KR102584847B1 - 블루베리로부터 함량이 증가된 ε-비니페린을 함유하는 캘러스 추출물의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 함량이 증가된 ε-비니페린을 함유하는 캘러스 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 스틸벤계 기능성 물질 중에서도 정제과정없이 고함량의 ε-비니페린을 함유하는 캘러스 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

블루베리로부터 함량이 증가된 ε-비니페린을 함유하는 캘러스 추출물의 제조방법{manufacturing method for callus extract of high ε-viniferin contents from blueberry}
본 발명은 함량이 증가된 ε-비니페린을 함유하는 캘러스 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 스틸벤계 기능성 물질 중에서도 정제과정없이도 높은 함량의 ε-비니페린을 함유하는 캘러스 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 생활 습관병인 당뇨병, 고지혈증, 심혈관계 질환, 비만 등 대사증후군의 증가로 식이에 의한 1차 예방의 중요성이 점점 높아지면서 단순한 영양 섭취의 단계를 넘어 특정기능을 활성화시키기 위한 기능성 식품 및 관련 소재 개발 연구가 활발하게 진행되고 있다. 특히 식문화의 흐름이 신선한 로컬 푸드에 초점이 맞춰지면서 건강기능식품 산업에서도 식물 자원에 다량 함유되어 있는 파이토케미컬(phytochemical)에 관한 연구가 주축을 이루고 있다.
스틸벤(stillbenes)은 주로 포도와 와인에서 발견되는 파이토케미컬의 일종으로, 자연발생적 페놀화합물이며, 단량체부터 고분자까지 다양한 형태로 존재한다. 이 중에서도 레스베라트롤(resveratrol)이 가장 널리 연구되어 왔다. 레스베라트롤은 강한 항산화성으로 심혈관 질환 및 대사증후군 등의 예방에 효과가 있고, 인지기능 장애, 암세포 성장 억제 및 암 예방 효능 등 인간의 건강 증진을 위한 다양한 약리 효과가 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 상에서 확인된 바 있다(Steiner, 2016). 또한 레스베라트롤은 곰팡이, 박테리아, UV 조사 등 외부 환경에 대한 물리학적, 화학적, 생물학적 스트레스로부터 자신을 보호하기 위해 생성되는 파이토알렉신(phytoalexin)에 해당하기 때문에 식물자원 자체에 UV 등의 외부 자극을 처리함으로써 향균성을 향상시키고 레스베라트롤의 함량을 증진시키는 연구들이 다양하게 시도되어 왔다.
그러나 레스베라트롤 이외의 스틸벤계 물질의 경우 주로 원료에 대한 고려없이 순수 불질로서의 생물활성효과를 탐색하거나, 단순히 추출물을 제조한 후 그 추출물의 생물활성 효과를 검토한 연구들이 전부이다.
일예로, 레스베라트롤의 모노머인 피세틴타놀(piceatannol), 테로스틸벤(pterostilbene) 또는 아스트리진(astringin), 피세이드(piceid)와 같은 글리코시드 이성질체(isoform)가 있으며, 2 내지 8 개의 레스베라트롤 서브유닛으로 구성된 레스베라트롤 올리고머들이 있다.
상기 레스베라트롤 올리고머 중에서 포도에 주로 존재한다고 알려져 있는 비니페린(viniferin)은 레스베라트롤 이량체(dimer)로, 포도주 내에서도 그 농도가 0.1 내지 4.3 ㎎/L로, 매우 소량 발견된다. 비니페린은 항산화제, 항염증제, 항암 효과 및 심장 보호 효과 등의 우수한 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.
허나 비니페린은 레스베라트롤 올리고머 중에서도 생체 이용률이 매우 낮을 뿐만 아니라, 원재료에서 그 농도가 매우 희소하고, 가공하거나 추출하더라도 이의 약리학적 특성을 위해 충분한 농도의 비니페린을 생성하기 어렵다는 문제가 있다.
게다가 종래기술은 스틸벤계 기능성 물질을 생산하는 포도 등 재배지에서 수집된 원료를 건조 및 분쇄한 후 유기용매를 사용하거나 초음파 추출법을 통해, 다량의 추출물을 생산한 예가 있으나, 이는 포도 수확후 처리방법이거나, 포도 재배시 단처리 방법일 뿐으로, 여전히 유효성분에 대한 추출 효율(efficiency)와 생산성(yield)이 현저히 낮다는 문제가 있다. 게다가 대량의 추출물은 다량의 불순물을 포함하고 있어 후속 공정인 분리와 정제 공정이 필수적이고 이러한 정제공정은 과도한 부담이 걸리기 때문에 스틸벤계 기능성 물질의 함량 및 품질에 있어서 저품질에 머물고 있다는 문제가 있다.
이러한 문제점을 해결하고자 상기 추출물의 순도와 균일성을 고려하여 고급의 분리 및 정제기술을 도입한 예가 있으나, 생산비용이 과도하게 증가하여 생산비 측면에서 경쟁력을 확보하기 어려울 뿐 아니라, 스틸벤계 기능성 물질의 함량이 증가한다 하더라도 비니페린은 여전히 그 농도가 매우 희소하다는 문제점이 있다.
특허문헌 1. 대한민국 제10-2015-0130006호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 제한된 성장과 배양을 통해 함량이 증가된 ε-비니페린을 포함하는 캘러스 추출물을 생산하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여,
ⅰ) 블루베리 조직체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도하는 단계;
ⅱ) 상기 유도된 블루베리 캘러스를 증식배지에서 증식시키는 단계; 및
ⅲ) 상기 증식된 캘러스 배양물을 수득하여 추출하는 단계;를 포함하는 함량이 증가된 ε-비니페린을 함유하는 캘러스 추출물의 제조방법을 제공한다.
상기 ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 블루베리 과피 또는 잎일 수 있다.
상기 ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 0.5-5% 계면활성제로 5 분 동안 세척하고, 물로 0.5-6 시간 처리한 후, 70% EtOH 10-60 초 동안 처리하고, 0.5-1.5% NaOCl 0.1-10 분 동안 세척하는 표면살균처리 단계를 거친 블루베리 식물체의 조직 일부를 분리한 것일 수 있다.
상기 ⅰ) 단계와 ⅱ) 단계 사이에, 유도된 블루베리 캘러스를 고체배지에서 계대배양하여 증식시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 계대배양은 3 내지 6주 간격으로 4~5회 계대배양하는 것일 수 있다.
상기 ⅰ) 단계를 통해 얻은 블루베리 유래 캘러스는 육안을 통해 확인하였을 때, 황색을 띄는 황색 캘러스일 수 있다.
상기 ⅰ) 및 ⅱ) 단계의 캘러스 유도 배지 및 증식배지에는 옥신, 사이토키닌 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 생장조절제가 포함되는 것일 수 있다.
상기 옥신은 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도로, 상기 사이토키닌은 0.0 내지 0.2 ㎎/㎖의 농도로 첨가되는 것일 수 있다.
상기 ⅰ) 및 ⅱ) 단계는 암배양하는 것일 수 있다.
상기 ⅲ) 단계는 초음파 추출, 용매 추출 및 분배추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 추출법일 수 있다.
상기 ⅲ) 단계를 통해 얻은 블루베리 유래 캘러스 배양물의 추출물을 동결·건조하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 옥신, 사이토키닌 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 생장조절제를 유효성분으로 함유하는, 블루베리로부터 함량이 증가된 ε-비니페린을 포함하는 황색 캘러스 추출물을 대량생산하기 위한 캘러스 배지조성물을 제공한다.
상기 옥신은 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도로 첨가되고, 상기 사이토키닌은 0 내지 2.0 ㎎/㎖의 농도로 첨가되는 것일 수 있다.
본 발명은 종래 스틸벤계 기능성물질을 생산하는 공정에서의 문제점을 해결하고, 원료 자원의 한계를 극복함으로써, ε-비니페린을 약 5 배 이상 생산할 수 있으면서, 추출물 중 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 비니페린이 80% 이상의 함량을 차지하는 블루베리 유래 캘러스 추출물을 유도하고 증식시킬 수 있다. 또한, 원료 자원 내에서 ε-비니페린의 생성량을 증가시켜, 동량의 원료로부터 단순 배양 및 초음파 추출을 통해 친환경적으로 고함량의 ε-비니페린을 확보할 수 있으므로, 관련 산업에 매우 중요하게 활용될 수 있다.
도 1은 고형분 중량 기준으로 블루베리 부위별 스틸벤 함량을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 무균상태에서 자란 블루베리 조직배양묘의 잎, 줄기 및 과피 조직을 일정 크기로 잘라, 조직체(절편)을 제조한 후, 캘러스 유도 배지에서 치상하여 유도된 캘러스를 촬영한 사진이다.
도 3은 최적화된 표면살균조건으로 처리된 오닐 품종의 블루베리 잎 유래 조직체의 세포배양 결과이다.
도 4는 최적화된 표면살균조건으로 처리된 오닐 품종의 블루베리 과피 유래 조직체의 세포배양 결과이다.
도 5는 1% sodium hypochlorite를 10분 이상 처리한 표면살균조건으로 처리된 오닐 품종의 블루베리 과피 유래 조직체의 세포배양 결과이다.
도 6은 제19군, 제20군 및 제21군으로부터 제조된 캘러스 배양물을 촬영한 사진이다.
도 7은 실험군 10~12의 블루베리 유래 캘러스 및 이의 배양물로부터 추출한 총 RNA의 아가로스 겔 전기영동 실험결과이다.
도 8은 블루베리 유래 캘러스의 RT-PCR 결과로, M은 마커이고, FP는 블루베리 과피이고, LF는 블루베리 잎(대조구)이며, CA는 실험군 10의 블루베리 유래 캘러스이다.
도 9는 실험군 10~12의 블루베리 조직배양묘 잎 유래 캘러스 및 이의 배양물의 qPCR 결과 그래프(Dissociation curve)이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명의 일 측면은 하기 단계를 포함하는 함량이 증가된 ε-비니페린(ε-viniferin)을 함유하는 캘러스 추출물의 제조방법을 제공한다.
ⅰ) 블루베리 조직체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도하는 단계;
ⅱ) 상기 유도된 블루베리 캘러스를 증식배지에서 증식시키는 단계; 및
ⅲ) 상기 증식된 캘러스 배양물을 수득하여 추출하는 단계.
상기 ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 블루베리 줄기, 잎 및 과피일 수 있고, 바람직하게는 블루베리 과피 또는 잎일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 블루베리 잎일 수 있다. 상기 잎은 블루베리의 조직배양묘로부터 얻은 잎일 수 있다. 후술하는 실험예에서 확인된 바와 같이 다양한 스틸벤이 존재하는 것은 블루베리 과피, 잎인 것을 알 수 있다(도 1 및 표 2). 나아가 표면처리한 후 손상 및 오염되지 않고 100%에 가까운 높은 생존률을 가지면서, 캘러스 유도에 필요한 배양시간이 가장 짧은 잎을 사용하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
먼저, ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 0.5-5% 계면활성제로 5 분 동안 세척하고, 물로 0.5-6 시간 처리한 후, 70% EtOH 10-60 초 동안 처리하고, 0.5-1.5% NaOCl 0.1-10 분 동안 세척하는 표면살균처리 단계를 거친 블루베리 식물체의 조직 일부일 수 있다. 그러나, 0.2-2% 계면활성제로 5 분 동안 세척하고, 물로 1-6 시간 처리한 후, 70% EtOH 10-30 초 동안 처리하고, 0.5-1% NaOCl 0.5-5 분 동안 세척하는 표면살균처리 단계를 거친 블루베리 식물체의 조직 일부를 사용하는 것이 생존률이 80~100% 이상으로 달성할 수 있어 바람직하다.
만약 상기 블루베리 조직체가 상기와 같은 표면살균과정을 거치지 않거나, 일부라도 상이한 조건으로 표면살균과정이 수행된 식물체를 이용하여 제조될 경우, 후술하는 실험예에서와 같이, 조직체가 손상되거나 오염되어 캘러스가 제대로 형성되지 않는 문제가 있다.
상술한 과정의 표면살균과정을 거쳐 제조된 블루베리 조직체는 생존율이 50% 이상에 달할 수 있고, 상기 바람직한 조건으로 수행하는 경우 80~100%에 달하는 것으로 확인되었다.
이에, 상기 ⅰ) 블루베리 조직체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도한다. 이때, 상기 ⅰ) 단계는 광배양 또는 암배양일 수 있다.
또한 상기 ⅰ) 단계를 통해 얻는 블루베리 캘러스는 육안으로 확인하였을 때, 황색을 띄는 황색 캘러스인 것이 바람직하며, 적색 캘러스의 경우 황색 캘러스에서 변형된 것으로 암배양에서 3~4회의 계대배양을 통해 유도될 수 있으며, 이를 포함하는 경우, 후술하는 실험예에서와 같이 목적하는 ε-비니페린 외에 다른 성분들이 부산물(테로스틸벤, 피노실빈)로 과량 생성되어의 고함량의 ε-비니페린을 포함하는 추출물(60% 미만)을 얻을 수 없는 문제가 존재한다.
상기 ⅰ) 단계 이후, ⅱ) 단계 전에, 상기 조직의 세포가 세포 분열을 하여 세포의 덩어리인 캘러스(callus)가 생기면 배지로부터 캘러스를 분리하여 고체배지에서 계대배양하여 증식시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 계대배양에서 사용되는 고체배지는 ⅰ) 단계의 캘러스 유도배와 동일한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 상기 계대배양에서 사용된 고체배지와 ⅰ) 단계에서 사용된 캘러스 유도배지는 별도의 구별이 요구되거나 별도의 언급이 없는 한, 캘러스 유도배지로 명명하도록 한다.
상기 계대배양은 3~6주 간격으로 하되, 4회 이상 계대배양한 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 4~5회 계대배양하는 것일 수 있다. 만약 4회 미만으로 계대배양을 수행할 경우 황색 캘러스로부터 변형된 적색 캘러스가 유입될 수 있으며, 적색 캘러스 유입시 테로스틸벤 및 피노실빈과 같이 목적하지 않은 성분들의 함입으로, 추출물에서 ε-비니페린이 차지하는 함량 비율이 저하될 수 있다. 5회를 초과하여 계대배양을 수행하는 경우, 캘러스의 대사작용에 의해 추출물에 포함되는 ε-비니페린의 함량이 저하될 수 있고, 배양기간이 길어짐에 따라 추가 비용이 발생하게 되는 문제가 있다.
구체적으로 사용되는 블루베리 조직체에 따라 황색 캘러스를 얻기 위한 계대배양시기가 달라질 수 있다. 예를 들어 블루베리 조직체로 잎을 사용하는 경우, 광 또는 암배양 조건에서 4회 미만 계대배양하는 경우 적색 캘러스로 변형되기 때문에, 4회 이상으로 계대배양하는 것이 바람직하고, 블루베리 조직체로 과피가 사용될 경우에는 광 또는 암배양 조건에서 4회 계대배양에서 적색 캘러스가 유도되기 때문에 5회 이상으로 계대배양하는 것이 바람직하다. 다만 앞서 말한 바와 같이 5회를 초과하여 계대배양을 수행하는 경우, 캘러스의 대사작용에 의해 추출물에 포함되는 ε-비니페린의 함량이 저하될 수 있고, 배양기간이 길어짐에 따라 추가 비용이 발생하게 되는 문제가 있으므로, 블루베리 잎을 조직체로 사용할 때에는 4~5회, 블루베리 과피를 조직체로 사용할 때에는 5회로 계대배양하는 것이 가장 바람직하다.
상기 ⅰ) 단계를 통해 얻은 블루베리 유래 캘러스는 황색 캘러스로, 상술한 계대배양 조건을 달성할 경우 얻을 수 있다. 황색 캘러스는 육안으로 확인하였을 때, 황색을 띄는 캘러스인 것을 특징으로 한다.
상기 계대배양 단계는 원하는 목적에 따라 생략가능하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 계대배양 과정을 더 포함함으로써 황색 캘러스를 얻고, 이로부터 추출물을 얻는 경우, 추출물 중에 포함되는 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 ε-비니페린이 80% 이상의 함량을 차지하는 것과 동시에, 대조구 대비 4 배 이상의 고함량 ε-비니페린을 함유하는 캘러스 추출물을 대량생산할 수 있다는 장점이 있다.
계대배양 과정을 생략하더라도 황색 캘러스를 얻을 수 있고, 그 경우에도 추출물 상에서 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 ε-비니페린의 함량이 80% 이상 차지하고 있고, 대조구 대비 10 배 이상의 고함량 ε-비니페린을 포함하는 캘러스 추출물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 1~5 개월의 배양과정을 간략히함으로써, 빠르게 생산할 수 있는 장점이 있다.
다음으로, ⅱ) 상기 유도된 블루베리 캘러스를 증식배지에서 증식시킨다. 이는 앞서 ⅰ) 단계를 통해 캘러스가 충분하게 성장 및 증식하도록 하는 단계이므로, 현탁배양일 수 있다. 예를 들어 상기 ⅰ) 단계로부터 얻은 황색 캘러스를 증식배지(액체배지)로 옮겨 액체 현탁배양을 실시하며, 상기 증식배지에서 2 내지 15주, 바람직하게는 4 내지 8주간 현탁배양하여 황색 캘로스로부터 증식된 황색 캘러스 배양물을 얻을 수 있다.
1차 현탁배양이 완료된 후, 필요에 따라 동일조건, 동일배지에 상기 황색 캘러스 배양물을 다시 접종하여 계속적으로 배양하는, 반복 계대배양을 수행할 수 있으며, 이는 특별히 제한되지 않는다. 다만 배양기간에 따른 예상치 못한 부산물의 생성과 황색 캘러스가 적색 캘러스로 변형될 가능성 및 비용과 효과측면을 고려하였을 때, 상기 ⅱ) 배양단계는 1회 수행하는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이 블루베리 조직체로부터 황색 캘러스를 유도하고, 현탁배양하여 세포를 제조하는 방법은 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 알려진 적절한 캘러스 유래 세포(특히 식물세포) 제조방법 모두 사용될 수 있으며 특별히 한정하지 않는다.
상기 ⅱ) 단계 역시 광배양 또는 암배양인 것이 바람직하고, ⅰ) 단계와 ⅱ) 단계의 배양조건은 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 ⅰ) 단계와 ⅱ) 단계의 배양조건이 서로 동일하게 수행되는 것일 수 있다. 왜냐하면 외부적인 변형 요인을 최소화함으로써, 캘러스의 물리적 외형과 기능의 변형을 최소화하면서, 추출된 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 ε-비니페린이 80% 이상의 함량을 차지함과 동시에 대조구보다 ε-비니페린이 높은 함량으로 함유된 추출물을 대량생성할 수 있도록 하기 때문이다.
적색 캘러스의 경우 계대배양을 통해서 변형 및 유도되어 생성되므로, 만약 계대배양을 수행하지 않는다면, 불루베리 유래 캘러스 중에서 적색 캘러스가 유입될 가능성을 사전에 차단할 수 있으므로, 바로 현탁 배양하는 경우에는 배양시간 단축 및 비용 절감을 비롯하여 보다 ε-비니페린 함량이 더 높은 캘러스 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명에서 상기 ⅱ) 단계는 현탁배양이 바람직한데, 상기 현탁배양은 블루베리로부터 유래된 황색 캘러스가 액체 영양 배지인 증식배지 내에 분산되어 배양되는 것으로써, 충분하게 성장한 캘러스를 접종하여 수행되는 것일 수 있고, 2 내지 15 주, 바람직하게는 4 내지 8주간 배양되며, 상기 배양기간이 지난 후, 배양이 완료된 황색 캘러스 배양물을 회수할 수 있다.
상기 방법으로 유도 및 증식된 블루베리 유래 캘러스 배양물에는, 0.01 내지 15 건조중량%의 블루베리 유래 황색 캘러스를 포함하는 것으로 확인되었다.
필요에 따라 상기 배양이 완료된 후, 황색 캘러스 배양물을 동일조건, 동일배지에 접종하여 반복적인 계대배양을 추가 수행할 수 있다.
상기 현탁배양에서 사용되는 배지는 캘러스 유도에 사용된 배지와 동일한 조성의 배지를 사용하거나, 생장조절제의 혼합량을 변경하여 사용한 것일 수 있다. 다만 상기 증식배지는 캘러스 유도배지와 달리 액체배양을 위한 액체배지이므로 고형화제를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 캘러스 유도 배지와 증식배지는 캘러스 배양과 증식을 유도하는 물질이 첨가되어 있는 배지로, 특별히 이에 제한되지 않으나, 통상의 고체 또는 액체 배지를 포함할 수 있다. 예를 들면 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지와 B5(Gamborg et al., 1968) 배지, SH(Schenk and Hildebrandt, 1972) 배지, LS(Linsmaier and Skoog, 1965) 배지 및 WPM(Lloyd and McCown, 1980) 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
가장 널리 사용되는 배지는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지이며 담배의 조직배양을 위해 고안된 배지이다. MS배지의 특징은 높은 농도의 ammonium, nitrate, potassium이다. LS(Linsmaier and Skoog, 1965) 배지의 경우는 MS 배지와 비슷하지만 일부 유기물의 조성에 차이가 난다. White 배지(White, 1963)는 낮은 농도의 염이 특징이고 토마토 뿌리를 배양하기 위해 고안되었다. B5 배지는(Gamborg et al., 1968) 대부분의 callus를 배양하기 위해 고안되었고, ammonium ion보다 nitrate ion의 함량 비율이 높은 것이 특징이다. SH 배지(Schenk and Hildebrandt, 1972) 쌍자엽과 단자엽 식물의 callus를 배양하기 위해 개발되었다. NN(Nitsch and Nitsch, 1969) 배지는 약배양을 위해 개발되었고, MS 배지보다 낮은 염농도를 지녔지만 White 배지보다는 높다.
새로운 종을 배양할 경우에는 이미 보고된 유연관계가 높은 식물종의 배양결과를 참고로 하여 배지를 선택하는 것이 유리하다. 식물조직으로부터 캘러스만을 유도하는 경우에는 특별한 배지 설정을 위해 각종의 배지를 테스트할 필요가 없다. 오히려 배지에 농도 및 조합을 달리한 생장조절제의 선택이 훨씬 효과적인 경우가 많다.
생장조절제는 줄기와 뿌리의 분화 및 세포의 생장에 관여하는 필수적인 요소이나, 식물 조직배양에 있어서 생장조절제의 종류, 농도 및 조합처리는 성공적인 배양을 위해서 가장 중요한 요건에 해당하므로, 이들의 종류나 농도 혹은 조합에 따라 전혀 다른 성질의 캘러스가 유도될 수 있다. 따라서 본원발명과 같이 고함량의 ε-비피페린을 생성하는 블루베리 유래 캘러스 또는 캘러스 추출물을 얻기 위해서는 후술하는 실험예를 통한 생장조절제의 최적화 조건으로 본원발명의 배지가 선택되는 것이 가장 바람직하다. 특히, 본 발명에서는 블루베리 잎으로부터 유래된 황색의 캘러스로, 초반에 황색의 캘러스로부터 변형되어 적색 캘러스가 유도되나, 이를 제외한 황색 캘러스만이 바람직하다. 이는 상술한 과정을 통해 배양과정을 거쳐야 얻을 수 있음을 후술하는 실험예로부터 확인할 수 있다.
상기 캘러스 배양과 증식을 유도하기 위한 물질인 생장조절제는 옥신(auxin) 또는 사이토키닌(cytokinin) 또는 이들 모두가 첨가된 것일 수 있다.
배양 목적에 따라 생장조절제의 함량 또는 혼합비율이 달라질 수 있다. 상기 옥신으로서는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), NAA(naphthalatene acetic acid), IBA (indolebutric acid) 및 IAA(indole-acetic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있는데, 바람직하게는 2,4-D일 수 있다. 상기 사이토키닌으로는 kinetin(6-furfuryl-amino purin), BA(banzyladenine), zeatin {6-(4-hydroxy-3-methyltrans-2-butenylamino) purine}으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있는데, 바람직하게는 BA일 수 있다.
상기 캘러스 유도 배지와 증식배지에 포함되는 생장조절제는 옥신은 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도, 상기 사이토키닌은 0.0 내지 0.2 ㎎/㎖의 농도로 첨가될 수 있는데, 구체적으로 상기 ⅰ) 단계의 캘러스 유도배지는 0.2 내지 1.0 ㎎/㎖ 농도의 옥신 및 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 사이토키닌이 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지일 수 있고, 바람직하게는 0.5 ㎎/㎖ 농도의 2,4-D 및 0.2 ㎎/㎖ 농도의 사이토키닌이 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지일 수 있다.
이와 마찬가지로 상기 ⅱ) 단계의 증식배지는 상기 옥신이 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖ 농도, 상기 사이토키닌이 0.0 내지 0.2 ㎎/㎖의 농도로 포함된 것일 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 ㎎/㎖ 농도 2,4-D와 0.0 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도 BA가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지일 수 있고, 바람직하게는 0.2 ㎎/㎖ 농도의 2,4-D와 0.0 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도 BA가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지일 수 있다.
또한, 상기 캘러스 배양의 유도와 증식에 적절한 생육온도는 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면 20 내지 30℃일 수 있으며, 바람직하게는 22 내지 27℃일 수 있다. 상기 캘러스 배양의 유도와 증식에 적절한 pH 범위는 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면 바람직한 pH는 5 내지 7 일 수 있으며, 더 바람직하게는 5 내지 6 일 수 있다. 상기 캘러스 배양의 유도와 증식에 적절한 배양시간은 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면 2 내지 15주, 바람직하게는 4 내지 8주일 수 있다. 상기 캘러스를 유도하기 위해서는 인공적인 광원을 통해 시간과 빛의 세기를 조절하는 명조건과 빛을 제공하지 않는 암조건에서 배양할 수 있으며, 바람직하게는 암조건에서 배양할 수 있다.
상기 ⅲ) 단계는 상기 증식된 캘러스 배양물을 수득하여 추출하는 단계로, 상기 캘러스 배양물은 증식배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 분리한, 블루베리 유래 황색 캘러스로부터 증식 및 성장된 현탁배양세포(원심분리한 상등액을 제외한 펠렛) 등을 포함한다.
상기 현탁배양세포를 분리하기 위하여, 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 공지된 적절한 방법이라면, 특별히 이에 제한되지 않고 사용할 수 있는데, 예를 들어 원심분리를 통해 고형물(펠렛)을 분리하거나, 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 과정에 의해 분말화하여 얻을 수 있다.
상기 추출단계는 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 공지된 적절한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 초음파 추출, 용매 추출 및 분배추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 추출법을 사용할 수 있다.
구체적으로 초음파 추출은 상기 캘러스 배양물을 추출용매 또는 산이 첨가된 추출용매에 침지하고 초음파로 처리하여 수득하는 것이고, 용매 추출은 상기 캘러스 배양물을 추출용매에 침지하여 추출하는 것이며, 분배 추출은 상기 캘러스 배양물에 물과 동량의 유기용매를 첨가한 후, 분배(partition) 시킨 다음 두개의 상으로 분리된 각 층을 분리하여 추출하는 것이다. 분배 추출은 상기 과정을 통해 얻은 분리된 층 중 어느 하나에 다시 물과 동량의 유기용매를 가하여 분배시키고 두 개의 상으로 분리시키는 일련의 과정을 필요에 따라 반복수행할 수 있다.
상기 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 5의 저급알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 벤젠, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 유기용매는 부탄올, 클로로포름, 디클로메탄, 벤젠, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
구체적으로 상기 추출과정은 다음과 같다. 상기 ⅲ) 단계는 ⅱ) 단계로부터 증식된 캘러스 배양물을 회수하여 추출물을 제조하는 과정으로, 상기 ⅱ) 단계로부터 회수한 캘러스 배양물에 물, 탄소수 1 내지 5의 저급알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 벤젠, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 추출용매를 첨가한 후 특정 조건 하에서 초음파를 처리함에 따라 상기 캘러스 내에 포함되어 있는 유효성분을 효과적으로 추출한 초음파 추출물일 수 있다. 이때, 상기 초음파 추출에 사용되는 추출용매는 산 용액을 더 포함하는 것일 수 있다.
또는, 상기 회수한 캘러스 배양물에 추출용매를 첨가하여 얻은 용매추출물이거나, 부탄올, 클로로포름, 디클로메탄, 벤젠, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유기용매를 이용한 분배추출법으로 추출한 분배추출물일 수 있다.
가장 바람직하게는 블루베리 유래 캘러스 추출물은 블루베리 유래 캘러스 배양물에 추출용매와 산이 혼합된 용매를 첨가한 후 특정 조건 하에서 초음파를 처리함에 따라 캘러스 내에 포함되어 있는 유효성분을 효과적으로 추출한 초음파 추출물일 수 있으며, 이러한 추출공정을 통해 추출된 초음파 추출물을 다시 부탄올, 클로로포름, 디클로메탄, 벤젠, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유기용매를 이용해 분배추출한 것 일 수 있다.
이 경우, 불순물의 함량 대비 유효성분의 수율이 현저하고, 유효성분의 함량이 가장 높게 회수될 수 있다. 따라서 본 발명의 상기 방법을 통해 제조된 초음파 추출과 분배 추출을 복합사용하여 얻은 캘러스 추출물의 경우 다양한 기능성을 가진 소재로서 의약품, 식품, 화장품 등 다양한 산업분야에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 블루베리는 천연 약용식물로서 식용이 가능하므로 이로부터 유래한 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기간 사용에도 안전한 이점을 가진다.
상술한 내용을 종합하면 본 발명의 함량이 증가된 ε-비니페린을 함유하는 캘러스 추출물을 얻기 위한 가장 바람직한 형태는 아래와 같은 단계 및 조건들을 포함한 것일 수 있다.
ⅰ) 0.2-2% 계면활성제로 5분동안 세척하고, 물로 1-6 시간 처리한 후, 70% EtOH 10-30초 동안 처리하고, 0.5-1% NaOCl 1-5분 0.5-5분동안 세척하는 표면살균처리 단계를 거친 블루베리 식물체의 조직 일부를 분리한 블루베리 조직체를, 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖ 농도의 옥신 및 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 사이토키닌이 첨가된 MS 배지(캘러스 유도 배지)에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도하는 단계;
ⅱ) 상기 유도된 블루베리 캘러스를 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖ 농도의 옥신과 0.0 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 사이토키닌이 첨가된 MS 배지(증식배지)에서 암배양조건으로, 2 내지 15주 바람직하게는 4 내지 8주 동안 증식시키는 단계; 및
ⅲ) 상기 증식된 캘러스 배양물을 수득하여 추출하는 단계. 이때, 상기 ⅲ) 단계는 초음파 추출 및 분배추출을 순차적으로 수행하는 복합 추출법일 수 있다.
상기와 같은 배양과정을 거칠 경우, 블루베리 잎 유래 황색 캘러스가 생성되며, 이의 현탁배양물은 성장률이 낮은데도 불구하고, 추출물로 제조할 경우, 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 ε-비니페린의 함량이 차지하는 비율이 80% 이상을 차지하며, 상기 ε-비니페린의 함량은 대조구 대비 4 배 이상의 고함량인 것을 확인하였다.
또한 상기 ⅰ) 단계와 ⅱ) 단계 사이에, 상기 ⅰ) 단계에서 유도된 블루베리 캘러스를 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖ 농도의 옥신과 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖ 농도의 사이토키닌이 첨가된 MS 배지(고체배지)에서 광배양 또는 암배양조건으로, 4 내지 6주 간격으로 4 내지 5회 계대배양하여 증식시키는 단계(ⅰ-1 단계)를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 고농도의 산물을 회수하고자, 상기 추출물을 감압농축 등의 방법으로 농축하거나, 추가 정제방법을 사용하여 고순도로 정제할 수 있다. 또한 상기 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
상술한 일련의 과정을 통해 얻어진 블루베리 유래 캘러스 추출물은 자연산 블루베리 잎 추출물 비해 유효성분인 ε-비니페린의 함량이 대조구 대비 4배 이상 증가되었음을 확인하였다. 또한, 상기 추출물은, 추출물에 존재하는 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 상기 ε-비니페린의 함량이 차지하는 비율이 80% 이상인 것으로, 뛰어난 기능을 갖는 ε-비니페린의 함량이 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈에 비해 상대적으로 고함량으로 포함되어 있음을 확인하였다. 즉, 상술한 일련의 과정을 통하지 않을 경우에는 ε-비니페린 외에 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈이 차지하는 비율이 20% 이상으로, ε-비니페린을 고함량으로 포함하는 추출물을 얻기위해서는 별도의 정제과정과 농축과정이 필요한데 반해, 본원발명은 제한된 조건의 캘러스 배양과정을 통해 추출물 상에서 다른 스틸벤 화합물보다 ε-비니페린이 상대적으로 높은 비율의 함량을 함유하고 있는 고함량의 ε-비니페린을 포함하는 블루베리 유래 캘러스 추출물을 대량으로 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 블루베리 유래 캘러스의 세포배양과 블루베리 유래 캘러스의 세포배양 추출물은 간 독성 치료, 간 기능 보호 및 개선 효과를 가지는 치료제 또는 기능성 식품 소재로 활용될 수 있다.
상기 캘러스 추출물은 앞서 설명한 바와 같이, 식품 조성물 또는 화장료 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 캘러스 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 피부외용 연고, 로션, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼, 오일젤 등의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 캘러스 추출물을 0.00001 내지 50% 중량%, 바람직하게는, 0.0001 내지 20% 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10% 중량%으로 포함한다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
한편, 상기 '식품 조성물'에서, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미의 건강기능식품 또는 건강보조식품을 모두 포함한다.
본 발명 식품 조성물에서 상기 캘러스 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물에서 캘러스 추출물의 첨가량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 상기 캘러스 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
음료를 제조하는 경우 상기 캘러스 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 약 1 내지 20 중량%, 바람직하게는 약 5 내지 12 중량%이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 약 20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
실험예 1. 블루베리 부위별 스틸렌 함량 분석
1) 실험재료 및 시약
국내에서 생산되고 있는 블루베리 중 2016년 6월 성남 지역에서 수확한 조생종인 오닐(O'Neal) 품종을 수집하였다. 수집한 블루베리를 과피, 과피(UV 처리한), 잎, 줄기로 구분하였고, 부위별로 스틸벤 함량을 분석하기 위해 각각 동결건조하였다.
실험에 사용한 모든 시약은 HPLC grade를 사용하였고, JT Baker(Phillipsburg, NJ, USA)와 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 표준물질로 사용한 레스베라트롤(t-resveratrol, R5010), 테로스틸벤(t-pterostilbene, P1499), 피노실빈(pinosylvin, 56297)은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA), 비니페린(ε-viniferin, FV30429)은 Carbosynth (Berkshire, UK)에서 구입한 것을 사용하였다.
블루베리의 조직 부위별 스틸벤 함량을 분석하여, 조직배양에 사용할 조직체를 선발하고자 하였다.
2) 블루베리 부위별 스틸벤 함량 분석
상기 1) 단계에서 준비된 블루베리의 각 부위(과피, 잎, 줄기)에서 스틸벤 함량을 분석하기 위해 아래 방법으로 스틸벤을 추출한 후, HPLC법으로 스틸벤 함량을 분석하였다.
우선 상기 1) 단계에서 준비된 동결건조된 각 부위(과피, 잎, 줄기)를 막자사발을 이용하여 분쇄하였다. 이때, 동결건조된 블루베리의 줄기는 분쇄기(Cyclotec 1093, Foss, Hoganas, Sweden)로 분쇄하였다. 분쇄된 시료 3 g에 0.1% HCl이 혼합된 메탄올 용액 25 ㎖를 가하고, 현탁시킨 후, 27 ℃에서 30분동안 초음파로 처리하여 추출액을 제조하였다. 상기 추출액을 원심분리 장치(Centrikon T-324, Kontron, Milano, Italy)를 사용하여 10분간 12,000×g로 원심분리한 후 whatman filter paper No. 4로 여과하고, 잔여물을 수거하였다. 상기 잔여물을 상술한 추출과정으로 재추출하고, 여과하였다. 재추출액을 여과액과 혼합하고, 40 ℃에서 감압농축(rotary evaporator, EYELAN-1110, EYELA, Tokyo, Japan)하여 용매를 제거한 후, 20 ㎖ 증류수와 동량의 에틸 아세테이트(ethylacetate)를 차례대로 첨가하여 4 ℃에서 10분간 방치하였다. 에틸아세테이트 분획물을 새로운 튜브로 옮기고, 잔여 증류수 층을 분리하였다. 상기 분리된 잔여 증류수 층을 대상으로 에틸아세테이트를 이용해 2차례 더 분획물을 분리하였다. 모든 에틸아세테이트 분획물을 혼합한 다음 40 ℃에서 감압농축(rotary evaporator, EYELA N-1110, EYELA, Tokyo, Japan)을 통해 농축물을 제조하였다. 상기 농축물을 1 ml의 메탄올에 녹여 0.22 μm syringe filter로 여과 후 HPLC에 주입하여, 스틸벤 함량을 분석하였다.
3) HPLC 분석
블루베리의 스틸벤 함량 분석은 종래 HPLC 분석법(Lyons et al. 2003)을 일부 수정하여 사용하였다. 구체적으로 HPLC 시스템(Agilent 1100 series)은 펌프, 인젝트, UV/VIS 검출기, 적분기(Chemstation software), 컬럼(Agilent eclipse XDB-C18: 4.6 mm x 250 mm, 5 μm, ZORBAX) 등으로 구성되었으며, 분석 조건은 하기 표 1에 나타내었다 0.1% formic acid가 첨가된 water(A)와 0.1% formic acid가 첨가된 acetonitrile(B)를 용매로 하여 구배(gradient) 조건 하에서 1.0 ml/min의 유동속도로 45분간 작동시켰다. 이때 시료 주입량은 20 μl이었고, 용매의 구배(gradient) 조건은 초기 90:10의 A/B 비율로 시작하여 30분까지 20:80 비율로 유지한 후 35분까지 90:10으로 조정되었으며, 마지막으로 10분 동안 90:10으로 유지하였다. 검출파장은 300 nm에서 측정되었고, 분석 칼럼의 오븐 온도는 25 ℃로 일정하게 하였다. 한편, 표준물질로는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)의 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈을 구입하여 사용하였고, Carbosynth (Berkshire, UK)의 비니페린을 사용하였다. 각 실험값은 5번 반복 측정의 평균으로 표시하였다.
분석 결과, 스틸벤 표준용액이 레스베라트롤, 비니페린, 테로스틸벤의 순으로 모두 방해 peak 없이 분리되었으며 RT값은 각각 레스베라트롤은 14.02분, 피노실빈은 20.19분, 테로스틸벤은 24.69분대로 4종 모두 30분 이내에 분리된 것을 확인하였으며, 이를 검량곡선으로 사용하였다.
parameters 조건
Column Agilent eclipse XDB-C18 (4.6 x 250mm, 5m, ZORBAX)
Column 온도 25 ℃
flow rate 1.0 ml/min
주입양(injection volume) 20 ㎕
용매 A: 0.1% formic acid in water,
B: 0.1% formic acid in acetonitrile
구배(gradient) time(min) % A % B
0 90 10
30 20 80
35 90 10
45 90 10
wavelength 300 ㎚
4) 통계처리
스틸벤 함량의 경우 Window 용 SAS 9.2 version (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, p<0.05 수준에서 Duncan의 multiple range test로 유의성을 검정하였다.
5) 결론
도 1은 고형분 중량 기준으로 블루베리 부위별 스틸벤 함량을 분석하여 나타낸 그래프이다.
블루베리 부위 스틸베노이드 농도
(Stilbeoid content)(㎍/g dw)
레스베라트롤
(Resveratrol)		 -비니페린
(-Viniferin)		 피노실빈
(Pinosylvin)		 테로스틸벤
(Pterostilbene)
과피
(Skin)		 1.45±0.24 2.88±1.50 0.03±0.03 0.14±0.02
줄기
Stem		 1.38±0.16 7.19±1.43 0.00±0.00 0.03±0.01
잎
Leaf		 2.86±0.64 1.00±0.12 0.09±0.03 0.10±0.02
도 1 및 표 2를 살펴보면, 레스베라트롤의 경우 블루베리의 잎에서 2.86 ㎍/g dw 가장 많이 함유되어 있었고, 블루베리의 과피와 줄기에는 각각 1.45, 1.38 ㎍/g dw이 함유되어 있는 것으로 확인되었다. 비니페린은 스틸벤 4 종 중 블루베리의 부위에 따라 함량 차이가 현저한 것을 확인하였다. 특히, 블루베리의 줄기와 과피에 가장 높게 함유되어 있는 것으로 확인되었다.
그러나, 피노실빈의 경우 블루베리의 각 부위별로 유의적 차이를 나타내는 것으로 확인하였고, 전체적으로 가장 낮은 함량이 포함되어 있는 것으로 확인되었으나, 특히 블루베리의 줄기에서는 피노실빈이 거의 함유되지 않은 것으로 관찰되었다.
테로스틸벤의 함량은 과피에서 0.14 μg/g dw로 가장 높았고 잎과 줄기에서는 각각 0.10과 0.03 μg/g dw로 유의적인 차이를 보이고 있음을 확인하였다.
종합하면, 블루베리 과피, 줄기, 잎에는 종류에 따라 다양한 함량과 비율로 각기 다른 스틸베노이드가 포함되어 있어 어느 것을 사용하여도 무방하나, 다양한 스틸벤이 존재하는 것은 블루베리의 잎과 과피임을 확인하였는 바, 블루베리의 잎과 과피를 사용하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
실험예 2. 블루베리 유래 캘러스 유도 가능성 확인
1) 블루베리 유래 캘러스 유도
블루베리 성체의 조직체를 사용하기에 앞서, 무균 상태의 블루베리 조직배양 식물으로부터 오염되지 않은 블루베리 조직체를 얻은 후, 이를 사용하여 캘러스 형성이 가능한지 여부 먼저 확인하고자 하였다.
블루베리 조직배양묘의 잎과 줄기 조직을 일정 크기의 절편으로 만든 후 캘러스 유도 배지에 치상하였다. 치상한지 약 2-3주 후 캘러스가 발생되었고, 약 6-8주 정도 되면 계대배양에 사용할 수 있을 정도로 조직체 전체에 캘러스가 형성되었고, 이때 무균상태에서 블루베리 조직배양묘의 잎 유래 캘러스를 잘라내어 계대배양용 평판 배지에 옮겼다. 캘러스는 형태가 없이 탈분화하는 세포 덩어리이지만 결코 균일한 것이 아니기 때문에 분열중심(캘러스 덩어리의 외층)을 포함하는 부분, 즉 색이 엷고 윤기 있는 신선한 부분만을 핀셋과 메스로 잡아내어 새로운 배지에 옮겨 계대배양을 수행함으로써 캘러스를 안정화시켰다. 계대배양을 할 수 있을 만큼 조직 전체에 캘러스가 형성되는 것을 확인하였고, 본 발명에서는 증식정도, 배양기간 및 비용을 고려하여, 약 4-6주 주기로 계속적으로 새로운 배지에 이식하여 블루베리 조직배양묘 잎 유래 캘러스 세포주를 획득하였다. 따라서 무균 상태의 적정 배양 조건에서 블루베리 조직체로부터 캘러스 형성이 가능하다는 것을 확인하였다.
이때 사용된 캘러스 유도용 배지는 식물호르몬(auxin 0.2 ㎎/㎖), sucrose 30 g/l, gelite 4 g/l(pH는 5.8)이 함유된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231) 배지를 사용하였다. 배양조건은 온도 26℃, 습도 60%의 growth chamber에서 1500 Lux의 광배양(16/8 h day/night cycles) 및 암배양 조건으로 배양을 실시하였다.
2) 결론
도 2는 무균상태에서 자란 블루베리 조직배양묘의 잎, 줄기 및 과피 조직을 일정 크기로 잘라, 조직체(절편)을 제조한 후, 캘러스 유도 배지에서 치상하여 유도된 캘러스를 촬영한 사진이다.
구체적으로 치상한지 약 2-3주 후 캘러스가 발생되었고(도 2 좌측), 약 6-8주 정도 되면 계대배양에 사용할 수 있을 정도로 조직체 전체에 캘러스가 형성되었음을 확인하였다(도 2 우측). 이때 무균상태에서 캘러스를 잘라내어 계대배양용 평판배지에 옮긴다. 캘러스는 형태가 없이 탈분화하는 세포 덩어리이지만 결코 균일한 것이 아니기 때문에 분열중심(캘러스 덩어리의 외층)을 포함하는 부분, 즉 색이 엷고 윤기 있는 신선한 부분만을 핀셋과 메스로 잡아내어 새로운 배지에 옮겨 계대배양을 수행함으로써 캘러스를 안정화시켰다.
도 2에서와 같이 잎, 줄기 모두에서 계대배양을 할 수 있을 만큼 조직 전체에 캘러스가 형성되는 것을 확인하였고, 잎 유래 캘러스는 약 4-6주 주기로 계속적으로 새로운 배지에 이식하여 블루베리 조직배양묘 잎 유래 캘러스 세포주를 획득하였다.
실험예 3. 블루베리 유래 캘러스 세포배양을 위한, 식물체의 표면살균법 최 적화
1) 블루베리 유래 캘러스 유도
우선 블루베리 유래 캘러스의 세포배양을 위한 식물체의 표면소독법을 최적화하였다. 식물체는 국내에서 생산되고 있는 블루베리 중 성남 지역에서 2016년 6월에 수확한 조생종인 O'Neal(오닐) 품종의 과실과 잎을 사용하였다.
상기 식물체가 과실일 경우, 상기 과실을 먼저 전체적으로 소독하여 무균상태로 만든 다음, 과육을 제거한 과피 조직체를 사용하였다.
상기 식물체를 물로 여러차례 세척하여 오염물 및 오염균을 깨끗하게 제거한 후 세척 용액의 종류(세제, 차아염소산 등), 농도 및 처리 시간, 70% 에탄올의 처리 유무 등을 변수로 설정하여 수행하였고, 구체적인 세척순서와 조건은 표 3에 나타난 바와 같다(1->2->3->4 순서로 세척 진행됨). 세척용액을 변경할 경우에는 멸균수로 3회, 30초 이상 세척하고, 25 ℃, 100 rpm으로 shaking incubator에서 세척한 후, 변경할 세척용액을 적용하였다.
실험의 재현성 및 신뢰성을 위해 각각의 실험은 동일한 조건의 10 내지 11개의 시료를 만들어 온도 25 ㅁ 1 ℃, 습도 60%의 growth chamber에서 암배양 조건으로 배양하면서 생존률 및 오염률을 분석하였다. 각 실험에서 교차오염 요인을 제거하기 위해, 각 시료당 1 개의 조직체를 치상하여 실험하였다.
세척순서 세척용액 농도(%) 세척시간
1 Detergent 0.2, 2 5분
2 Tap water - 1, 3, 6시간
3 Ethanol 70 0, 30초
4 NaOCl 0.5, 1 30초, 1, 5분
2) 결론
도 3은 최적화된 표면살균조건으로 처리된 오닐 품종의 블루베리 잎(old leaf) 유래 조직체의 세포배양 결과이고, 도 4는 최적화된 표면살균조건으로 처리된 오닐 품종의 블루베리 과실 유래 과피 조직체의 세포배양 결과이다.
오닐 품종의 잎의 경우, 2% detergent 5분 → tap water 1시간 → 70% EtOH 30초 → 1% NaOCl 5분으로 세척한 식물체로부터 조직체를 분리하여 배양하는 것이 손상 및 오염이 되지 않고, 생존률(100%)이 가장 높았다(도 3).
오닐 품종의 블루베리에서 과실의 경우 2% detergent 5분 → tap water 1 시간 → 70% EtOH 30초 → 0.5% NaOCl 30초로 세척하여 식물체를 준비하여, 이로부터 얻은 조직체를 사용하는 것이, 조직세포 표면의 손상을 최소화하여 캘러스 세포배양이 가능하게 하는 표면살균 조건임을 확인하였다(도 4)(생존률 80%).
특히 무균화된 과실로부터 과피 조직을 분리하여 캘러스를 유도하는 경우에는 블루베리의 품종에 따라 표면살균 최적 조건이 달랐는데, 구체적으로 오닐보다 과육이 크고 단단한 다로우의 경우, 마지막 4차 단계에서 1% NaOCl로 1-5분간 세척하는 것이 바람직함을 확인하였다.
또한, 락스(1% sodium hypochlorite)를 이용해 10 분 이상 처리한 경우에는 오염률은 낮지만, 순서에 상관없이 조직체가 손상되거나 탈색될 뿐만 아니라, 생존률도 저하되는 문제가 발생하였다(도 5).
실험예 4. 블루베리 잎 유래 캘러스 유도 배지조건 최적화
1) 실험재료
무균상태에서 자란 O'Neal(오닐) 품종의 조직배양묘의 잎을 사용하였고, 블루베리 성체의 경우 국내에서 생산되고 있는 블루베리 중 성남 지역에서 2016년 6월에 수확한 조생종인 O'Neal(오닐) 품종의 잎을 실험예 3의 조건으로 표면소독한 후 무균 재료로 사용하였다. 배지에 사용된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231) 배지, sucrose(S0809), gelite(G1101), 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid(2,4-D)(D0911), BA(6-Benzylaminopurine, 6-BAP)(B0904)는 Duchefa Biochemie(Haarlem, Netherland)에서 구입한 것을 사용하였다.
2) 블루베리 잎 유래 캘러스의 유도
본 발명에서는 대표적인 블루베리 품종인 오닐로부터 캘러스를 유도하였다. 오닐 품종의 블루베리 잎을 채취하여 흐르는 물로 세척한 다음 2% detergent 5분 → tap water 1시간 → 70% EtOH 30초 → 1% NaOCl 5분으로 세척하여 표면살균을 실시하였다. 표면살균이 완료된 블루베리 잎 조직체를 5 x 5 mm 크기로 절취한 다음 각각의 조직을 배양배지에 치상하였다. 이때 사용된 캘러스 유도용 배지는 식물호르몬(auxin 또는 cytokinin), sucrose 30 g/l, gelite 4 g/l(pH는 5.8)이 함유된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231) 배지를 사용하였다. 배양조건은 온도 25 ± 1 ℃, 습도 60%의 growth chamber에서 1500 Lux의 광배양(16/8 h day/night cycles) 및 암배양 조건으로 배양을 실시하였다. 각 군당 10-11개의 dish를 만들어 조직체를 치상하였고, 이 실험 set을 4반복 진행하였다.
1차 계대배양 시기는 증식배지 상의 증식속도를 관찰하여 최적화하였고, 증식속도는 캘러스 조직체를 치상(이식)한지 3주 후의 증가율(면적)을 분석하여 결정하였다.
이후, 2차 계대배양부터는 일률적으로 같은 주기로 진행하였고, 동일조성의 고체배지를 사용하여 계대배양을 실시하였다.
3) 1차 계대배양 시기 분석결과
식물체(블루베리)를 실험예 3의 최적 무균조건으로 처리하고, 다양한 배지조건으로 블루베리 잎 조직체를 배양하였을 때, 캘러스 형성이 유도되는지와 증식률을 분석하고자 하였다. 모든 결과는 표 4에 나타내었다.
표 4는 다양한 조건의 배지에서 블루베리 잎 유래 캘러스의 유도 및 증식 결과를 나타낸 것이다.
구분 조직체 배지에 첨가된 호르몬 조건 캘러스 유도 및 증식 정도
Auxin(2, 4-D)a 농도(㎎/㎖) Cytokinina
농도(㎎/㎖)		 증식 정도
(score)b 		증식률(%)c
제1군 잎
(암배양)
young leaf		 0.2 0 - 15
제2군 0.5 0 - 25
제3군 1.0 0 - 42
제4군 0.2 0.05 + 64
제5군 0.5 0.05 + 78
제6군 1.0 0.05 + 74
제7군 0.2 0.1 + 69
제8군 0.5 0.1 + 61
제9군 1.0 0.1 + 72
제10군 0.2 0.2 ++ 67
제11군 0.5 0.2 +++ 66
제12군 1.0 0.2 ++ 66
제13군 잎
(광배양)
young leaf		 0.2 0.2 +++ 70
제14군 0.5 0.2 +++ 67
제15군 1.0 0.2 ++ 68
제16군 잎
(암배양)
old leaf		 0.2 0.2 ++ 65
제17군 0.5 0.2 ++ 63
제18군 1.0 0.2 ++ 52
a 2, 4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid), BA: 6-benzylaminopurine.
b Score for blueberry explants: - Weak callus initiation and poor growth, + Good induction of callus but poor growth, ++ Good initiation and moderate growth, +++ Best induction and vigorous growth of callus.
c Induction coefficient(%) = (total number of induced calli/number of cultured explants) x 100%.
표 4는 각 군에서, 3주 후 블루베리 잎 유래 캘러스의 증가율(면적) 변화를 이용해 캘러스 유도 및 증식을 평가한 것이다. 이를 통해 약 3-6주 후 캘러스가 유도되었고, 무균상태의 적정 배양조건에서 블루베리 조직체(잎)로부터 캘러스 유도가 가장 높은 배지조건은 배지에 auxin(2, 4-D)과 cytokinin(BA)가 동시에 첨가된 배지인 것이 바람직하다는 것을 확인하였다(auxin 0.5 ㎎/㎖과 cytokinin 0.2 ㎎/㎖).
또한, 동일한 배지를 사용하더라도 광배양이 암배양보다 우수하고, 조직배양묘 잎(young leaf)이 블루베리 (성체) 잎(old leaf)을 이용했을 때보다 우수하였으며, 상술한 조건(배지조건, 광배양/암배양, young leaf)들을 모두 만족시킬 경우, 캘러스 유도에 걸리는 시간을 약 2-4주 단축할 수 있음을 확인하였다.
다시 말해 1차 계대배양 시기가 4 내지 6주인 것이 바람직함을 확인하였으며, 본 실험예에서는 캘러스 내 스틸벤 함량 및 관련 유전자 발현량을 고려하여 가장 바람직한 4주 간격으로 일률적으로 수행하였다.
또한, 과피를 사용할 경우에는 캘러스 유도가 2~4주 오히려 지연되므로, 잎을 사용하는 것이 바람직하였다.
상술한 바와 같이 1차적으로 배양 유도한 캘러스 중에서 제11군 및 제14군의 캘러스를 3~5차 계대배양하였다. 그 결과 배양조건과 계대배양 차수에 따라 증식률 뿐만 아니라 캘러스의 물리적 특성(경도, 색상 등)에도 차이를 보이고 있음을 육안으로 확인하였다. 구체적으로 캘러스의 색상에 있어서, 블루베리 (조직배양묘) 잎 유래 캘러스의 경우 광배양에서는 계대배양 4차까지 전반적으로 노란색을 띄는 황색 캘러스를 얻을 수 있었으나, 암배양에서는 계대배양 3회에서 일부 캘러스가 겉면에 붉은색을 띄는 적색 캘러스로 변형되는 것을 확인하였고, 3회 계대배양에서 적색 캘러스를 얻을 수 있음을 확인하였다.
블루베리 과피 유래 캘러스 경우에는 암배양 조건에서만 계대배양 4차에서 붉은색을 띄는 적색 캘러스가 유도되어 얻을 수 있음을 확인하였다. 다만 과피 유래 캘러스의 경우 계대배양 시기가 잎 유래 캘러스보다 2~4 주 더 길기 때문에, 대량생산이 어렵다는 단점이 있다.
실험예 5. 블루베리 ( 조직배양묘 ) 잎 유래 캘러스 현탁배양조건 최적화
1) 블루베리 ( 조직배양묘 ) 잎 유래 캘러스의 현탁배양
본 실험에서는 실험예 4의 제11군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 증식배지에서 4차까지 계대배양하여 얻은 황색 캘러스(DY), 실험예 4의 제14군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 증식배지에서 4차까지 계대배양하여 얻은 황색 캘러스(LY) 및 제11군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 4차까지 계대배양하여 얻은 적색 캘러스(DR)을 이용하여 현탁배양을 수행하였다.
캘러스는 불균일한 세포의 집단이므로, 증식속도가 늦기 때문에, 액체배지에 옮겨 현탁 배양함으로써 균일한 세포의 증식과 대량생산을 유도할 수 있다. 따라서 상기 황색 캘러스(LY, DY)와 적색 캘러스(DR)를 다양한 조건으로 현탁배양하여 최적 조건을 확인하고자 하였다.
이때, 캘러스 덩어리가 균일하게 흩어져 세포군이 되도록 하는 것이 바람직하며, 이를 위해 본 발명의 실험예에서는 무균 상태에서 멸균된 메스를 이용하여 캘러스 덩어리를 곱게 다진 후, 배양함으로써 액체 배지 상에서 균질하게 풀어져 증식되도록 하였다(도 6의 '현탁배양 초기').
현탁배양은 식물호르몬(auxin(2,4-D) 0.2 ㎎/㎖과 cytokinin(BA) 0.0, 0.2, 4 ㎎/㎖ 혼합)과 sucrose 30 g/l, CaCl2 30 mM(pH는 5.7)이 함유된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231) 액체배지를 사용하였다. 액체배지는 고압 살균한 후 100 ㎖ 삼각플라스크에 40 ㎖씩 분주하여 사용하였다. 블루베리 유래 캘러스(황색 캘러스(LY, DY)와 적색 캘러스(DR)) 400 ㎎을 40 ㎖의 액체 배지에 넣고 shaking incubator를 사용하여 25 ℃, 100 rpm, 암배양 조건으로 7주 동안 현탁배양한 다음, 캘러스 배양물을 수확하였다.
3종류의 현탁 배양배지에서 배양된 블루베리 유래 현탁 배양 전후 생중량 및 건중량을 측정하여 세포 증식률을 분석하여, 도 6과 표 5에 나타내었다.
도 6은 제19군, 제20군 및 제21군으로부터 제조된 캘러스 배양물을 촬영한 사진이다.
구분 캘러스 현탁배양용 액체배지에 첨가된 호르몬 조건 증식 정도
Auxin(2, 4-D)a 농도(㎎/㎖) Cytokinina
농도(㎎/㎖)		 증식 정도
(score)b 		증식률(%)c
제19군 황색 캘러스(제11군)_DY 0.0 0.0 - -
(곰팡이 오염 또는 세포 괴사)
제20군 0.2 0.0~0.2 +++ 52
제21군 0.2 4 - -
(세포 괴사)
제22군 황색 캘러스(제14군)_LY 0.0 0.0 - -
(곰팡이 오염 또는 세포 괴사)
제23군 0.2 0.0~0.2 +++ 68
제24군 0.2 4 - -
(세포 괴사)
제25군 적색 캘러스(제11군_4차)_DR 0.0 0.0 - -
(곰팡이 오염 또는 세포 괴사)
제26군 0.2 0.0~0.2 ++ 54
제27군 0.2 4 - -
(세포 괴사)
도 6 및 표 5에 나타난 바와 같이 현탁배양 배지에 Cytokinin(BA)이 1 mg/mL 포함된 경우에는 약 3주 후 세포가 완전히 괴사하였음을 확인하였다(제21군).
또한 Auxin(2, 4-D)과 Cytokinin(BA)이 모두 포함되지 않은 현탁배양 배지를 사용한 제19군의 경우, 황색 캘러스가 서서히 노란빛을 잃다가 괴사하거나, 곰팡이 오염되어 사멸하는 것을 확인하였다.
이를 참고하면 현탁배지에 있어서 Cytokinin(BA)의 1 ㎎/㎖ 초과 함유되어 있는 경우, 캘러스에 독성으로 작용하여 괴사를 유도하는 문제가 발생할 수 있고, Auxin(2, 4-D) 및 Cytokinin(BA)가 모두 0 ㎎/㎖인 경우 캘러스의 현탁배양에 필수적인 성분의 부재로 증식이 충분히 일어나지 않으며, 곰팡이 오염에 취약해지게 되는 문제가 발생할 수 있다.
한편, Cytokinin(BA)만을 0.0, 0.1, 0.2 ㎎/㎖로 조절한 제20군의 경우에는 캘러스의 배양액의 증식률이 거의 유사하게 증식하였으며, 이를 통해 Auxin(2, 4-D) 0.2 ㎎/㎖, Cytokinin(BA)가 0.0~0.2 ㎎/㎖포함되어 있는 현탁배지를 이용하는 것이 바람직함을 확인하였다. 이 경우 6~7주 후에는 캘러스 배양물을 수확할만큼 충분히 증식되어 있음을 확인하였다. 필요에 따라 계대배양도 가능하다.
실험예 6. 블루베리 잎 유래 캘러스의 생산 ε- 비니페린 함량 및 함량비율 분석(최대 강화 배양)
1) 블루베리 잎 유래 캘러스 배양물 회수
본 실험에서는 실험예 4의 제11군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 증식배지에서 4차까지 계대배양하여 얻은 황색 캘러스(DY), 실험예 4의 제14군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 증식배지에서 4차까지 계대배양하여 얻은 황색 캘러스(LY) 및 제11군으로부터 유도된 블루베리 잎 유래 캘러스를 4차까지 계대배양하여 얻은 적색 캘러스(DR)을 이용하여 현탁배양을 수행하였다.
실험예 5에서 최적화한 현탁배양배지(auxin 0.2 ㎎/㎖ 및 cytokinin 0.0~0.2 ㎎/㎖ 혼합물, sucrose 30 g/l, CaCl2 30 mM(pH는 5.7)이 함유된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231))를 사용하였고, 이의 조성은 하기 표 6에 나타내었다. 액체배지는 고압 살균한 후 100 ml 삼각플라스크에 40 ml씩 분주하여 사용하였다. 상기 선별된 캘러스(LY, DY, DR)를 각각 무균상태에서 멸균된 메스를 사용하여 캘러스 덩어리를 곱게 다진 후 캘러스 400 mg을 40 ml의 액체 배지에 넣고 shaking incubator를 사용하여 25 ℃, 100 rpm, 암배양 조건으로 7주동안 현탁배양한 다음, 캘러스 배양물을 수확하였다.
3종류의 현탁배양배지에서 배양된 블루베리 유래 캘러스 배양물의 건조중량을 측정하여 표 6에 나타내었다.
표 6에서 사용한 캘러스는 LY, DY, DR로 표시하였고, 그 뒤의 숫자는 현탁배양배지의 auxin(2,4-D), cytokinin(BA)의 함량을 나타낸 것이다. 구체적으로 0.2/0.0은 auxin 0.2 ㎎/㎖과 cytokinin 0.0 ㎎/㎖이 혼합된 배지를 사용한 것이고, 0.2/0.1은 auxin 0.2 ㎎/㎖과 cytokinin 0.1 ㎎/㎖ 혼합된 배지를 사용한 것이며, 0.2/0.2는 auxin 0.2 ㎎/㎖과 cytokinin 0.2 ㎎/㎖ 혼합된 배지를 사용한 것이다.
2) 캘러스 추출물 제조
상기 3종류의 액체현탁 배양배지에서 배양된 캘러스 배양물에서의 테로스틸벤, 비니페린, 레스베라트롤의 함량을 분석하기 위하여, 추출물을 얻고자 하였다.
구체적으로 상기 3종류의 현탁 배양배지에서 배양된 캘러스 배양물은 수확하여 동결건조한 후 막자사발을 이용해 분쇄하여 사용하였다.
분말시료 3 g에 25 ml의 메탄올/HCl 0.1%용액을 가하여 현탁시킨 후 27℃에서 30분 초음파 추출하였다. 추출액을 원심분리장치(Centrikon T-324, Kontron, Milano, Italy)를 사용하여 10분간 12,000×g로 원심분리한 후 whatman filter paper No. 4로 여과하였고, 잔여물을 수거하여 같은 방법으로 재추출하였다. 여과액을 혼합한 후 40℃에서 감압농축(rotary evaporator, EYELA N-1110, EYELA, Tokyo, Japan)하여 용매를 제거하였다. 20 ml 증류수와 동량의 에틸아세테이트(ethylacetate)를 차례대로 첨가하여 4 ℃에서 10분간 방치하였다. 에틸아세테이트 층을 새로운 tube로 옮기고 잔여 증류수 층은 위와 같은 방법으로 2회 처리하였다. 모든 에틸아세테이트 층을 혼합한 후 40 ℃에서 감압농축(rotary evaporator, EYELA N-1110, EYELA, Tokyo, Japan)하였고, 농축물을 1 ml의 메탄올에 녹여 0.22 μm syringe filter로 여과 후 HPLC에 주입하였다.
구체적으로 블루베리 잎 대조구는 블루베리 조직배양묘의 잎을 사용한 것을 제외하고는 상기 추출과정과 모두 동일하게 수행하여 대조구를 얻었다.
3) HPLC 분석
레스베라트롤, 테로스틸벤, 비니페린에 대한 함량 분석은 종래 HPLC 분석법(Lyons et al. 2003)을 일부 수정하여 사용하였다. 구체적으로 HPLC 시스템(Agilent 1100 series)은 펌프, 인젝트, UV/VIS 검출기, 적분기(Chemstation software), 컬럼(Agilent eclipse XDB-C18: 4.6 mm x 250 mm, 5 μm, ZORBAX) 등으로 구성되었으며, 분석 조건은 하기 표 1에 나타내었다 0.1% formic acid가 첨가된 water(A)와 0.1% formic acid가 첨가된 acetonitrile(B)를 용매로 하여 구배(gradient) 조건 하에서 1.0 ml/min의 유동속도로 45분간 작동시켰다. 이때 시료 주입량은 20 μl이었고, 용매의 구배(gradient) 조건은 초기 90:10의 A/B 비율로 시작하여 30분까지 20:80 비율로 유지한 후 35분까지 90:10으로 조정되었으며, 마지막으로 10분 동안 90:10으로 유지하였다. 검출파장은 300 nm에서 측정되었고, 분석 칼럼의 오븐 온도는 25 ℃로 일정하게 하였다. 한편, 표준물질로는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)의 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈을 구입하여 사용하였고, Carbosynth (Berkshire, UK)의 비니페린을 사용하였다. 각 실험값은 5번 반복 측정의 평균으로 표시하였다.
5) 결론
캘러스의 최적 배양조건을 탐색하기 위해 블루베리 잎 추출물(대조구), 캘러스 추출물 내 스틸벤 4종(resveratrol, ε-viniferin, pinosylvin, pterostilbene)의 함량을 HPLC로 정량분석 하였고, 추출물 내에서 ε-비니페린이 차지하는 함량 비율을 계산하였다. 그 결과는 다음 표 6에 도시하였다.
구분 ε-비니페린 레스베라트롤 테로스틸벤 피노실빈
함량 함량비*
블루베리 잎
(대조구)		 1.00±0.12 24% 2.86±0.64 0.10±0.02 0.09±0.03
실험군 1
(LY_0.2/0.0)		 4.40±0.05
[4.4]		 82% 0.06±0.03
[0]		 0.56±0.02
[15.6]		 0.29±0.00
[3.2]
실험군 2
(DY_0.2/0.0)		 9.38±0.15
[9.4]		 90% 0.33±0.01
[0]		 0.37±0.03
[13.7]		 0.57±0.01
[6.3]
실험군 3
(DR_0.2/0.0)		 17.98±2.89
[18]		 65% 0.00±0.00
[0]		 8.91±1.30
[89.1]		 0.60±0.02
[6.7]
실험군 4
(LY_0.2/0.1)		 5.72±0.22
[5.7]		 81% 0.07±0.01
[0]		 0.93±0.04
[9.3]		 0.36±0.05
[4]
실험군 5
(DY_0.2/0.1)		 4.72±0.31
[4.7]		 82% 0.20±0.02
[0]		 0.16±0.04
[1.6]		 0.69±0.01
[7.7]
실험군 6
(DR_0.2/0.1)		 4.18±0.53
[4.2]		 61% 0.10±0.04
[0]		 0.95±0.03
[9.5]		 1.14±0.07
[12.7]
실험군 7
(LY_0.2/0.2)		 9.95±0.12
[10]		 90% 0.50±0.02
[0]		 0.50±0.13
[5]		 0.00±0.00
[0]
실험군 8
(DY_0.2/0.2)		 7.06±0.33
[7.6]		 85% 0.17±0.02
[0]		 0.23±0.02
[2.3]		 0.84±0.03
[9.3]
실험군 9
(DR_0.2/0.2)		 1.58±0.39
[1.6]		 40% 0.10±0.03
[0]		 0.72±0.06
[7.2]		 1.49±0.04
[16.6]
- 블루베리 잎(대조구) 추출물과 캘러스 추출물 내 레스베라트롤, ε-비니페린, 테로스틸벤 함량(μg/g DW) 및 대조구 대비 증폭률
* '함량비'는 추출물에서 ε-비니페린 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈의 총함량 중에서 ε-비니페린의 함량이 차지하는 비율을 나타낸 것이다.
표 6에 나타난 바와 같이, 캘러스 추출물에서 ε-비니페린, 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈의 함량을 분석하였다. 그 결과, 실험군 1, 2, 4, 5, 7, 8의 캘러스 추출물에 있어서, 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 대비 ε-비니페린(대조구 대비 4 배이상 증가된 함량)의 함량이 80% 이상 차지하고 있음을 확인하였다.
상기 암배양공정을 통해 얻은 불루베리 유래 적색 캘러스의 경우, 대조구 대비 높은 함량의 ε-비니페린을 포함하는 추출물을 제조할 수 있었으나, ε-비니페린을 제외한 테로스틸벤, 피노실빈 등의 유효성분들도 고함량으로 포함되어있는 것을 알 수 있다. 즉, 암배양 공정을 통해 얻은 블루베리 유래 적색 캘러스로부터 얻은 추출물에서는 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 ε-비니페린의 함량이 차지하는 비율이 40~65%로 현저히 낮으며, 80~90%의 높은 함량 ε-비니페린을 얻기 위해서는 수차례의 반복 정제공정을 수행하거나, 칼럼을 통한 고급 정제기술을 통해 다른 스틸벤 화합물을 제거하는 추가적인 단계를 수행하여야만, 비로서 다른 스틸벤 화합물에 비해 상대적으로 높은 ε-비니페린을 함유하는 추출물을 얻을 수 있다는 점에서 문제가 있다.
이에 반해 본 발명은 상술한 광배양 또는 암배양공정을 통해 얻은 블루베리 유래 황색 캘러스를 현탁배양하고, 이를 추출한 추출물의 경우(실험군 1, 2, 4, 5, 7, 8), 레스베라트롤, 테로스틸벤 및 피노실빈의 함량은 거의 확인되지 않았고, ε-비니페린(ε-viniferin)이 대조구 대비 4배 더 많이 함유되어 있으면서도, 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 ε-비니페린이 80% 이상의 높은 함량을 차지하는 추출물을 제조할 수 있음을 확인하였다.
이는 블루베리 조직체를 치상하여 황색 캘러스를 얻고, 현탁배양하는 단순 배양하는 과정과 일반적인 추출공정만으로, 쉽고 단순하게 함량이 증가된 ε-비니페린을 얻을 수 있다.
실험예 7. 블루베리 잎 유래 캘러스의 생산 ε- 비니페린 함량 분석(신속 강화 배양)
1) 블루베리 잎 유래 캘러스 유도 및 증식
본 발명에서는 대표적인 블루베리 품종인 오닐 또는 듀크를 사용할 수 있으나, 본 발명에서는 오닐 품종으로부터 캘러스를 유도하였다. 오닐 품종의 블루베리 조직배양묘의 잎(young leaves)을 채취하여 5 x 5 mm 크기로 절취한 다음 각각의 조직을 배양배지에 치상하였다.
이때 사용된 캘러스 유도용 배지는 앞선 실험을 통해 최적화된 조건의 배지를 사용하였다(auxin 0.5 ㎎/㎖과 cytokinin 0.2 ㎎/㎖ 혼합), sucrose 30 g/l, gelite 4 g/l(pH는 5.8)이 함유된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231).
배양조건은 온도 26℃, 습도 60%의 growth chamber에서 암배양 조건으로 5 주 또는 12 주 동안 캘러스 유도를 위한 고체배양을 실시한 후, 계대배양하거나, 바로 현탁배양하였다. 캘러스 배양의 경우 독립적인 5회 반복실험을 수행하였고, 현탁배양의 경우 6-9회 반복실험을 진행하였다.
2) 캘러스 배양물 제조
상기 1) 단계로부터 회수한 블루베리 잎 유래 캘러스를 하기 표 7에 나타낸 배양조건으로 현탁배양하였다.
이때 사용된 현탁배양을 위한 액체배지는 앞서 실험예에서 최적화한 조건으로 제조된 것을 사용하였다((auxin 0.2 ㎎/㎖), sucrose 30 g/l, CaCl2 30 mM(pH는 5.7)이 함유된 MS(Murashige & Skoog) medium including B5 vitamins(M0231)). 액체배지는 고압 살균한 후 100 ml 삼각플라스크에 40 ml씩 분주하여 사용하였다. 무균상태에서 멸균된 메스를 사용하여 캘러스 덩어리를 곱게 다진 후 캘러스 400 mg을 40 ml의 액체 배지에 넣고 shaking incubator를 사용하여 25 ℃, 100 rpm, 암배양 조건으로 7주동안 현탁배양하였다.
3) 캘러스 추출물 제조
상술한 과정을 통해 회수한 블루베리 잎 유래 캘러스 배양물로부터, 추출물을 얻고자 하였다. 상기 블루베리 잎 유래 캘러스 배양물은 수확 즉시 동결건조한 후 막자사발을 이용해 분쇄하여 사용하였다.
분말시료 3 g에 25 ml의 메탄올/HCl 0.1%용액을 가하여 현탁시킨 후 27℃에서 30분 초음파 추출하였다. 추출액을 원심분리장치(Centrikon T-324, Kontron, Milano, Italy)를 사용하여 10분간 12,000×g로 원심분리한 후 whatman filter paper No. 4로 여과하였고, 잔여물을 수거하여 같은 방법으로 재추출하였다. 여과액을 혼합한 후 40℃에서 감압농축(rotary evaporator, EYELA N-1110, EYELA, Tokyo, Japan)하여 용매를 제거하였다. 20 ml 증류수와 동량의 에틸아세테이트(ethylacetate)를 차례대로 첨가하여 4℃에서 10분간 방치하였다. 에틸아세테이트 층을 새로운 tube로 옮기고 잔여 증류수 층은 위와 같은 방법으로 2회 처리하였다. 모든 에틸아세테이트 층을 혼합한 후 40℃에서 감압농축(rotary evaporator, EYELA N-1110, EYELA, Tokyo, Japan)하였고, 농축물을 1 ml의 메탄올에 녹여 0.22 μm syringe filter로 여과 후 HPLC에 주입하였다.
구체적으로 블루베리 잎 대조구는 블루베리 조직배양묘 잎을 사용한 것을 제외하고는 상기 추출과정과 모두 동일하게 수행하여 대조구를 얻었다.
4) HPLC 분석
레스베라트롤, 테로스틸벤, 비니페린에 대한 함량 분석은 종래 HPLC 분석법(Lyons et al. 2003)을 일부 수정하여 사용하였다. 구체적으로 HPLC 시스템(Agilent 1100 series)은 펌프, 인젝트, UV/VIS 검출기, 적분기(Chemstation software), 컬럼(Agilent eclipse XDB-C18: 4.6 mm x 250 mm, 5 μm, ZORBAX) 등으로 구성되었으며, 분석 조건은 상기 표 1에 나타내었다 0.1% formic acid가 첨가된 water(A)와 0.1% formic acid가 첨가된 acetonitrile(B)를 용매로 하여 구배(gradient) 조건 하에서 1.0 ml/min의 유동속도로 45분간 작동시켰다. 이때 시료 주입량은 20 μl이었고, 용매의 구배(gradient) 조건은 초기 90:10의 A/B 비율로 시작하여 30분까지 20:80 비율로 유지한 후 35분까지 90:10으로 조정되었으며, 마지막으로 10분 동안 90:10으로 유지하였다. 검출파장은 300 nm에서 측정되었고, 분석 칼럼의 오븐 온도는 25 ℃로 일정하게 하였다. 한편, 표준물질로는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)의 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈을 구입하여 사용하였고, Carbosynth (Berkshire, UK)의 비니페린을 사용하였다. 각 실험값은 5번 반복 측정의 평균으로 표시하였다.
5) 결론
본 실험예에서는 블루베리 유래 캘러스의 추출물을 확보하는데 있어서, 배양 단계를 생략하여 빠르게 고함량의 ε-비니페린을 함유하는 추출물을 제조할 수 있는 방안을 검토하고자 한 것이다.
상기 과정을 통해 회수한 캘러스 추출물과 대조구의 스틸벤 목표물질 4종(resveratrol, ε-viniferin, pinosylvin, pterostilbene)의 함량을 HPLC로 정량분석한 후, 추출물에서 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 ε-비니페린의 함량이 차지하는 비율을 계산하였고, 그 결과는 다음 표 7에 도시하였다.
구분 배양조건
(유도->증식)		 ε-비니페린 레스베라트롤 테로스틸벤 피노실빈
함량 함량비**
블루베리 잎
(대조구)		 2.65±0.48 35% 4.78±0.36 0.0048±0.00 0.01±0.01
실험군 10 치상하고 5주 후 계대배양(5주, 1회) → 7주 현탁배양 3.89±0.37
[1.47]		 75% 1.07±0.11
[0]		 0.12±0.01
[25.78]		 0.10±0.03
[20.31]
실험군 11 치상하고 12주 배양 → 7주 현탁배양 27.56±3.87
[10.41]		 76% 8.25±1.19
[1.72]		 0.18±0.02
[37.85]		 0.00±0.00
[0]
실험군 12 치상하고 5주 배양 → 7주 현탁배양 30.26±2.14
[11.43]		 94% 1.25±0.05
[0]		 0.25±0.01
[51.9]		 0.12±0.01
[24.03]
- 블루베리 잎(대조구) 추출물과 블루베리 유래 캘러스 추출물 내 레스베라트롤, ε-비니페린, 테로스틸벤 함량(μg/g DW) 및 대조구 대비 증폭률
** '함량비'는 추출물에서 ε-비니페린 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈의 총함량 중에서 ε-비니페린의 함량이 차지하는 비율을 나타낸 것이다.
표 7에 나타난 바와 같이, 블루베리 유래 캘러스 추출물에서 스레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 대비 ε-비니페린, 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈의 함량과 ε-비니페린이 차지하는 함량 비율을 각각 분석하였다. 그 결과, 실험군 12의 블루베리 유래 캘러스 추출물이 각각 가장 높은 ε-비니페린 함량을 포함함과 동시에 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 대비 ε-비니페린이 90% 이상의 높은 함량을 차지하고 있음을 확인하였다.
상술한 암배양공정을 통해 얻은 블루베리 유래 황색 캘러스(초기 캘러스)를 현탁배양하고, 이를 추출한 추출물의 경우(실험군 11), 블루베리 잎 대조구에 비해 ε-비니페린(ε-viniferin)이 10배 더 많이 함유되어 있는 것을 확인하였으나, 다른 유효성분의 함량이 높아 ε-비니페린이 차지하는 함량이 76%로, 실험군 12에 비해 20%가량 더 낮은 것을 확인하였다.
추출물의 경우 특정 물질의 함량 비율을 단 1%라도 높이기 위해서는 수회의 반복 정제공정이나, 고급의 정제기술이 요구되며, 특히 유사한 기능과 구조의 물질 중에서 특정 물질이 차지하는 함량 비율을 높이기 위해 추가적인 공정의 도입이 필수적이고, 공정의 도입은 대량생산 효율 저하와 직결되기 때문에, 관련된 다양한 문제가 야기될 수 있다. 이에 본 발명은 배양 조건의 제어와 최소한의 정제공정을 통해 원하는 물질을 높은 함량으로 포함하는 추출물을 얻고 있다는 점에서 해당분야에서 유의미한 범주에서 현저한 효과를 달성한 것이라 할 것이다.
또한, 높은 함량의 ε-비니페린을 포함하는 추출물을 제조함에 있어서, 상술한 정제공정 과정을 거치면 거칠수록 목적으로 하는 ε-비니페린 역시 손실이 발생하게 되어, 스틸벤 화합물 중에서 ε-비니페린이 차지하는 함량 비율은 높으나 대조구 대비 함량은 크게 높지 않은 경우가 존재한다. 본 발명의 경우에는 동일원료를 사용하여, 레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 ε-비니페린이 90% 이상의 함량을 차지하면서, 대조구 대비 10 배 이상의 증가된 함량을 갖는 ε-비니페린이 존재하는 블루베리 잎 유래 캘러스 추출물을 제조하였다.
즉, 원료 자원 내에서 ε-비니페린의 생성량을 증가시켜, 동량의 원료로부터 단순 배양 및 일반 정제공정을 통해 친환경적으로 고함량의 ε-비니페린을 확보할 수 있다.
특히 본 발명의 블루베리 잎 유래 캘러스 추출물은 단순 배양과정과 일반적인 정제공정만으로 스레스베라트롤, 테로스틸벤, 피노실빈 및 비니페린의 총 함량 중에서 ε-비니페린 함량이 80%~90% 이상 차지하는 추출물을 얻을 수 있을뿐만 아니라, 계대배양 후 확립된 블루베리 유래 캘러스를 현탁배양한 경우(실험군 1-9)에 비해 1~5개월 바람직하게는 4개월을 단축시킬 수 있다는 장점을 갖는다.
실험예 8. 실험군 10~12의 블루베리 유래 캘러스의 유전자 발현 분석
1) 실험군 10~12의 블루베리 유래 캘러스 및 이의 배양물 준비
실험예 8의 실험군 10에 언급한 바와 같이 치상 5주 후 계대배양 → 계대배양 5주 후 현탁배양(5주, 1회)→ 현탁배양 7주 후 수확하여 캘러스와 캘러스 배양물을 준비하였다. 실험예 8의 실험군 11에 언급한 바와 같이 치상 12주 후 현탁배양 → 현탁배양 7주 후 수확하여 캘러스와 캘러스 배양물을 준비하였다. 실험예 8의 실험군 12에 언급한 바와 같이 실험예 8에 언급한 바와 같이 치상 5주 후 현탁배양 → 현탁배양 7주 후 수확하여 캘러스와 캘러스 배양물을 준비하였다.
2) RNA 분리
대조구로서 블루베리 오닐 품종의 조직배양묘 잎을 사용하였고, 실험군 10~12의 블루베리 유래 캘러스(암배양 조건에서 유도된 황색 캘러스) 및 이의 배양물을 사용하였다. 모든 시료는 수확 직후 액체 질소로 급냉시킨 뒤, -80℃에 보관하였다.
시료로부터 total RNA를 추출하기 위해, 종래 Gambino 등(2008)의 CTAB 방법을 수정하여 사용하였다. -80℃에 보관되어 있는 시료를 막자사발에 옮겨 고운 가루로 만든 후, 약 100 mg 당 900 μl의 extraction buffer를 첨가한 다음, 65℃에서 10분간 반응시켰다. 이후 동량의 클로로포름:이소아밀알코올(chloroform:Isoamylalcohol)(24:1, v/v)을 첨가하여 혼합시킨 뒤 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 상등액을 새로운 tube로 옮긴 후 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고, 4 ℃에서 13,000 rpm으로 10 분간 원심분리 하였다. 다시 상등액 650 μl을 새로운 tube에 담고 4 M LiCl를 280 μl을 혼합한 후 4℃에서 12~14 시간 정치시킨 다음 원심분리하였다. Pellet에 SSTE buffer 500 μl를 넣고 녹인 다음 4℃에서 13,000 rpm으로 10 분간 원심분리 하였다. 상등액 300 μl을 새 tube로 옮긴 다음, 차가운 100% ethanol 900 μl을 넣고 -70℃에서 30분 정치시켰다. 4 ℃에서 13,000 rpm으로 30 분간 원심분리 한 후 상등액을 제거하였고 같은 방법으로 70% ethanol를 사용하여 pellet을 다시 세척하였다. 마지막으로 30 μl의 DEPC 처리하고, 멸균 증류수에 녹여서 -80℃에 보관하며 사용하였다. 추출한 RNA의 정량 및 정성분석은 DeNovix DS-11+ Spectrophotometer (DeNovix, Wilmington, DE, USA)와 1.2%(v/v) agarose gel electrophoresis로 수행하였다.
3) cDNA 합성
추출한 total RNA 2 또는 4 μg을 사용하여 다음과 같은 방법으로 역전사 반응을 수행하였다. 2 또는 4 μg RNA, 1 μl oligo dT (500 ng/μl)를 혼합한 후, DEPC-treated distilled water(D.W.)로 전체 부피를 12.5 μl로 맞추고, RNA 시료의 이차구조를 제거하기 위해 65℃에서 5분간 처리하였다. 이 후, 4 μl 5X reaction buffer, 2 μl dNTPs (10 mM each dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0.5 μl RNase inhibitor (20 u/μl), 1 μl RevertAid Reverse Transcriptase (200 u/μl; Thermo Scientific)를 첨가하여 최종 부피를 20 μl로 맞추고, 42℃에서 60분 동안 역전사 반응을 수행한 후, 70℃에서 10분간 처리하여 효소 활성을 제거하였다. 이후, 합성된 cDNA는 D.W.를 첨가하여 25 ng/μl의 농도로 희석한 후, 4℃에서 보관하였다.
4) 프라이머 서열
본 실험에서 사용된 프라이머(primer)는 다음 표 8에서와 같다.
유전자 프라이머 이름 프라이머 서열
(5'->3')		 증폭물 크기
(amplicon size)(bP)
ROMT1 ROMT1-F CCATAGCCGATGCTTTCCCGAAC 136
ROMT1-R ACAGCATCAGTAGAAGGAATCGCTTG
ROMT2
 ROMT2-F AGGCCATAGCCTATGCTTTTCCAAAA 139
ROMT2-R ACAGCATCAGCAGTAGGAATAGCTTC
GAPDH
 GAPDH-F TGGTCATCTCTGCCCCAAG 122
GAPDH-R ACAGTTAGTAGTGCAGCTAGCATTG
5) RT- PCR
PCR 조건은 95℃에서 5분간 열변성한 후, 95℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 45초 과정을 30-40회 반복하였고, 구체적은 조건은 하기 표 9에 나타내었다.
Description Temp. Time Cycles
Initial denaturation 95℃ 5 min 1
Deneturation 139
GAPDH GAPDH-F TGGTCATCTCTGCCCCAAG 122
GAPDH-R ACAGTTAGTAGTGCAGCTAGCATTG
6) Real-time PCR
Real-time PCR은 통계분석을 위해 합성된 cDNA 주형에 대해 3회 반복(3 technical replicates)하여 수행하였다. PCR 반응 전, 제공받은 프라이머들의 dissociation curve를 분석하여, 프라이머의 특이성을 확인하였다. 이 후, PCR 반응은 3 μl cDNA mix (25 ng/μl), 0.8 μl gene-specific primers (forward, reverse 각각 10 pmol/μl), 0.2 μl ROX reference dye (100X), 10 μl 2x Power Green qPCR Mix (Dongsheng Biotech., Guangzhou, China), 6 μl 멸균 증류수를 혼합한 후, LightCyclerㄾ 480 II real-time PCR system (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)에서 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 열변성한 후, 95℃ 15초, 56℃ 20초, 72℃ 30초 과정을 45회 반복하였고, 증폭 결과는 comparative CT method를 이용하여 2-(Ct target gene ?? Ct GAPDH) 값을 계산하여 분석하였다.
7) 결론
도 7은 실험군 10~12의 블루베리 유래 캘러스 및 이의 배양물로부터 추출한 총 RNA의 아가로스 겔 전기영동 실험결과이고, 표 10은 실험군 10~12의 블루베리 유래 캘러스로부터 추출한 총 RNA의 정량분석 결과이다.
도 7에서 A는 대조구이고, B1-1은 실험군 10_캘러스이고, B1-2은 실험군 11_캘러스이며, B1-3은 실험군 12_캘러스이다. C1-1은 실험군 10_캘러스 배양물이고, C1-2은 실험군 11_캘러스 배양물이며, C1-3은 실험군 12_캘러스 배양물이다.
구분 con. (ng/㎕) 260/280 260/230
대조구 349.27 1.835 1.985
실험군 10_캘러스 1414.385 1.97 2.23
실험군 11_캘러스 1183.065 1.965 2.28
실험군 12_캘러스 1892.895 1.985 2.295
실험군 10_캘러스 배양물 1331.405 1.96 2.135
실험군 11_캘러스 배양물 752.515 1.9 2.09
실험군 12_캘러스 배양물 1213.74 1.95 2.155
도 8은 블루베리 유래 캘러스의 RT-PCR 결과로, M은 마커이고, FP는 블루베리 과피이고, LF는 블루베리 잎(대조구)이며, CA는 실험군 10의 블루베리 유래 캘러스이다.
기존에 알려져있는 블루베리 ROMT 유전자 2가지(ROMT1, ROMT2)가 블루베리 조직 내에서 정상적으로 발현되는지 여부를 semi-quantitative RT-PCR를 통해 확인한 결과, 블루베리 잎과 과피에서 ROMT1만이 정상 발현되었음을 확인하였다.
도 9는 실험군 10~12의 블루베리 조직배양묘 잎 유래 캘러스 및 이의 배양물의 qPCR 결과 그래프(Dissociation curve)로, 이는 상기 3) 과정을 통해 합성된 cDNA를 주형으로 하여(2 μl, 4 μl, 6 μl 테스트) ROMT1과 GAPDH 프라이머의 dissociation curve를 분석한 결과이다. GAPDH 프라이머의 경우 noise peak가 관찰되지 않아서 qPCR을 수행하기에 적합한 프라이머로 판단되었다. ROMT1 프라이머의 경우, noise peak가 관찰되나, 서열 정보의 제한으로 다른 부위에서 프라이머를 재디자인 할 수가 없고, noise peak의 값이 높지 않은 것으로 판단되어 qPCR을 수행하였다.
앞선 실험을 통해 실험군 10~12의 블루베리 유래 캘러스와 이의 배양물 내에 비니페린, 테로스틸벤의 함량이 대량으로 생산되고 있음을 확인하였다. 이러한 유효성분의 대량생산이 유전적으로 관련성이 있는지를 확인하기 위하여, 스틸벤 합성에 관여하는 ROMT 효소 유전자 발현을 비교 분석하였다. 분석결과, 대조구인 잎에서는 ROMT가 발현되었으나, 실험군 10, 11, 12의 블루베리 유래 캘러스에서는 발현되지 않았다. 그런데 실험군 10, 11, 12의 블루베리 유래 캘러스의 배양물에서는 다시 발현되는 것으로 확인되었다.
이를 통해 본 발명에서와 같이 유도 및 증식된 블루베리 유래 캘러스는 ROMT 유전자가 발현되지 않으나, 이를 현탁배양한 캘러스 배양물에서는 ROMT가 다시 발현되고 있음을 확인하였다.
상기 현탁배양한 캘러스 배양물에서는 레스베라트롤은 함량은 높지 않으나, 비니페린과 테로스틸벤의 함량은 10 배 이상으로 현저히 증가한 것을 확인하였는 바, 이는 실험군 10, 11, 12의 블루베리 유래 캘러스는 고체 배지 위에서 배양된 것인데 반해, 캘러스 배양물은 다양한 배양 조건들이 변화함으로써, 유전자 발현에 차이를 갖게된 것으로 여겨진다.
즉, 현탁 배양 과정이 비니페린과 테로스틸벤 등의 유효성분을 과량 생성하도록 유도함에 있어서, 매우 중요한 역할을 수행하고 있음을 나타내는 것으로, 현탁 배양 과정없이 고체배지를 통해 유도된 캘러스를 바로 추출할 경우 비니페린과 테로스틸벤 등의 유효성분을 얻을 수 없는 문제가 발생할 수 있음을 암시하는 것이다. 따라서, 본 발명에서 제안하고 있는 전반적인 공정 및 조건에 따라 캘러스 배양물을 제조하고, 이로부터 추출물을 회수하여야 대조구에 비해 약 89배 이상의 유효성분을 대량 얻을 수 있다. 이는 투자되는 시간 및 배양 비용 대비 현저히 우수한 효능임을 알 수 있다. 빠른 회수를 위해서는 얻을 수 있는 유효성분의 함량이 저하되나, 계대배양 과정을 생략하여 수행될 수 있고, 이는 1~5개월의 시간을 단축할 수 있다는 점에 장점이 있다. 다만 현탁 배양을 생략하거나, 상술한 과정에 있어서 조건이 벗어날 경우에는 원활하게 캘러스를 얻을 수 없고(괴사하거나 곰팡이 오염될 가능성이 높음), 증식률이 낮거나 증식속도가 느려 배양에 더 많은 시간이 소요될 수 있으며, 얻고자하는 비니페린과 테로스틸벤 등의 유효성분 함량이 대조구보다 동등하거나 현저히 낮은 수준으로 떨어져 본 발명의 목적을 달성할 수 없게되는 문제가 발생할 수 있다.
또한 본 발명은 배양과정에 있어서, 어떠한 균이나 화합물의 첨가가 이루어지지 않으며, 유전자 변형과 같은 외부적인 요인이 관여하지 않는, 매우 친환경적 제조공정임에도 불구하고, 대조구에 비해 현저히 우수하게 증가된 비니페린과 테로스틸벤 등의 유효성분을 얻을 수 있다는 장점이 있다.

Claims (10)

  1. ⅰ) 블루베리 조직체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 블루베리 캘러스를 유도하는 단계;
    ⅱ) 상기 유도된 블루베리 캘러스를 증식배지에서 증식시키는 단계; 및
    ⅲ) 상기 증식된 캘러스 배양물을 수득하여 추출하는 단계;를 포함하는 함량이 증가된 ε-비니페린을 함유하는 캘러스 추출물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 블루베리 괴피 또는 잎인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 ⅰ) 단계의 블루베리 조직체는 0.5-5% 계면활성제로 5 분 동안 세척하고, 물로 0.5-6 시간 처리한 후, 70% EtOH 10-60 초 동안 처리하고, 0.5-1.5% NaOCl 0.1-10 분 동안 세척하는 표면살균처리 단계를 거친 블루베리 식물체의 조직 일부를 분리한 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 ⅰ) 단계와 ⅱ) 단계 사이에, 유도된 블루베리 캘러스를 고체배지에서 계대배양하여 증식시키는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 계대배양은 3 내지 6주 간격으로 4 내지 5회 계대배양한 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 ⅰ) 및 ⅱ) 단계의 캘러스 유도 배지 및 증식배지에는 옥신, 사이토키닌 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 생장조절제가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 옥신은 0.1 내지 1.0 ㎎/㎖의 농도로, 상기 사이토키닌은 0.0 내지 0.2 ㎎/㎖의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 ⅰ) 및 ⅱ) 단계는 광배양 또는 암배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 ⅲ) 단계는 초음파 추출, 용매 추출 및 분배추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 추출법을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 ⅲ) 단계를 통해 얻은 블루베리 유래 캘러스 배양물의 추출물을 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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