다. 테오브로민 및 카페인의 정확한 표준물은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, Inc.)(St. Louis, MO))에서 구입하였으며 그들의 대사 산물의 검출 및 정량화를 위하여 보정곡선을 만들기 위해 희석하였다. 이러한 결과는 식물 세포 배양이 원하지 않는 화합물에 조금 오염되면서 원하는 화합물은 높은 농도로 생산할 수 있음을 보인다.

또한, 카페인 및 테오브로민의 정량은 Waters 996 PDA 검출기(Waters 996 PDA detector)(Milford, MA)로 구성된 Waters 2795 분석 모듈(Waters 2795 separation module)로 수행하였다. 코코아 세포 추출물 내의 카페인 및 테오브로빈의 분리는 Kelm et al., (J. Agric. Food Chem., 2006, 54, 1571)에 의해서 조절된 280 nm UV를 이용하여 Develosil Diol (250x4.6 mm ID, 5 μ입자 크기, Phenomenex, Torrance, CA)로 수행하였다. 두 부분으로 이뤄진 이동 상은 용매(A), 아세토니트릴(acetonitrile):아세트산(acetic acid)(98:2, v/v) 및 용매(B), 메탄올:물:아세트산(95:3:2, v/v/v)로 구성된다. 직선 구배 용리는 하기와 같이 0.8 mL/분 유속으로 30℃에서 수행하였다: 0 내지 35 분, 100 내지 60 % A; 35 내지 40 분, 60 % A; 40 내지 45 분, 60 내지 100 % A. 카페인(Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 및 테오브로민(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)의 표준 저장 용액은 각각 1, 10, 20, 50, 100, 200, 및 500 ug/mL으로 순차적 희석을 사용하여 제조하였다. 시료는 상기 코코아 현탁 세포을 위한 실시예 # 및 발효하지 않은 코코아 콩을 위한 실시예 #에 기재된 바에 따라 두 번씩(duplicates) 준비하였다. 모든 시료는 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과한 ㅎ후 HPLC 모듈에 주입하였다.

표 3은 시료 내 카페인 및 테오브로빈의 측정을 보인다. 카페인 및 테오브로민은 코코아 세포 추출물 내 각각 0.27 내지 0.49 ug/mg 및 0.32 내지 0.73 ug/mg 및 발효되지 않은 코코아 콩 추출문에서 각각 14.1 ug/mg 및 49.3 ug/mg의 범위로 측정되었다. 결과 분석에 기반하여, 코코아 세포는 구체적으로 발효하지 않은 코코아 콩 추출물에 비하여 카페인 및 테오브로민을 가지지 않는다(도면 11). 따라서, 추출 조성물은 카페인 및 테오브로민이 각각 약 0.5 ug/mg 및 0.75 ug/mg보다 적을 때 구체적으로 잔틴-알칼로이드가 없는 것으로 여길 수 있다.

실시예 15. 코코아 현탁 세포의 규모 확대( Scale - up )

식물 세포 배양의 사용에서 일반적인 문제는 표적 생산물의 일관적인 생산을 얻는다는 것이다(Kim et al., Biotechnol Prog. 20(6) 1666, 2004). 따라서, 성공적인 대규모 식물 세포 배양을 위한 해결책은 안정한 생산성을 유지하는 것이다. 코코아 세포 생장 및 생산이 매우 지속적이며 규모 확대 조건하에서 안정하였기 때문에, 코코아 세포 배양의 규모 확대 현탁 과정을 125 ml 플라스크부터 500 ml 플라스크까지 성공적으로 수행하였다. 선별된 세포주의 평균 PCV는 7 일 동안 45 내지 55 % 였고, 이는 초기 PCV의 20 % 수준 보다 약 2.5 배 더 높은 것이다. 대규모 플라스크 배양은 암조건에서 125 ml 및 500 ml 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 110 rpm, 및 2800 ml 페른바흐(Fernbach) 플라스크에서 50 rpm으로 회전 진탕기(gyratory shaker)에서 배지 VIII의 유지 배지에 생장시켰다. 배양 매 7 일 마다, 생물량, 배지 내 당 농도 및 프로시아니딘 생산성을 측정하였다.

2.7 L의 카카오 세포를 6.5 L 생물반응기(작업 부피 = 5.0 L)에 접종하여 기체 흐름 속도 0.2 vvm(분 당 배양 부피 당 기체의 부피)(volume of gas per volume of culture per minute), 100 rpm 교반 속도 및 23℃ 용기(vessel) 온도 하에서 7 일간 배양하였다. 생물량는 매우 느리게 성장하여 유도기(lag phase)가 4 일간 계속되었다. 높은 접종 부피는 영양 이용능력이 제한될 수 있으며 또한 세포의 일정한 혼합이 어렵기 때문에 세포의 문제이다. 이상적인 시작 접종 부피는 25 내지 40 % PCV 사이여야 한다. 생물량 농도 및 구체적인 생산성에 영향을 미치는 중요한 인자 중 하나는 용존산소 (DO) 농도 및 CO2와 같이 용해된 기체 대사산물의 기체 변화이다(Dicosmo & Misawa, "Plant Cell Culture Secondary Metabolism", 1996, pp44). 플라스크 배양에서, 용해된 산소 및 기체 대사 산물을 조절하는 것은 중요하지만, 반응기 배양 내의 것을 조절하는 것은 실현 가능하다. 예를 들어, DO 수준이 점차적으로 떨어지면, 세포 대사 과정의 좋은 지시제(indicator)가 될 수 있다.

실시예 16. 현탁 세포 배양으로부터 대규모 분리

생물량는 신선한 세포로서 사용되는 1 L의 코코아 현탁 세포에서 되찾거나 또는 랩콘코(Labconco) 동결건조기를 사용하여 건조된 코코아 세포 75.0 g를 동결건조한다. 신선한 세포 또는 건조된 코코아 세포 파우더는 0.1 % 내지 2 %의 아스코르브산, 아세트산, 구연산의 물 1 L 또는 수용액 추출 용매 1L (0.1 % 내지 2% 아스코르브산, 아세트산, 구연산이 함유된 30, 40, 50, 60, 70, 80 % 아세톤, 30, 40, 50, 60, 70 80% 메탄올, 또는 30, 40, 50, 60, 70, 80% 에탄올)에서 0 내지 80℃에서 1 시간 동안 진탕기를 이용하여 두 번씩 추출하였다. 추출 용액은 흡인여과기(Buchner funnel)를 이용하여 여과하거나 또는 원심분리하였다. 여과액 또는 상층액은 함께 혼합한 후 40℃의 부분적인 진공 하에서 최종 부피가 300 mL가 되도록 회전식 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 증발하였다. 농축된 수용액 잔여물은 -20℃에서 동결하여 밝은 노란색 조추출물(crude extract)을 얻기 위해 랩콘코 동결건조기를 이용하여 건조하였다. 건조 코코아 세포 중량으로부터 미가공된(crude) 프로시아니딘의 수율은 실시예 10의 HPLC 정량 방법에 의해서 10 내지 15 % 사이 범위로 계산하였다.

10 L의 코코아 현탁 세포 배양에서 회수된 동결건조한 생물량는 생물량 부피의 1:1 비율로 80 % 메탄올과 혼합하여 1 시간 동안 실온에서 교반하였다. 이는 진공에서 흡인여과기에서 필터 종이를 통해 여과하였다. 추출은 적어도 세 번 반복하였다. 각각의 메탄올 추출물을 회수하여, 모아서 원래 메탄올 추출물 부피의 30 %로 감소하기 위해 감소된 압력 하의 40℃에서 농축하였다. 농축된 메탄올 추출물은 액체-액체 추출을 위해 클로로메탄(dichloromethane)을 첨가하였고 디클로로메탄층 추출액을 회수하여, 모아서 감소된 압력 하의 실온에서 25 % 비율로 농축하였다. 건조된 추출물은 메탄올에 녹여 증류수에 방울로 떨어뜨리고 얻은 침전체를 0 ℃에서 이틀간 두었다.

건조 세포로부터 얻은 전-정체한 프로시아니딘의 실제 수율은 50 내지 60 % 정제도에서 10 내지 20 %의 범위이다. 불순물의 제거를 위해서 추가적인 정제를 ㅊ18 및 실리키 컬럼을 사용하는 waters prep-LC(Milford, Massachusetts, USA)을 수행하였고 정제도는 prep-LC 정제 과정 후 99 %로 상승하였다. 고순도 프로시아니딘의 목적하는 화합물을 얻기 위해서, 결정화(crystallization) 추가 작업을 사용할 수 있다.

실시예 17. 테오브로마 카카오 세포 배양 및 카카오 콩으로부터 생산한 폴리페놀 및 프로시아니딘의 비교

현탁배양 유래 가공되지 않은 프로안소시아니딘(proanthocyanidins)의 추출

테오브로마 현탁 세포 배양의 1L 로부터 수득한 생물량를 랩콘코 동결건조기를 이용하여 건조된 카카오 세포 14.0 g 를 얻기 위해 동결건조하였다. 건조된 가루를 아세톤 수용액(70% v/v) 250 mL에 혼합하여 30 분 동안 추출하였다. 고체 잔여물을 같은 방법으로 다시 추출하였다. 두 추출액으로부터 상층액을 같이 혼합한 후 40℃의 부분적인 진공하에 회전 증발기로 증발하였다. 농축된 수용액 잔여물은 -20℃에서 동결하여 두꺼운 밝은 노란색 조추출물(crude extract)을 얻기 위해 랩콘코 동결건조기를 이용하여 건조하였다. 건조 코코아 세포 중량으로부터 미가공된(crude) 프로시아니딘의 수율은 실시예 8에 기재된 산 부탄올 가수분해 방법에 의해서 10 내지 15 % 사이 범위로 계산하였다.

비-발효 가공 코코아 콩 유래의 가공되지 않은 프로안소시아니딘의 추출

발효되지 않고, 가공되지 않은 코코아 콩을 Raw Harmony로부터 얻었다(Los Angeles, CA). 가공되지 않은 프로시아니딘을 건식분쇄(ground dried)의 5 g, 발효되지 않은 콩 또는 갈고, 탈지되고, 발효되지 않은 코코아 콩으로부터 추출하였다. 현탁 세포 배양에 사용된 상기 기재된 방법과 50 mL 아세톤 수용액(70% v/v)을 제외한 유사한 추출을 각 추출 단계에서 사용하였고, 추출을 3회 반복하였다. 조합된 추출물은 3500 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후에 40℃에서 부분 진공하에 용매를 제거하기 위해 증발시켰다. 농축된 수용액 잔여물은 -20℃에서 동결하여 자주색 조추출물을 얻기 위해 랩콘코 동결건조기를 이용하여 건조하였다. 건조 코코아 세포 중량으로부터 미가공된(crude) 프로시아니딘의 수율은 실시예 8에 기재된 산 부탄올 가수분해 방법에 의해서 10 내지 13 % 사이 범위로 계산하였다

프로시아니딘의 고성능액체크로마토그래피 ( HPLC ) 분석

프로시아니딘의 HPLC 분석은 Waters 2795 분리 모듈(separation module), 상기 Waters 996 PDA 탐지기 및 상기 Waters 474 스캐닝 형광 탐지기(scanning fluorescence detector)로 구성된 정상 HPLC시스템으로 수행하였다. 테오브로마 카카오 세포 추출물의 프로시아니딘의 특정화 및 분리 조건, 및 가공되지 않은 코코아 콩 추출물을 극성 프로틱(protic) 단량체 및/또는 저중합체에 대한 개선된 과정을 기재한 Kelm et al . (U.S. Pat. Appl. No. 2007075020)에 조정된 Develosil Diol 컬럼(column) (250×4.6 mm ID, 5 μ 입자 크기) 을 이용하여 수득하였다. 상기 두 부분으로 이뤄진 이동 상은, 용매(A), 아세토니트릴:아세트산(98:2, v/v) 및 용매(B), 메탄올:물:아세트산(95:3:2, v/v/v)을 포함한다. 직선 규배 용리를 하기와 같이 0.8 mL/분 유속으로 30℃에서 수행하였다: 0 내지 35 분, 100 내지 60 % A; 35 내지 40 분, 60 % A; 40 내지 45 분, 60 내지 100 % A. 프로시아니딘의 분리를 형광 탐지로 확인하였다(276 nm에서 자극 파장, 316 nm에서 배출 파장), 280 nm에서 UV탐지(Lazarus et al ., J. Agric . Food Chem . 47: 3693, 1999).

도면 8은 발효되지 않은 코코아 콩 추출물(도면 8A) 및 테오브로마 카카오 세포 현탁액 추출물(도면 8B)의 형광 탐지에 의한 크로마토그램을 보여준다. Kelm et al . (U.S. Pat. Appl. No. 2007075020)에 기재된 크로마토그래피 분리에 따라서, 발효되지 않은 코코아 콩 추출물은 십이량체(dodecamer)(중합도= 12)까지 포함하였다. 이 실시예는 콩에 대해 보고된 것과 같이 테오브로마 카카오 세포 배양 유래 프로시아니딘 추출물이 역시 동일한 프로필(profile)을 갖는 것을 확인하였다. 도면 9는 발효되지 않은 코코아 콩 추출물(도면 9A) 및 테오브로마 카카오 세포 배양 추출물(도면 9B)의 흡수 크로마토그램을 나타낸다. 이 검출 형식은 카페인 및 테오브로민을 검출하도록 하며, 이 실험의 결과는 콩 유래 추출물이 이러한 두 화합물의 존재를 나타내는 반면, 세포 배양물의 추출물에서 그들이 탐지되지 않은 것을 나타낸다.

따라서, 본 실시예는 테오브로마 카카오 세포 배양이 코코아 콩 안의 것과 동일한 프로시아니딘을 생산할 수 있는 반면 바람직하지 않은 화합물인 카페인 및 테오브로민을 생산하지 않는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명에 기재된 세포 배양에 대한 추출 과정은 코코아 콩 탈지에 필요한 헥산(hexanes)과 같은 용매의 사용을 요구하지 않는다. 따라서, 테오브로마 카카오 세포 배양 유래 프로시아니딘 추출물은 헥산과 같은 독성 용액의 잔여물을 포함하지 않을 것이다.

실시예 18. 카카오 세포 현탁 배양으로부터 프로시아니딘 추출물의 항산화제 활성

본 실시예는 상기 실시예에서 기재된 방법에 의해 배양된 카카오 세포 유래 추출된 프로시아니딘의 항산화제 활성에 대해 시험하는 방법을 설명한다.

본 명세서 내의 증거는 카카오 프로시아니딘의 건강 증진적 특성 및 이러한 화합물의 항산화적 특성 사이의 연관성을 언급한다. 일반적으로 이러한 항산화제는 종양 촉진 및 심혈관계 질환(cardiovascular diseases)에서 LDL 산화의 몇가지 종류와 연관된 특정한 산화력 및 자유 라디칼 반응에 영향을 미친다고 알려져 있다. 따라서, 카카오 프로시아니딘의 잠재적인 산화력을 측정하는 것은 건강을 증진하는 특성이 있는 화합물의 사용을 가능하게 하는 암 및 심장 질환과 같은 인간 질병을 예방하는데에 있어, 이러한 화합물의 영향을 확인하는 합리적인 방법이다. 유사하게, 항산화제는 주름이 적고 어려보이는 피부를 유지하는데 도움을 준다고 여겨지므로, 카카오 프로시아니딘은 화장료 조성물에 사용할 수 있다.

카카오 프로시아니딘과 같은 상기 폴리페놀의(polyphenolic) 화합물의 항산화제 능력은 관련 분야에 알려진 많은 과정으로 측정하였다. 가장 잘 알려진 방법은 산소 라디칼 흡수 능력(Oxygen Radical Absorbance Capacity)(ORAC)이다(Cao G, Alessio H, Cutler R (1993). "Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants" Free Radic Biol Med 14 (3): 303-11). 분석은 아조-개시자(azo-initiator) 화합물과 같은 자유 라디칼 발생기와 혼합한 후에 형광 분자(각각 베타-피코레리트린(beta-phycoerythrin) 또는 플루오르세인(fluorescein))의 산화적 분해를 측정하였다. 아조-개시자는 가열에 의해 자유 라디칼을 생산하는 것으로 여겨지며, 이는 형광 분자를 파괴하고 형광의 손실을 유도한다. 항산화제는 산화력있는 파괴로부터 형광 분자를 보호할 수 있다. 보호 정도는 형광계(fluorometer)를 사용하여 수량화될 수 있다. 플루오르세인(Fluorescein)은 현재 형광 탐침으로 가장 많이 쓰인다. 능력을 자동적으로 측정할 수 있고, 계산할 수 있는 장비를 상업적으로 사용할 수 있다(Biotek, Roche Diagnostics).

산화적 파괴 과정에 따라 형광 강도는 감소하였으며, 이 강도는 전형적으로 아조-개시자(자유 라디칼 발생기)의 첨가 후에 35 분 동안 기록하였다. 형광 발광 붕괴로 측정한 플루오르세인의 파괴(또는 분해)는 항산화제의 존재에 의해 현저히 감소하였다. 불균형 곡선(Decay curves)(형광 발광 강도 대 시간)은 기록하고 두 불균형 곡선(항산화제가 있거나 없는) 사이의 범위를 계산하였다. 이어서, 항산화제 매개 보호의 정도를 표준 물질로서 항산화제 트롤록스(trolox)(비타민 E유사체)를 이용하여 정량화하였다. 다른 트롤록스 농도는 표준 곡선을 만드는데 사용하였고, 시험 시료를 이것에 대해 비교하였다. 시험 시료(음식)에 대한 결과는 "트롤록스 등가물(trolox equivalents)" 또는 TE로 보고하였다.

실시예 19. 유기용매를 이용한 코코아 세포의 프로시아니딘 추출 효과

본 실시예는 다양한 유기 용매로부터 프로시아니딘의 추출의 효율을 연구하였다. 용매는 다양한 농도(아세트산을 함유하는, pH 약 3.0 내지 6.0 범위의, 30, 40, 50, 60, 70, 80 % 아세톤, 30, 40, 50, 60, 70 80% 메탄올, 또는 30, 40, 50, 60, 70, 80% 에탄올)로 사용하였다. 추출물은 다른 조건에서 추출의 효율을 비교하기 위해 분석하였다. 추출물은 실시예 9에 기재된 바에 따라 갈린 코코아 세포로부터 제조되었다. 갈린 코코아 세포 50 mg 또는 1 g 둘 다 용매를 사용하여 저중합체 프로시아니딘의 추출에 세번씩(triplicate) 사용하였다. 추출물 내의 개별적인 프로시아니딘(단량체로부터 십이량체)의 양은 실시예 14에 기재된 바와 같은 HPLC 분석 방법으로 측정하였다. 결과로부터, 80 % EtOH 용매는 다른 용매에 비해 적은 효과를 가지는 추출 시스템이었다. 50, 60, 70 % EtOH 및 70 % 아세톤은 모든 저중합체 프로시아니딘에 가장 효과적이었다. 본 발명의 결과는 60 % EtOH이 전체 저중합체 프로시아니딘에 가장 잠재적인 추출용매임을 보인다(도면 12A). 60 % EOH은 바람직하게 전체의 프로시아니딘(단량체로부터 십이량체)를 70 % 아세톤(도면 12B, 도면 12C)보다 더 많이 추출한다. 코코아 세포 유래의 추출물과 비교하여, 산성의 70 % 아세톤은 탈지된 코코아 고체 유래의 저중합체 프로시아니딘 추출에서 가장 효과적임이 보고되었다(US Pat. No. 6627232).

실시예 20. 산 및 중성 조건에서 이량체 프로시아니딘의 안정성 시험

프로시아니딘 안정성에 대해서, 산성의 70 % 아세톤은 가장 효과적인 용매임이 보고되었다(Rohr, G. E.; Meier, B.; Sticher, O. 프로시아니딘 분석. In Studies in Natural products Chemistry. Volume 21. Bioactive Natural Products (Part B). Attu-ur-Rahman; Elsevier; Amsterdam, The Netherlands, 2000; pp497-570). 이량체 프로시아니딘의 안정성은 산성 및 중성의 70 % 아세톤 용매 하에서 수행하였다. 시료는 5 ug/mL로 정제한 이량체 프로시아니딘으로부터 제조하여 0 내지 23 시간 이상 실온에 두었다. 이량체 프로시아니딘은 흡광검출기를 사용하여 276 nm의 자극 파장, 316 nm의 배출 파장에서 검출하였다. 크로마토그래피 조건은 상기 기술한 바와 동일하게 사용하였다. 도면 14A 내지 14B는 23 시간 이후에, 중성의 70 % 아세톤에서 이량체 프로시아니딘(도면 14A)이 현저하게 분해됨을 보인다. 그러나, 산성의 70 % 아세톤에서 이량체 프로시아니딘(도면 14B)는 매우 안정하게 유지되었다.

실시예 21. 코코아 세포 현탁의 규모 확대에서 통기 조건

용해된 기체는 식물 세포 배양에서 일차 및 이차 생산물 형성에 매우 중요한 역할을 한다. 본 실시예는, 기체의 산소가 생물 반응기-생장 코코아 세포에서 폴리페놀을 유도하기 위해 기체 혼합물 주입구로 공급되는 통기(aeration) 전략의 효과를 설명한다. 7.5 L 기계적 교반 생물반응기에서, 0.875 L의 카카오 세포를 배양하였고(작업 부피 = 3.5 L) 기체(오직 공기만) 흐름 속도 0.1 vvm(분당 배양 부피 당 기체의 부피)(volume of gas per volume of culture per minute), 100 RPM 교반 속도 및 26 ℃ 용기(vessel) 온도 하에서 7 일간 배양한 후, 포도당 유도제 함유 전에 10 일 동안 배양하였다. 평행의(parallel) 생물 반응기가 상기와 같지만, 배양 배지에 부가적 산소를 첨가하는 것으로 이루어진 기체 체제(regime)로 처리하였으며, 공기만 처리한 생물반응기-생장 세포와 비교하여 압축세포용적 단위 당 폴리페놀의 최종 농도가 3.1 배 상승하는 결과를 보였다. 공기만 처리한 최종 생산 수율은 PCV당 9.4 그램 프로시아니딘이었으며 산소-첨가 처리에서는 PCV 당 29.2 그램 프로시아니딘이었다.

배지 I 내지 XXXVI의 조성(저장용액의 조성은 표 2에서 제공한다.)

표 1(이어서)

표 1(이어서)

표 1(이어서)

표 1(이어서)

표 1의 기재된 배지에서 사용된 저장 용액의 조성

코코아 세포 추출물 및 비 발효 코코아 콩 추출물 내의 카페인 및 테오브로민의 분석

Claims (93)

1. 하기를 포함하는, 코코아 저중합체 프로시아니딘(cocoa oligomeric procyanidins)의 제조 방법:
   제 1 유속(a first rate)에서 코코아 저중합체 프로시아니딘의 생산하기 위해 충분한 시간 및 충분한 조건 하에서 세포의 배양; 및
   제 1 유속보다 높은 제 2 유속에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하는 세포를 유도하기에 충분한 양의 단당류(monosaccharide)를 세포 내 도입.
   
2. 제 2항에 있어서, 추가적으로 세포로부터 코코아 저중합체 프로시아니딘을 추출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 단당류는 포도당(glucose)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 단당류는 지수 생장 상태(exponential growth state)의 마지막 단계 동안 또는 후에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 배양은 무호르몬배지(hormone-free medium)에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 2항에 있어서, 상기 추출은 단당류의 도입 이후 1 내지 21 일 사이에 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 단당류는 세포주의 안정적인 유지, 과잉생산(overproduction)의 유도 및 세포 응집(aggregation)의 방지를 위해 배지(culture medium) 부피의 약 0.5% 내지 20%의 양을 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 1항에 있어서, 추가적으로 세포 배양(cell culture)으로부터 에탄올 추출 용액을 사용한 코코아 저중합체 프로시아니딘의 추출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제 8항에 있어서, 상기 에탄올 추출 용액은 수용액(aqueos)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제 8항에 있어서, 상기 에탄올 추출 용액은 유기 용매를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 1항에 있어서, 추가적으로 세포 배양에서 산성 추출 용액을 사용한 코코아 저중합체 프로시아니딘의 추출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제 11항에 있어서, 상기 산성 추출 용액의 pH는 약 3 내지 6인 것을 특징으로 하는 방법.
    
13. 제 11항에 있어서, 상기 산성 추출 용액은 아세트산(acetic acid), 구연산(citric acid), 또는 아스코르브산(ascorbic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
14. 제 2항에 있어서, 상기 추출은 대체로 잔틴-알칼로이드(xanthine-alkaloids)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
15. 제 1항에 있어서, 추가적으로 탈지 과정(defatting step)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
16. 제 1항에 있어서, 추가적으로 하나 또는 그 이상의 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    세포를 회수;
    폴리페놀(polyphenol) 다량 함유 분획물(rich fraction)의 추출을 위해 세포 생물량(cell biomass)를 적절한 용매에 균질화(homogenizing);
    용매-용매 추출 및/또는 크로마토그래피를 이용한 프로시아니딘 다량 함유 분획물의 분리; 또는
    프로시아니딘 분획물의 건조 또는 농축.
    
17. 제 1항에 있어서, 추가적으로 하나 또는 그 이상의 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    고체 생장 배지 위에서 캘러스(callus) 테오브로마 속(Theobroma sp .) 세포의 생장;
    테오브로마 카카오(Theobroma cacao) 캘러스 배양물로부터 빠르게 생장하는 세포주의 선택; 또는
    빠르게 생장한 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 테오브로마 속 세포의 현탁 배양(suspension culture) 개시.
    
18. 하기를 포함하는, 코코아 저중합체 프로시아니딘의 제조 방법:
    제 1 유속에서 코코아 저중합체 프로시아니딘의 생산하기 위해 충분한 시간 및 충분한 조건 하에서 세포의 배양; 및
    제 1 유속보다 높은 제 2 유속에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하는 세포를 유도하기 위해 무호르몬 배지 및 적절한 조건 하에서 세포를 배양.
    
19. 제 18항에 있어서, 추가적으로 세포로부터 코코아 저중합체의 추출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
20. 제 18항에 있어서, 추가적으로 제 2 유속보다 높은 제 3 유속에서 무호르몬 배지의 세포에 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하는 세포의 유도를 위해 적절한 양의 단당류를 도입하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
21. 제 20항에 있어서, 상기 단당류는 포도당인것을 특징으로 하는 방법.
    
22. 제 20항에 있어서, 상기 단당류는 지수 생장 상태의 마지막 단계 동안 또는 후에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
23. 제 20항에 있어서, 상기 단당류는 세포주의 안정적인 유지, 과잉생산의 유도 및 세포 응집의 방지를 위해 배지 부피의 약 0.5% 내지 20%의 양을 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
24. 제 19항에 있어서, 상기 추출은 무호르몬 배지에 배양을 개시한 이후 1 내지 21 일 사이에 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    
25. 제 18항에 있어서, 추가적으로 세포 배양으로부터 에탄올 추출 용액을 사용한 코코아 저중합체 프로시아니딘의 추출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
26. 제 25항에 있어서, 상기 에탄올 추출 용액은 수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
    
27. 제 25항에 있어서, 상기 에탄올 추출 용액은 유기 용매가 포함되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
28. 제 18항에 있어서, 추가적으로 세포 배양에서 산성 추출 용액을 사용한 코코아 저중합체 프로시아니딘의 추출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
29. 제 28항에 있어서, 상기 산성 추출 용액의 pH는 약 3 내지 6인 것을 특징으로 하는 방법.
    
30. 제 28항에 있어서, 상기 산성 추출 용액은 아세트산, 구연산, 또는 아스코르브산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
31. 제 19항에 있어서, 상기 추출은 대체로 잔틴-알칼로이드를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
32. 제 18항에 있어서, 추가적으로 탈지 과정을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
33. 제 18항에 있어서, 추가적으로 하나 또는 그 이상의 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    세포를 회수;
    폴리페놀 다량 함유 분획물의 추출을 위해 세포 생물량를 적절한 용매에 균질화;
    용매-용매 추출 및/또는 크로마토그래피를 이용한 프로시아니딘 다량 함유 분획물의 분리; 또는
    프로시아니딘 분획물의 건조 또는 농축.
    
34. 제 18항에 있어서, 추가적으로 하나 또는 그 이상의 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    고체 생장 배지 위에서 테오브로마 속 캘러스 세포의 생장;
    테오브로마 카카오 캘러스 배양으로부터 빠르게 생장하는 세포주의 선택; 또는
    빠르게 생장한 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 테오브로마 속 세포의 현탁 배양 개시.
    
35. 하기를 포함하는, 코코아 저중합체 프로시아니딘의 제조 방법:
    제 1 유속에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하는 세포를 유도하기 위해 무호르몬 배지 및 적절한 조건 하에서 세포 배양; 및
    제 1 유속보다 높은 제 2 유속에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하는 세포를 유도하기에 충분한 양의 단당류를 무호르몬 배지 내 세포로 도입.
    
36. 제 35항에 있어서, 추가적으로 세포로부터 코코아 저중합체의 추출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
37. 제 35항에 있어서, 상기 단당류는 포도당인것을 특징으로 하는 방법.
    
38. 제 35항에 있어서, 상기 단당류는 지수 생장 상태의 마지막 단계 동안 또는 후에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
39. 제 35항에 있어서, 상기 단당류는 배지 부피의 약 0.5% 내지 20%의 양을 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
40. 제 36항에 있어서, 상기 추출은 무호르몬 배지에 배양을 개시한 이후 1 내지 21 일 사이에 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    
41. 제 35항에 있어서, 추가적으로 세포 배양으로부터 에탄올 추출 용액을 사용한 코코아 저중합체 프로시아니딘의 추출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
42. 제 41항에 있어서, 상기 에탄올 추출 용액은 수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
    
43. 제 41항에 있어서, 상기 에탄올 추출 용액은 유기 용매가 포함되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
44. 제 35항에 있어서, 추가적으로 세포 배양에서 산성 추출 용액을 사용한 코코아 저중합체 프로시아니딘의 추출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
45. 제 44항에 있어서, 상기 산성 추출 용액의 pH는 약 3 내지 6인 것을 특징으로 하는 방법.
    
46. 제 44항에 있어서, 상기 산성 추출 용액은 아세트산, 구연산, 또는 아스코르브산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
47. 제 36항에 있어서, 상기 추출은 대체로 잔틴-알칼로이드를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
48. 제 35항에 있어서, 추가적으로 탈지 과정을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
49. 제 35항에 있어서, 추가적으로 하나 또는 그 이상의 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    세포를 회수;
    폴리페놀 다량 함유 분획물의 추출을 위해 세포 생물량를 적절한 용매에 균질화;
    용매-용매 추출 및/또는 크로마토그래피를 이용한 프로시아니딘 다량 함유 분획물의 분리; 또는
    프로시아니딘 분획물의 건조 또는 농축.
    
50. 제 35항에 있어서, 추가적으로 하나 또는 그 이상의 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    고체 생장 배지 위에서 테오브로마 속 캘러스 세포의 생장;
    테오브로마 카카오 캘러스 배양으로부터 빠르게 생장하는 세포주의 선택; 또는
    빠르게 생장한 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 테오브로마 속 세포의 현탁 배양 개시.
    
51. 하기를 포함하는, 코코아 저중합체 프로시아니딘의 제조 방법:
    충분한 시간 동안 코코아 저중합체 프로시아니딘의 생산을 유도하는 충분한 조건 하에서 세포의 배양; 및
    에탄올 추출 용매를 사용하여 세포에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 추출.
    
52. 제 51항에 있어서, 추가적으로 코코아 저중합체 프로시아니딘의 생산을 증가시키기위해 배양액 내 세포로 단당류의 도입을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
53. 제 52항에 있어서, 상기 단당류는 포도당인것을 특징으로 하는 방법.
    
54. 제 52항에 있어서, 상기 단당류는 지수 생장 상태의 마지막 단계 동안 또는 후에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
55. 제 51항에 있어서, 상기 혼탁 배양은 무호르몬 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
56. 제 51항에 있어서, 상기 추출은 단당류의 도입 또는 무호르몬 배지에 배양을 개시한 이후 1 내지 21 일 사이에 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    
57. 제 52항에 있어서, 상기 단당류는 배지 부피의 약 0.5% 내지 20%의 양을 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
58. 제 51항에 있어서, 상기 에탄올 추출 용액은 수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
    
59. 제 51항에 있어서, 상기 에탄올 추출 용액은 유기 용매가 포함되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
60. 제 51항에 대하여, 상기 에탄올 추출 용액은 산성인 것을 특징으로 하는 방법.
    
61. 제 60항에 있어서, 상기 산성 추출 용액의 pH는 약 3 내지 6인 것을 특징으로 하는 방법.
    
62. 제 60항에 있어서, 상기 산성 추출 용액은 아세트산, 구연산, 또는 아스코르브산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
63. 제 51항에 있어서, 상기 추출은 대체로 잔틴-알칼로이드를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
64. 제 51항에 있어서, 추가적으로 탈지 과정을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
65. 제 51항에 있어서, 추가적으로 하나 또는 그 이상의 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    세포를 회수;
    폴리페놀 다량 함유 분획물의 추출을 위해 세포 생물량를 적절한 용매에 균질화;
    용매-용매 추출 및/또는 크로마토그래피를 이용한 프로시아니딘 다량 함유 분획물의 분리; 또는
    프로시아니딘 분획물의 건조 또는 농축.
    
66. 제 51항에 있어서, 추가적으로 하나 또는 그 이상의 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    고체 생장 배지 위에서 테오브로마 속 캘러스 세포의 생장;
    테오브로마 카카오 캘러스 배양으로부터 빠르게 생장하는 세포주의 선택; 또는
    빠르게 생장한 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 테오브로마 속 세포의 현탁 배양 개시.
    
67. 하기를 포함하는, 코코아 저중합체 프로시아니딘의 제조 방법:
    코코아 저중합체 프로시아니딘을 생산하기 위해 충분한 시간 및 충분한 조건 하에서 세포의 배양; 및
    산성 추출 용매를 사용하여 세포에서 코코아 저중합체 프로시아니딘을 추출.
    
68. 제 67항에 있어서, 추가적으로 코코아 저중합체 프로시아니딘의 생산을 증가시키기위해 배양액 내 세포로 단당류의 도입을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
69. 제 68항에 있어서, 상기 단당류는 포도당인것을 특징으로 하는 방법.
    
70. 제 68항에 있어서, 상기 단당류는 지수 생장 상태의 마지막 단계 동안 또는 후에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
71. 제 67항에 있어서, 상기 혼탁 배양액은 무호르몬 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
72. 제 67항에 있어서, 상기 추출은 단당류의 도입 또는 세포를 무호르몬 배지에 배양을 개시한 이후 1 내지 21 일 사이에 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    
73. 제 68항에 있어서, 상기 단당류는 배지 부피의 약 0.5% 내지 20%의 양을 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
74. 제 67항에 있어서, 상기 산성 추출 용액은 수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
    
75. 제 67항에 있어서, 상기 산성 추출 용액은 유기 용매가 포함되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
76. 제 67항에 있어서, 상기 산성 추출 용액은 에탄올을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
77. 제 67항에 있어서, 상기 산성 추출 용액의 pH는 약 3 내지 6인 것을 특징으로 하는 방법.
    
78. 제 67항에 있어서, 상기 산성 추출 용액은 아세트산, 구연산, 또는 아스코르브산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
79. 제 67항에 있어서, 상기 추출은 대체로 잔틴-알칼로이드를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
80. 제 67항에 있어서, 추가적으로 탈지 과정을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
    
81. 제 67항에 있어서, 추가적으로 하나 또는 그 이상의 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    세포를 회수;
    폴리페놀 다량 함유 분획물의 추출을 위해 세포 생물량를 적절한 용매에 균질화;
    용매-용매 추출 및/또는 크로마토그래피를 이용한 프로시아니딘 다량 함유 분획물의 분리; 또는
    프로시아니딘 분획물의 건조 또는 농축.
    
82. 제 67항에 있어서, 추가적으로 하나 또는 그 이상의 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    고체 생장 배지 위에서 테오브로마 속 캘러스 세포의 생장;
    테오브로마 카카오 캘러스 배양으로부터 빠르게 생장하는 세포주의 선택; 또는
    빠르게 생장한 세포주를 액체 배지에 접종함으로써 테오브로마 속 세포의 현탁 배양 개시.
    
83. 제 1항에 있어서, 상기 언급된 코코아 세포 배양의 과정은 성장 단계 중에 포화 공기 1 % 내지 400 %의 용존 산소 농도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
84. 제 1항에 있어서, 상기 언급된 코코아 세포 배양의 과정은 단당류 도입 이후 포화 공기 1 내지 400 %의 용존 산소 농도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
85. 대체로 카페인(caffeine) 및 티오브로민(theobromine)이 없는 것으로부터 선택된 분리된 코코아 세포주.
    
86. 제 85항에 있어서, 상기 분리된 코코아 세포주는 적어도 하나의 꽃 조직(floral tissue) 또는 비-꽃 식물 생장 관련 조직(non-floral vegetative tissue)으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 분리된 코코아 세포주.
    
87. 제 86항에 있어서, 상기 꽃 조직은 꽃잎(petals), 꽃받침(sepals), 헛수술(staminodes) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 분리된 코코아 세포주.
    
88. 제 86항에 있어서, 상기 비-꽃 식물 생장 관련 조직식물 생장 관련 조직odes), 절간(internodes), 어린 잎(young leaves), 성장한 잎(mature leaves), 줄기(stems), 뿌리(roots) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 분리된 코코아 세포주.
    
89. 제 85항에 있어서, 상기 분리된 코코아 세포주는 프로시아니딘 수율이 200 mg/L PCV보다 큰 것을 특징으로 하는 분리된 코코아 세포주.
    
90. 제 85항에 있어서, 상기 분리된 코코아 세포주는 프로시아니딘 수율이 400 mg/L PCV보다 큰 것을 특징으로 하는 분리된 코코아 세포주.
    
91. 제 85항에 있어서, 상기 분리된 코코아 세포주는 수율이 세포 배양액 1 리터 당 100 mg 프로시아니딘보다 큰 것을 특징으로 하는 분리된 코코아 세포주.
    
92. 제 85항에 있어서, 상기 분리된 코코아 세포주는 수율이 세포 배양액 1 리터 당 200 mg 프로시아니딘보다 큰 것을 특징으로 하는 분리된 코코아 세포주.
    
93. 제 85항에 있어서, 상기 분리된 코코아 세포주의 수율는 세포 배양액 1 리터 당 250 mg 프로시아니딘보다 큰 것을 특징으로 하는 분리된 코코아 세포주.
    

Images