KR101307202B1 - Ｐｐｔ계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 ｃｒｍｇ５ 및 이의 생산방법 - Google Patents

Ｐｐｔ계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 ｃｒｍｇ５ 및 이의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형된 SH(Schenk & Hildebrandt)배지에서 배양하여 제조되는 PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근　및　이의　생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른, 산삼 배양근 생산방법을 이용하면, 본 발명에 따른, 산삼 배양근 생산방법을 이용하면, PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근을 얻을 수 있는 효과가 있다.

Description

ＰＰＴ계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 ＣＲＭＧ５ 및 이의 생산방법{Cultured root of Mountain ginseng CRMG 5 with improved content of PPT type saponin and method of producing the same}
본 발명은 변형된 SH(Schenk & Hildebrandt)배지에서 배양하여 생산되는, PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 CRMG 5 및 이의 생산방법에 관한 것이다.
재배인삼의 기원식물이라 할 수 있는 산삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 우리나라 한방의약품으로 오랫동안 이용되어 온 전통약용 식물로, 약리효능을 과학적으로 인정받아 그 수요가 증가하고 있다.
산삼은 단백질과 핵산의 생합성 촉진, 간 기능 회복, 항암 및 항산화 효과 등이 탁월한 것으로 알려져 있으며, 구체적으로 신체조절기능의 항상성 유지 작용을 근거로 한, 항피로 및 항스트레스 작용, 항당뇨 작용, 혈압조절 작용, 항암 작용, 동맥경화 및 고혈압 예방, 두뇌기능 강화, 위장기능 강화, 면역기능 강화, 성기능 강화, 항바이러스와 관련된 효과가 알려져 있다. 또한 극한 환경조건에서 자라면서 생성되는 스트레스 산물인 사포닌을 비롯한 몇 가지 특정 생리활성 성분에 대해서 생체 내에서의 작용기전도 보고되었다.
그러나 산삼은 오래된 것일수록 희소가치가 커 매우 고가이며, 자연상태에서 채취되는 양이 매우 적어 입수의 어려움이 있으므로 수요에 비해 안정적인 공급이 어려운 문제점이 있다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 토양미생물인 아그로박테리움(Agrobacterium rhizogenes) 균주를 이용하여 산삼 조직으로부터 모상근을 유도하여 특정 진세노사이드(ginsenosides)를 대량으로 생산하는 연구가 진행 되어 왔으나 이는 GMO이기 때문에 식품으로서 사용 할 수 없으며, 산업적으로 사용하는데 많은 시간이 소용되고 있다. 따라서 GMO가 아닌 순수한 산삼의 기내 줄기세포를 만들어 대량으로 증식시키고자 하는 연구가 진행되었고, 이를 위해 오래된 산삼을 채취하여 산삼 뿌리 조직을 배양하여 산삼과 동일한 유효 성분을 함유한 산삼 배양근을 대량 생산하기 위한 노력이 많이 이루어지고 있다. 생물반응기를 이용한 산삼 배양근의 대량배양은 이차 대사과정에서 생성되는 유용물질을 대량 생산할 수 있으며, 세포의 생장이 빠르며 유효성분도 다량 함유하고 있으므로 특정 생리활성성분을 대량으로 생산하는데 효과적인 장점이 있다.
사포닌은 콩, 파, 더덕, 메밀, 도라지, 미나리, 녹두, 마늘, 양파, 은행, 칡 등 다양한 식물에 소량 함유되어 있지만, 삼의 사포닌은 약성이 온화하고 독성이 없으며 용혈작용이 거의 없다는 면에서 다른 식물의 사포닌과 구별되고 있다. 특히, 삼의 사포닌은 타 식물의 사포닌과 화학 구조가 상이하여 진세노사이드(Ginsenoside)라는 명칭으로 구별되고 있다.
인삼은 보허약 중에서도 성질이 온하여, 기를 보해주는 보기약으로 사용하고 있다. 보기약은 복용 시, 기를 보해주기 위해서 혈류량을 빠른 시간에 증가시키고, 신진대사를 증진시켜 말초혈관까지 전달해주기 때문에, 중추신경 흥분작용, 뇌 기능활성작용을 나타나게 된다. Rb1으로 대표되는 PPD계 사포닌은 중추신경에 대한 억제작용을 나타내어 정신안정, 신경이완, 진통, 항경련, 혈압강하 작용 등을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이에 반해, Rg1으로 대표되는 PPT계 사포닌은 중추신경에 대해 흥분적으로 작용하여, 항피로작용이 있는 것으로 알려져 있어 체내에서 각기 다른 작용을 하게 되는데 상기와 같은 보기약의 성질을 가지고 있는 것이 고려 인삼의 PPT타입 사포닌으로 보고되고 있다. 미국과 캐나다에서 주로 재배되고 있는 화기삼(북미삼)의 경우에는 인삼사포닌이 고려인삼보다 훨씬 많이 함유되어 있으나, PPT 타입 사포닌은 적은 것으로 알려져 있다.
이처럼 전통 약용 식물로 유익한 산삼을 산삼 배양근을 이용하여 대량 생산하고, 이와 동시에 산삼에 들어있는 사포닌, 특히 PPT 타입 사포닌의 함량을 증대시킬 수 있다면, 산삼을 안정적으로 공급할 수 있을 뿐만 아니라, 산삼이 가지고 있는 약리활성을 극대화 시킬 수 있는 장점이 있으므로, PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근에 관한 연구가 필요하다.
본 발명자들은 PPT 계열 사포닌의 함량이 증대된 산삼 배양근을 생산하기 위한 방법에 관해 연구하던 중, 변형된 특수 배지에서 산삼 배양근을 배양한 경우, PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 새로운 산삼 배양근을 얻을 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 및 이를 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 CRMG 5 및 이를 생산하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 산삼 배양근 CRMG 5 또는 이의 농축액을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른, 산삼 배양근 생산방법을 이용하면, PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근을 얻을 수 있는 효과가 있다.
도 1은 야생 산삼의 살균 및 소독 공정을 나타낸 도이다.
도 2는 고체 배지에 접종된 산삼의 뿌리 절편체에서 산삼의 뿌리가 효과적으로 유도되는 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 접종된 산삼 뿌리에서 유도된 부정근을 계대 배양하여 생육이 우수하고 부정근 유도가 잘 되는 산삼 배양근을 선별하는 공정을 나타낸 도이다.
도 4는 액체 배양계를 유도하기 위하여, 산삼 배양근의 근단을 액체플라스크 배지에 접종 한 후, 배양된 산삼 배양근의 생장 모습을 나타낸 도이다.
도 5는 특수 배지를 포함하는 18.9L 생물 배양기(A) 및 이를 통해 얻어진 대량 배양을 위한 종근(seed)(B)을 나타낸 도이다.
도 6은 산삼 배양근의 종자를 이용하여 산삼 배양근의 농축액을 제조하는 공정을 나타낸 모식도이다.
본 발명은 변형된 SH(Schenk & Hildebrandt)배지에서 배양하여 생산되는, PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 CRMG 5 및 이의 생산방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은
1) CoCl2·6H2O 및 이노시톨(inositol)을 포함하는 SH(Schenk & Hildebrandt)배지에서 CoCl2·6H2O　및 이노시톨(inositol)을 제거한 다음, 여기에 수크로오스　및 소량의 인돌부티르산(indole butyric acid; IBA)을 첨가하여 제조한 배지에 산삼 배양근을 접종하는 단계; 및 2) 접종된 산삼 배양근을 5 내지 7주 동안 배양하는 단계; 를 포함하는, PPT(Protopanaxatriol) 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산되고, PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 CRMG 5을 제공한다.
이하, 본 발명의 산삼 배양근의 생산 방법에 대하여 단계별로 상세히 설명한다.
상기 1) 단계는 야생 산삼을 채취하여 살균 및 소독한 후, 멸균된 산삼의 뿌리를 배양하여 유도된 산삼 배양근 중에서 선별된 고 기능성 산삼 배양근을 CoCl2·6H2O 및 이노시톨을 포함하는 SH(Schenk & Hildebrandt)배지에서 CoCl2·6H2O 및 이노시톨을 제거한 다음, 여기에 수크로오스　및 인돌부티르산(indole butyric acid; IBA)을 첨가한 배지에 치상, 접종하는 단계이다.
본 발명의 “SH 배지”란 단자엽과 쌍자엽 식물 양쪽에서 캘러스를 유도하고 배양하기 위해 개발된 배지로써, 본 발명의 SH 배지는 상용 SH 배지를 3/4 농도로 조절한 변형된 SH 배지인 것이 바람직하다. 또한 구체적으로, 본 발명의 변형된 SH 배지는 기존 SH 배지와 비교하여 CoCl2·6H2O 및 미오이노시톨(myo-inositol)을 제거하고, 수크로오스 및 인돌부티르산(indole butyric; IBA)을 첨가한 배지를 포함한다.
“산삼 배양근”이란 야생 산삼의 조직을 분리한 후 식물조직 배양기술을 이용하여 생물공학적으로 산삼의 부정근을 다량 배양한 것으로 이는 천연 산삼과 유전자 염기서열이 실질적 동일성이 유지되는 것을 특징으로 한다.
상기 “수크로오스”는 2 내지 7 중량%/L로 배지에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 3 중량%/L로 배지에 포함된다.
상기 “인돌부티르산”은 1 내지 3mg/L로 배지에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 2mg/L로 배지에 포함된다.
상기 2) 단계는 접종된 산삼 배양근을 5 내지 7주 동안 25±3℃, 실내 습도 40% 전후의 조건에서 배지에 무균 접종하여 배양하는 단계이다. 바람직하게 상기 배양은 6주 동안 이루어질 수 있다.
상기와 같은 변형된 SH 배지를 이용한 산삼 배양근의 생산 방법에 따르면, 기존 상용 SH 배지를 사용하는 것과 비교하여 산삼 배양근 생산 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 상기의 배지에서 산삼 배양근을 배양하여 PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 새로운 산삼 배양근을 얻을 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 상기의 생산 방법으로 생산된, PPT(Protopanaxatriol) 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 CRMG 5을 제공한다.
본 발명의 산삼 배양근 CRMG 5에는 PPD(Protopanaxadiol) 계열 사포닌: PPT(Protopanaxatriol) 계열 사포닌이 1: 2 내지 1:5 비율로 존재하여 기존의 산삼과 달리 PPT 타입 사포닌 함량이 매우 높아 기존의 산삼 배양근과 다른 사포닌 함량을 갖는 특징이 있다.
상기의 산삼 배양근 CRMG 5은 일반 산삼에는 많이 들어있지 않은 PPT 계열 사포닌 성분인 Re, Rf, Rg1 및 Rg2로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 사포닌의 함량이 증대된 산삼 배양근이다.
또한 상기 “Re”는 중추신경억제를 통한 진통 작용, 항스트레스 작용, 부신 피질 호르몬의 분비 촉진, 중성지방의 분해 촉진, 콜레스테롤의 대사 촉진, 간장 보호 작용이 있는 사포닌으로 알려져 있으며, “Rf”는 뇌의 발육 보호, 중추성 및 말초성 진통 작용, 과산화 지질 생성 억제를 통한 세포 노화 억제 작용을 하는 사포닌으로 알려져 있다. 또한 상기 “Rg1”은 면역 기능을 증진시키고 피로를 회복시키며, 항혈전 작용이 있는 것으로 알려져 있다.
상기의 산삼 배양근 CRMG 5는 1회 최고 투여량인 2,000 mg/kg를 복강 내 투여하여도, 유전 독성을 유발하지 않고, 경구 투여에서도 독성을 나타내지 않는 안전한 산삼 배양근일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 CRMG 5 또는 이의 농축액을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
상기 PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 CRMG 5 농축액은 당업계에 공지된 농축 가공방법을 제한없이 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 또는 이의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 산삼 배양근의 유도
1.1 산삼 뿌리의 살균
채취한 야생 산삼의 뿌리를 멸균수로 세척하여 표면의 흙을 제거하고, 표면의 미생물을 제거하기 위하여 70% 에탄올로 1분간 처리하여 1차 살균한 후, 멸균 증류수로 3회 세척하였다. 세척된 산삼을 다시 무균작업대(clean bench) 안에서 멸균 증류수로 희석된 10% 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 25분간 담궈 2차 살균을 실시하고 멸균 증류수로 3회 세척하였다. 2차 살균과정을 거친 산삼 뿌리의 물기를 멸균된 3mm 와트만 여과지(Whatman paper)를 이용하여 제거하였다. 야생 산삼의 살균 및 소독 공정을 도 1에 나타내었다.
1.2 산삼 뿌리의 배양을 통한 세포주 유도
산삼의 세포주를 유도하기 위하여, 멸균된 산삼의 뿌리를 멸균 메스를 사용하여 동체의 경우 2mm, 잔뿌리의 경우 5mm의 길이로 자른 후, 3% 수크로오스와 식물성 오옥신계 호르몬인 인돌부티르산(indole-3-Butyric acid; IBA) 2mg/L로 첨가한 범용의 SH 배지에 치상하였다. 이를 광이 완전히 차단된 암실에서 실내온도 25±3℃, 실내 습도는 40% 전후로 유지하여 배양하였으며, 4주 간격으로 새로운 배지로 옮겨 배양근을 유도하였다. 산삼의 뿌리 절편체에서 유도된 뿌리들을 멸균된 메스를 사용하여 자른 후, 동일한 고체 배지에 옮겨서 4주간 배양을 실시하였다
결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 고체 배지에 접종된 산삼의 뿌리 절편체에서 산삼의 뿌리가 효과적으로 유도되는 것을 확인하였다.
1.3 고 기능성 산삼 세포주 배양 및 선발
상기 실시예 1.2 에서 얻어진 뿌리 절편체에서 유도된 뿌리들을 멸균된 메스를 이용하여 자른 후, 동일한 고체배지에 옮겨 4주 간격으로 계대, 유지하였다. 배양된 세포주 중에서 생육이 활발하고 부정근이 잘 유도되는 산삼 배양근을 선별하였다.
결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 배양된 산삼의 세포주들로부터 선별된 산삼 배양근은 산삼의 뿌리를 매우 효과적으로 유도하였다.
1.4 액체 배지에서의 산삼 배양근 배양
액체 배양계를 유도하기 위하여, 3% 수크로오스와 2mg/L의 인돌부티르산이 첨가된 SH 액체배지를 300ml의 삼각플라스크에 80ml 넣어 멸균한 액체 배지를 준비하고, 4주 동안 배양한 산삼 배양근의 근단을 잘라 준비된 액체배지에 무균적으로 접종하였다. 접종 후, 암실에서 23±1℃를 유지하고, 110rpm 회전 진탕 배양기를 이용하여 4주간 배양을 실시하였다.
결과를 도 4 에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 플라스크에서의 액체 배양을 통해 산삼 배양근이 효과적으로 배양된 것을 확인하였다.
1.5 변형된 특수 배지를 이용한 사포닌 함량이 변화된 산삼 배양근의 생산
새롭게 변형 제조한 특수 배지를 이용한 18.9L의 생물배양기에 상기 실시예 1.4에서 얻어진 산삼 배양근을 2-3mm 크기로 잘라 배양하였다(도 5 A). 배양은 실내온도 23±1℃, 실내 습도 40% 전후를 유지하여 실시하였다. 새롭게 제조한 특수 배지는, 상용의 SH 배지에서 중금속 원소인 CoCl2·6H2O　및 이노시톨(inositol)을 제거하고, 수크로오스 3 중량% 농도 및 인돌부티르산(indole butyric; IBA) 2mg/L를 첨가한 변형 3/4 SH 배지를 사용하였다. 총 배지의 양은 15L로 제조하였으며, 상기 배지에 산삼 배양근을 무균 접종하여 4주 간격으로, 새로운 동일한 배지에 옮겨 계대, 유지하였다. 변형 특수 배지에서의 배양을 통해 대량 배양을 위한 종근(seed)을 얻었다(도 5 B).
실시예 2. 산삼 배양근의 농축액 제조
상기 실시예 1을 통해 얻어진 산삼 배양근의 종자를 이용하여 산삼 배양근의 농축액을 제조하였다.
제조 방법을 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 18.9L의 조직배양(bioreactor) 배지(배지용량 15L)를 준비하여 무균작업대에서 산삼 배양근의 종자를 100~150g 접종하였다. 접종된 산삼 배양근을 클린필터, 무균산소 공급 상태에서 23 내지 25℃로 5~6주간 배양하여 수확하였다. 수확된 산삼 배양근은 수돗물로 3회, 증류수로 1회 수세하였으며, 수분 함량이 13% 이하가 되도록 65 내지 70℃로 열풍 건조시켰다. 열풍 건조된 산삼 배양근을 정수를 이용하여 70℃/16시간(1차), 70℃/16시간(2차) 추출하고, 100℃에서 16시간 동안 정수를 이용하여 3차 추출하여 산삼 배양근 추출액을 얻었다. 얻어진 산삼 배양근 추출액을 가용성 고형분이 60Brix 이상이 되도록 60 내지 70℃에서 8시간 동안 농축시켜 최종적으로 산삼 배양근의 농축액을 얻었다.
실시예 3. 선별된 산삼 배양근 분석
상기 실시예 1을 통해 얻어진 산삼 배양근의 우수성을 확인하기 위하여, 샘플의 사포닌 함량을 분석하였다. 사포닌 함량의 분석은 상기 산삼 배양근과 백삼 및 홍삼의 사포닌 함량을 액체크로마토크래피를 이용하여 측정한 후 비교 분석을 수행하였다.
결과를 표 1에 나타내었다.
Figure 112012073944914-pat00001
표 1 에 나타낸 바와 같이, 샘플별 사포닌 분석 결과 본 발명의 산삼 배양근은 백삼 및 홍삼에 비하여 PPT(protopanaxatriol) 계열 사포닌의 함량이 높은 것으로 나타났으며, 특히 Rg1의 함량이 4.3으로 나타나 홍삼 및 화기삼 백삼에 비하여 매우 높은 함량을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 산삼 배양근은 새로운 사포닌 함량을 가진 기존의 산삼과는 차별화되는 산삼 배양근이므로 이를 “CRMG 5(Cultured root of Mountain ginseng 5)”으로 명명하였다.
사포닌은 화학 구조식에 따라, PPD(Protopanaxadiol)과 PPT(Protopanaxatriol)로 나눌 수 있는데 산삼에는 이러한 PPT 타입의 사포닌이 거의 존재하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, PPT 에 속하는 Rg1 사포닌의 함량이 CRMG5 유래 샘플에서 높게 나타나는 특이점이 있으므로, CRMG5의 총 사포닌 함량을 PPD와 PPT로 나누어 이의 비율을 비교 분석하였다.
결과를 표 2에 나타내었다.
총 사포닌 함량 mg /g PPT 및 PPD 사포닌 비율
PPT PPD PPT : PPD
산삼배양근 11.02 4.25 2.59: 1
백삼 6.7 10.84 0.62:1
홍삼 2.77 11.84 0.23: 1
화기삼백삼 14.3 26.1 0.55 : 1
표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 CRMG 5 산삼 배양근 유래 샘플에서는, PPD 타입의 사포닌 함량이 높은 백삼 및 홍삼과 달리, PPT 타입의 사포닌이 PPD 타입의 사포닌보다 약 3배 높게 나타났다. 이를 통해, 본 발명의 CRMG 5 산삼 배양근은 기존의 백삼 및 홍삼과 비교하여 중추신경 흥분작용, 뇌 기능활성작용을 나타낼 수 있는 사포닌인 PPT 계열의 사포닌의 함량이 백삼 및 홍삼에 비하여 뚜렷하게 높으며, PPT: PPD 사포닌 함유 비율 역시 기존의 다른 삼과 비교하여 차별화된 새로운 산삼 배양근임을 확인하였다.
실시예 4. CRMG5 의 독성 및 안정성 평가
4.1 유전독성 평가
제조된 산삼 배양근 CRMG5의 독성 및 안정성 평가를 위하여 수컷 ICR 마우스 골수세포를 이용한 소핵 시험을 실시하였다. CRMG 5 배양 추출물의 유전독성 평가를 위한 1회 투여 최고량은 예비 시험에서 결정하였으며, 약 7주령의 수컷 마우스에 시험물질 0, 500, 1,000 및 2,000 mg/kg의 용량을 1일 1회 2일간 복강 내 투여하고, 최종 투여로부터 약 24시간 후에 골수세포를 수거하여 소핵 유발과 세포독성을 평가하였다. 개체당 2,000개의 다염성적혈구(michromatic erythrocyte, PCE) 중에 나타나는 소핵을 가진 다염성 적혈구(micronucleated polychromatic erythrocyte, MNPCE)의 수를 계수한 결과, 모든 시험물질 투여군은 음성 대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가는 나타나지 않았으며 일반 증상에서도 모든 시험군에서 CRMG5 투여로 인한 것으로 판단되는 증상은 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명의 CRMG5는 유전독성을 유발하지 않는 안정성을 갖는 산삼 배양근임을 확인하였다.
4.2 비 설치류를 이용한 경구투여 독성 시험
본 발명의 CRMG 5가 식품으로 이용 가능한지 여부를 확인하기 위하여 일반 독성 시험에 널리 사용되는 비글견을 이용하여 단 회 경구투여 독성 시험을 실시하였다. 실시예 1을 통해 얻어진 CRMG 5를 영양 배지에서 4주간 배양한 후, 배양근을 수거하여 물로 3회 수세하고 45℃에서 12시간 건조하였다. 이를 다시 증류수를 첨가하고 회전진공 농축기를 사용하여 60Brix 이상으로 농축하였다. 제조된 CRMG 5 농축액을 5개월 된 비글견 12마리에 대하여 경구투여 독성 시험의 한계 용량으로 사용되는 2000mg/kg 투여군을 최고 용량으로 하여 투여하였다.
실험군은 표 3에 나타내었다.
Group sex Animal/ dose Anima no. Dose(mg/kg)
control G1(V,C) male 2 1~2 0
G2 male 3 3~5 500
G3 male 3 6~8 1,000
G4 male 3 9~11 2,000
경구투여 독성 시험결과, 모든 실험 비글견이 생존하였으며, 어떠한 임상적 이상 징후도 나타내지 않았다. 이를 통해, CRMG 5의 추출액은 비글견에서 LD50 가　2000mg/kg　이상으로， 경구 투여 시 독성이 없는 안전한 물질임을 확인하였다.
제제예 1. 식품 조성물의 제조
1.1. 건강식품의 제조
산삼 배양근 CRMG 5 또는 이의 농축액 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 μg
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 μg
비타민 C 10 mg
비오틴 10 μg
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 μg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
1.2 음료의 제조
산삼 배양근 CRMG 5 또는 이의 농축액 100 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

1) CoCl2·6H2O 및 이노시톨(inositol)을 포함하는 SH(Schenk & Hildebrandt)배지에서 CoCl2·6H2O 및 이노시톨(inositol)을 제거한 다음, 여기에 수크로오스　및 인돌부티르산(indole butyric acid; IBA)을 첨가하여 제조한 배지에 산삼 배양근을 접종하는 단계; 및
2) 접종된 산삼 배양근을 5 내지 7주 동안 배양하는 단계를 포함하는, PPT(Protopanaxatriol) 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 CRMG 5(Cultured root of Mountain ginseng 5)의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 1) 단계에서 수크로오스는 2 내지 7 중량%/L로 배지에 첨가되는 것을 특징으로 하는, PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 CRMG 5(Cultured root of Mountain ginseng 5)의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 1) 단계에서 인돌부티르산은 1 내지 3mg/L로 배지에 첨가되는 것을 특징으로 하는, PPT 계열 사포닌 함량이 증대된 산삼 배양근 CRMG 5(Cultured root of Mountain ginseng 5)의 생산 방법.
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