KR100718720B1 - 무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법에 관한 발명으로서, 무기 게르마늄으로부터 액체배양에 의해 생체 내에서 여러 가지 의학적 효능을 나타내는 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼의 부정근을 생산하는 방법에 관한 발명이다. 특히 본 발명은 반응표면분석법을 이용하여 게르마늄 함량 및 사포닌 함량뿐만 아니라 부정근의 생장을 최적화한 액체배양조건을 제공한다. 본 발명에 의해 인삼 또는 산삼의 부정근의 생장 및 사포닌 함량에 영향을 적게 주면서도 유기 게르마늄을 다량 함유하는 인삼 또는 산삼을 효율적으로 생산할 수 있으므로, 의약품 및 식품의 원료 생산면에서 비용절감 효과가 있다.

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Description

무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법{A method for producing organic germanium-containing cultured ginseng or wild mountain ginseng adventitious roots by addition of inorganic germanium in submerged culture}

도 1은 GeO₂ 첨가 농도별 부정근의 생장률을 나타낸 그래프이다.

도 2는 GeO₂ 첨가 농도별 부정근의 게르마늄 함량을 나타낸 그래프이다.

도 3은 GeO₂ 첨가 농도별 부정근의 생장률, 사포닌 함량 및 총 사포닌 함량을 나타낸 그래프이다.

도 4는 게르마늄 흡수 단계 개시일로부터 2주 경과 후에 GeO₂를 배지에 첨가한 경우의 GeO₂ 첨가 농도별 부정근의 생장률을 나타낸 그래프이다.

도 5는 게르마늄 흡수 단계 개시일로부터 2주 경과 후에 GeO₂를 배지에 첨가한 경우의 GeO₂ 첨가 농도별 부정근의 게르마늄 함량을 나타낸 그래프이다.

도 6은 게르마늄 흡수 단계 개시일로부터 2주 경과 후에 GeO₂를 배지에 첨가 한 경우의 GeO₂ 첨가 농도별 부정근의 생장률, 사포닌 함량 및 총 사포닌 함량을 나타낸 그래프이다.

도 7은 배지의 초기 pH에 따른 부정근의 생장률, 게르마늄 함량 및 사포닌 함량을 나타낸 그래프이다.

도 8은 GeO₂의 농도가 독립변수일 때의 부정근의 생장률을,

도 9는 pH가 독립변수일 때의 부정근의 생장률을,

도 10은 인산의 농도가 독립변수일 때의 부정근의 생장률을,

도 11은 GeO₂의 농도가 독립변수일 때의 부정근의 사포닌 함량을,

도 12는 pH가 독립변수일 때의 부정근의 사포닌 함량을,

도 13은 인산의 농도가 독립변수일 때의 부정근의 사포닌 함량을,

도 14는 GeO₂의 농도가 독립변수일 때의 부정근의 게르마늄 함량을,

도 15는 GeO₂의 첨가시기가 독립변수일 때의 부정근의 게르마늄 함량을,

도 16은 인산의 농도가 독립변수일 때의 부정근의 게르마늄 함량을,

도 17은 GeO₂의 농도가 독립변수일 때의 부정근의 총 사포닌 함량을,

도 18은 pH가 독립변수일 때의 부정근의 총 사포닌 함량을,

도 19는 인산의 농도가 독립변수일 때의 부정근의 총 사포닌 함량을,

도 20은 GeO₂의 농도가 독립변수일 때의 부정근의 총 게르마늄 함량을,

도 21은 pH가 독립변수일 때의 부정근의 총 게르마늄 함량을,

도 22는 인산의 농도가 독립변수일 때의 부정근의 총 게르마늄 함량을 각각 나타낸 등고선도(上) 및 반응표면곡선(下)이다.

본 발명은 무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법에 관한 발명으로서, 좀 더 상세하게는 인삼 또는 산삼의 조직 절편으로부터 캘러스를 유도하여 부정근을 형성, 증식시킨 다음 상기 증식시킨 부정근을 무기 게르마늄이 첨가된 소정의 배지에 접종하고 진탕 배양함으로써, 유기 게르마늄을 함유하는 부정근의 생산방법에 관한 것이다.

산삼은 야생상태로 자생하고 있는 Panax ginseng C.A. Meyer를 말하며, 인삼은 최초 파종이 사람에 의해 이루어져 인위적으로 재배된 오갈피나무과(Araliaceae)에 속하는 다년생 초본으로 Panax ginseng C.A. Meyer를 의미한다. 산삼은 그 파종 기원에 따라 천연산삼과 산양삼(山養蔘)으로 나눌 수 있고, 이 중 산양삼은 일반인에게 장뇌삼(長腦蔘)으로 알려진 산삼으로, 천연산삼의 종자를 산중에 파종하여 가꾼 것, 천연산삼의 유근(幼根)을 심산에서 채취하여 적당한 위치의 산림 중에 재이식하여 가꾼 것, 인삼의 종자를 산림 중에 파종하여 가꾸는 것 등으로 분류된다. 인삼과 산삼은 예로부터 한약재로 널리 쓰였을 뿐만 아니라 최근에는 인삼을 원료로 한 다양한 형태의 가공식품이 제조되어 소비되고 있다. 그런데, 산 삼은 정상적인 재배나 채삼을 통해 공급하기가 어려운 문제점이 있고, 인삼의 경우에도 세대기간이 길고 연작이 불가능하다는 점, 특수시설 조건하에서만 재배가 가능한 점, 수삼의 사포닌 함량이 0.06~0.09%에 불과하여 인삼을 이용하여 약품, 건강음료 등을 제조할 경우 제조원가가 높아진다는 점 등 여러 가지 문제점이 있다.

한편, 게르마늄은 주기율표에서 Ⅳ_A 에 속하는 32번째 원소로, 1930년 프랑스와 스페인 국경지방인 Lourdes의 샘물이 여러 가지 질병치료에 큰 효과가 있다는 보고서가 발표된 이후 계속된 샘물의 성분 분석결과 게르마늄의 의학적 효능이 처음으로 발견되었다(Song, W.J., Lee S.C. and Oh, T.K. Preparation of organic germanium by yeast cell. Kor . J. Appl. Micobiol . Biotechnol . 23, 87-90 (1995)). Sanai 등(Sanai, T. et al., Subacute nephrotoxicity of germanium dioxide in the experimental animal. Toxicol. Appl . Pharmacol . 103, 345-353 (1990))은 유기 게르마늄은 안전하지만 무기 게르마늄은 신장 및 간장의 기능 장애를 일으킨다고 보고하였고, 그 후 강한 독성과 많은 부작용이 보고된 바 있는 무기 게르마늄보다는 체내에 잔류하지 않고 약리 작용을 나타내는 유기 게르마늄에 대한 연구가 활발히 진행되었다. 그 결과 인삼, 영지, 마늘, 알로에, 컴프리, 명일엽 등과 같은 진귀한 생약류들에 비교적 다량의 유기 게르마늄이 함유되어 있다는 것이 밝혀졌다(남궁승백, Angelica속 식물의 기내배양 및 germanium 함량 증대. 원광대학교 농학과 박사학위논문 (1995)). 지금까지 알려진 생체 내에서의 유기 게르마늄의 역할은 세포 내 산소공급증진, 혈액의 정화, 체내 중금속의 체외배출 촉진, NK(Natural killer) 세포와 매크로파지의 활성화 및 인터페론 분비 유도, 세포독성 T-lymphocyte의 생산 조절 등이다. 이러한 다양한 약리 효과를 가지는 유기 게르마늄을 생산하기 위해 그동안 인삼, 영지, 명일엽과 같은 식물체를 조직배양하거나, 미생물을 이용하여 단시간 내에 대량으로 유기 게르마늄을 생산하려는 노력을 해왔다(Song, W.J., Lee S.C. and Oh, T.K. Preparation of organic germanium by yeast cell. Kor . J. Appl . Micobiol. Biotechnol . 23, 87-90 (1995)).

식물조직배양에 의한 게르마늄 생산에 관한 연구로는 이 등(Lee, M.S. et al., Increment of germanium contents in Angelica keiskei Koidz. and Panax Ginseng G.A. Meyer by in vitro propagation. Korean J. Medical Crop Sci . 3, 251-258 (1995))이 고려인삼의 조직배양시 캘러스 유도에 미치는 게르마늄의 효과에 대하여 연구한 바 있지만, 캘러스가 아닌 부정근에 대한 게르마늄의 영향을 연구한 예는 없는 실정이다. 다만, 국내 특허 제10-0413613호는 식물 조직 배양법에 의한 게르마늄 다량 함유 식물체의 대량 생산방법을, 국내 특허 제10-0464704호는 유기 게르마늄이 다량 함유된 약용 및 식용식물체를 이용한 기능성 발효주의 제조방법을 제공하면서 상기 특허 제10-0413613호의 발명을 이용하고 있다. 이들 특허발명은 부정근 증식의 최적 조건을 제공하면서 식물체 내 게르마늄 흡수량을 증가시킬 수 있는 배지 내 게르마늄의 농도를 제공하고 있으나, 값이 매우 비싼 유기 게르마늄을 배지에 첨가하여 유기 게르마늄을 함유하는 부정근을 생산하는 것은 비용면에서 바람직하지 못하고, 배지에 무기 게르마늄을 다량 첨가한 경우에는 부정근 내의 게르마늄 형태가 인체에 유해한 무기 게르마늄인지 여부가 불분명하여 문 제가 있다. 부정근 내의 게르마늄 함량이 다량이라 하더라도 무기 게르마늄 형태라면 독성이 있어서 식용으로 하기에는 부적절하기 때문이다. 그 밖에도 본래 식물체 내의 유용성분(사포닌 등)에 대한 영향은 고려되지 않았다는 점, 각각의 실험요소별 독립적 조건만을 제시한 것일 뿐 각 요소들의 종합적인 상호작용은 고려되지 않은 것으로, 조직배양을 통한 게르마늄 함유 인삼 또는 산삼의 생산방법의 효율성 및 경제성이 저하되는 문제점이 있다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 무기 게르마늄을 첨가하여 인삼 또는 산삼 부정근의 생장 및 본래의 유용성분인 사포닌에 미치는 영향을 최소화하는 동시에, 부정근 내 유기 게르마늄의 함량을 최대한 증가시킬 수 있는 액체배양의 조건을 반응표면분석법을 통해 최적화하여 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 부정근 증식을 위한 배지, 식물생장조절제의 조건, 무기 게르마늄 처리로부터 부정근 내의 유기 게르마늄의 생산방법, 무기 게르마늄의 처리 농도와 처리 시기, 배지의 초기 pH, 게르마늄 흡수촉진제 등 부정근 내의 게르마늄 흡수 촉진 요인들을 제공하는 한편, 반응표면분석법을 이용하여 이들 요인들의 종합적인 상호작용을 고려한 인삼 또는 산삼 부정근 내의 게르마늄 흡수의 최적화 방법 및 최적화에 따른 게르마늄 축적 수율의 향상방법을 구체 적으로 제공한다.

본 발명의 무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법은 인삼 또는 산삼의 조직 절편을 배양하여 캘러스를 유도하는 단계, 상기 유도된 캘러스로부터 부정근을 형성시키는 단계 및 상기 형성시킨 부정근을 증식시키는 단계를 포함하는 액체배양에 의한 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법에 있어서,

상기 증식시킨 부정근을 무기 게르마늄이 첨가된 소정의 배지에 접종하고 20~30℃, 암조건에서 진탕 배양하여 상기 부정근에 게르마늄을 흡수시키는 단계가 더 포함되고, 상기 게르마늄 흡수 단계의 소정 배지의 무기 게르마늄의 농도는 10 내지 110ppm인 것을 특징으로 한다.

이때, 식물조직배양은 식물체의 기관, 조직 및 세포를 적출 분리하여 기내에서 영양분이 함유되어 있는 배지에 무균적으로 배양함으로써 캘러스(callus)나 단세포의 집단을 유기하거나 완전한 기능을 가진 식물체로 재생시키는 기술을 말하며, 식물의 '기내배양(器內培養)'이라 부르기도 한다.

식물조직배양에서 조직이 나타내는 반응은 아주 예민하여 식물의 종이나 품종은 물론 부위에 따라서도 다르고, 이에 따라 배지의 성분도 달라져야 하므로 각 식물체에 적합한 배지의 성분을 결정하는 것은 매우 중요하다. 식물조직배양에서 가장 많이 사용되는 배지는 1962년 미국의 Murashige and Skoog에 의해서 만들어진 배지로서 이를 MS 배지라고 한다. Schenk and Hildebrandt(SH) 배지도 식물세포배양에 흔히 사용된다. SH 배지와 MS 배지는 각각 영양성분의 종류와 양이 상이한데, 특히 배지 내의 주 무기영양소 중의 하나인 총 질소량은 SH 배지가 MS 배지의 약 1/2 수준이고, 총 인산염의 양은 약 2배가 된다. 또한 SH 배지는 다른 배지에 비해 비타민류와 같은 유기영양분의 함량이 높은데, myoinositol의 경우 다른 배지(White, Half-strength SH, B-5, MS 배지)에 비해 10배나 많은 양이 함유되어 있다. 실험 결과, 인삼 부정근의 유도 및 배양에는 nitrate 형태의 질소비가 높고 비타민이 상대적으로 많은 SH 배지가 가장 적합하였다.

한편, 식물체는 자연상태에서 여러 가지 호르몬을 생산하여 자신의 생장과 발육을 조절하게 되는데, 조직배양에서는 배양의 목적과 배양식물에 따라 적합한 생장조절물질을 첨가하고 있다. 식물호르몬 중 옥신(auxin)과 시토키닌(cytokinin)이 세포배양에서 가장 중요한 역할을 하며, 옥신과 시토키닌의 농도 비율은 기관발생을 결정하는 주요한 요인으로 작용한다. 즉, 옥신의 시토키닌에 대한 비율이 낮으면 줄기가 발생하고, 옥신의 시토키닌에 대한 비율이 높으면 뿌리가 발생하며 그 중간 비율에서 캘러스가 형성된다. 30~35℃ 정도의 고온조건에서는 생장조절물질의 효과가 크게 나타나지 않는다. 인삼 또는 산삼 부정근의 생장 및 부정근의 사포닌 함량 측면에서 생장조절제로서는 0.5mg/ℓ BAP와 3.0mg/ℓ NAA를 혼합하여 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 첨가하는 게르마늄은 무기 게르마늄이고, 무기 게르마늄 중 비교적 독성이 작고 휘발성이 없으며 물에 비교적 용해하기 쉬운 GeO₂(germanium dioxide)를 이용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서는 GeO₂를 이용하여 부정근의 생장조건과 게르마늄 함량 및 사포 닌 함량에 미치는 GeO₂의 농도와 첨가시기, 게르마늄의 흡수를 향상시킬 수 있다고 생각되는 킬레이트제의 종류와 농도, 배지의 초기 pH를 조사하기 위해 먼저 게르마늄 흡수에 영향을 주는 각각의 요소들을 독립적으로 평가하여 가장 영향력 있는 요인들을 선별하였고, 다음으로 반응표면분석법을 이용하여 상기 선별된 요인간의 상호작용을 일괄적으로 평가하였다. 여기에서 반응표면분석법(Response Surface Methodology: RSM)이란 여러 가지 인자간의 상호효과를 고려하여 반응조건을 통계적으로 최적화하기 위한 방법으로서 종속 변수에 대하여 각 독립 변수의 영향이 어느 정도인가를 등고분석으로 확인할 수 있도록 고안한 것이다.

본 발명에서 총 사포닌 함량(단위 : mg%)은 부정근의 생장율(단위 : g/flask)과 사포닌 함량(단위 : %)을 종합적으로 고려한 값으로, 부정근의 생장율에 사포닌 함량을 곱하여 얻은 값을 의미하고, 총 게르마늄의 함량(단위 : mg)은 부정근의 생장율(단위 : g/flask)과 부정근의 게르마늄 함량(단위 : mg%)을 종합적으로 고려한 값으로, 부정근의 생장율에 부정근의 게르마늄 함량을 곱하여 얻은 값을 의미한다. 여기에서, mg%는 전체 100g중에 함유되어 있는 용질의 mg을 의미한다.

상기 캘러스를 유도하는 단계에 있어서 캘러스를 유도하기 위한 재료로는 무균처리된 인삼 또는 산삼의 씨앗이나 뿌리 등의 조직 절편이 이용될 수 있다.

상기 부정근을 유도하는 단계 및 증식배양하는 단계에 있어서는, 생장조절제의 선택을 위해 발근에 효과적인 옥신류 중에서 IBA(Indole butyric acid)와 NAA 를, 싹유도에 효과적인 시토키닌류 중에서 키네틴(kinetin)과 BAP, 그리고 지베렐린 중 GA₃를 사용하여 각각을 조합하여 사용할 수 있고, 특히 BAP와 NAA의 조합이 부정근의 유도 및 배양에 적합하다. 부정근의 생장률 및 사포닌의 함량을 모두 고려할 때 3.0mg/ℓ NAA를 0.5mg/ℓBAP와 혼합하여 SH 배지에 첨가한 배지를 부정근 유도배지 및 배양배지로 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 부정근에 게르마늄을 흡수시키는 단계는, 상기 식물생장조절제인 3.0mg/ℓ NAA와 0.5mg/ℓBAP를 혼합하여 첨가한 SH 배지를 게르마늄 흡수용 배지로 하고, 상기 게르마늄 흡수용 배지에 10~110ppm의 게르마늄을 첨가함이 바람직하다. 무기 게르마늄의 농도가 지나치게 높아질 경우, 부정근의 색깔이 갈변하고 부정근 생육이 저해되며, 무기 게르마늄의 농도가 지나치게 낮을 경우 게르마늄의 흡수율이 낮아지기 때문이다. 한편, 게르마늄의 농도가 10ppm 정도일 때에 부정근의 총 사포닌 함량이 높게 나타나, 총 사포닌 함량이 높은 게르마늄 함유 인삼 또는 산삼의 배양을 위해서는 10ppm 이상의 게르마늄을 첨가하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 부정근에 무기 게르마늄을 흡수시키는 단계에서 상기 게르마늄 흡수용 배지의 초기 pH는 4.5 내지 6.5의 범위 이내인 것이 바람직하고, 게르마늄을 함유한 부정근의 생장률, 사포닌 함량, 게르마늄 함량 또는 총 게르마늄 함량을 최적화하기 위한 pH는 각 목적별로 상기 pH 범위 이내에서 달라질 수 있다.

그리고, 상기 부정근에 게르마늄을 흡수시키는 단계에 있어서, 상기 게르마늄 흡수용 배지는 게르마늄의 흡수를 증가시키기 위해 킬레이트제를 포함할 수 있 으며, EDTA(Ethylene Diamine Tetra Acetic acid), 인산(phosphoric acid), 옥살산(oxalic acid) 중 어느 하나를 포함하도록 하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 인산을 포함하되, 0.1 내지 6.2mM의 농도로 포함하는 것이 부정근의 게르마늄 흡수에 효율적이다.

그리고, 상기 부정근에 게르마늄을 흡수시키는 단계에 있어서, 상기 게르마늄 흡수용 배지에 게르마늄을 첨가하는 시기는 게르마늄 흡수용 배지에 접종한 날(0일)로부터 2주 이내인 것이 바람직하다. 증식 배양된 부정근을 게르마늄 흡수용 배지에 새롭게 접종, 배양을 시작하면 새로운 환경에 적응하는 과정을 겪게 되는데, 어느 정도 새로운 환경에 적응을 하고 서서히 성장이 왕성해지는 대수기가 접종 후 2주째 정도인 것으로 나타났다. 따라서, 게르마늄 흡수용 배지에 접종하여 배양하기 시작한 날로부터 얼마간의 적응기간을 거친 후 대수기에 접어들 무렵인 7 내지 12일째에 게르마늄을 첨가하는 것이 게르마늄의 흡수율을 높이는 데 있어 더욱 바람직하다.

한편, 부정근에 흡수된 게르마늄의 형태가 유기 게르마늄인지 문제되는데, 이에 대해 아직 확립된 분석방법은 개발되지 않은 상태이다. Matsumoto 등(Matsumoto, H. et al., Translocation and some forms of germanium in rice plants. Soil Sci . Plant Nutr . 21, pp. 273-279 (1975))은 벼에서 ⁶⁸GeO₂를 추적자로 하여 게르마늄이 단백질과 결합된 형태로 존재한다고 밝힌 바 있고, Song 등(Won-Jong Song. et al., Preparation of organic germanium by yeast cell. Kor . J. Appl . Microbiol . Biotechnol . 23(1) pp. 87-90 (1995))은 효모에 GeO₂를 처리하여 투석한 결과, GeO₂는 투석막을 완전히 통과하는 한편, 흡수된 Ge는 통과하지 못하므로 고분자와 킬레이트된 유기형태로 추정했다. 또한 Klapcinska 등(Klapcinska B. and Chmielowski, J. Appl . Environ. Microbiol . 51(5), 1144 (1986))은 Pseudomonsa putida 세포 내의 Ge 축적은 주로 soluble fraction에서 이루어지고 이 중 대다수가 핵산과 단백질에 결합되어 있다는 것을 전자현미경 사진분석을 통해 확인하였고, 함희숙(Effects of glucose, surfactant, enzyme on uptake of germanium into the yeast cells. 서울여자대학교 석사학위 논문 (1995))은 효모의 균체 내에서 Ge가 단백질과 결합되어 있음을 확인하고 이 Ge-단백질 복합체를 투석으로 분리하고 SDS-PAGE를 통해 Ge에 결합되어 있는 단백질의 분자량을 밝힌 바 있다. 본 발명에서는 게르마늄 함유 부정근을 투석법(dialysis)을 이용하여 부정근 내에서 유기 상태로 전환된 게르마늄의 함량을 측정하고, 무기 게르마늄이 부정근 내에서 유기 게르마늄으로 전환되어 단백질과 결합하였다고 가정하여, 단백질 침전법에 의해 Ge-단백질 복합체의 함량을 측정하였다.

그러나 아직까지 식물체 내에서 게르마늄의 세포를 통과하는 형태, 세포 내 결합물질, 결합시 구조변화, 구조변화에 따른 게르마늄의 활성에의 영향 등에 대해서는 밝혀지지 않았으므로 그에 대한 연구가 더욱 필요하다.

이하, 본 발명에 따른 구체적인 기술내용을 하기의 실시예를 통해 보다 상세 히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 이에 한정되지 않음은 당업자에게 자명할 것이다.

실시예 1. 캘러스의 유도

산삼의 뿌리 절편, 인삼의 씨앗을 개갑한 것 또는 수삼의 절편을 70%(v/v) 에탄올로 20초, 4% NaOCl용액(v/v)으로 15분간 살균한 후, 이를 0.5mg/ℓ BAP(6-Benzylaminopurine)와 3.0mg/ℓ NAA(1-Naphtalate acetic acid)가 생장조절제로 첨가된 MS(Murashige-Skoog) 배지에서 25℃, 암조건으로 배양하였다.

실시예 2. 부정근의 유도

MS 배지에서 유도된 캘러스로부터 부정근을 얻기 위해 0.5mg/ℓ BAP와 3.0mg/ℓ NAA가 생장조절제로 첨가된 SH(Schenk and Hildebrandt) 배지에 상기 캘러스를 옮겨 25℃, 암조건에서 배양하였다.

실시예 3. 부정근의 계대배양

약 3개월 후, 유도된 부정근을 0.5mg/ℓ BAP와 3.0mg/ℓ NAA가 생장조절제로 첨가된 SH 배지에 옮겨 25℃, 암조건에서 60rpm으로 4주간 진탕배양한 후 다음의 실험에 사용하였다.

실시예 4. 부정근의 게르마늄 흡수단계 - 게르마늄 함유 부정근 생산을 위한 배양최적조 건 결정

(1) 무기 게르마늄의 농도의 영향

무기 게르마늄의 농도가 인삼의 생장과 인삼의 게르마늄 및 사포닌 함량에 미치는 영향을 알아보기 위해 0.5mg/ℓ BAP와 3.0mg/ℓ NAA가 생장조절제로 첨가된 SH 배지를 게르마늄 흡수용 배지로 하고, 여기에 GeO₂를 0, 5, 10, 50, 100ppm씩 첨가한 후 부정근을 접종하고 25℃, 암조건에서 60rpm으로 진탕 배양하면서 2주 간격으로 생장률 및 게르마늄 함량을 8주까지 측정하였고, 8주 배양 후 사포닌 함량을 측정하였다.

도 1은 인삼 부정근을 GeO₂가 첨가된 배지에 접종하여 배양한 후 2주 간격으로 수거하여 인삼 부정근의 생장률을 조사한 결과로서, 전체적으로 S자 형태의 생장곡선을 나타냈으며, 6주 이후부터는 생장률이 둔화하는 것을 관찰할 수 있었다. GeO₂의 농도가 10ppm일 때 생장률이 가장 좋았고, 100ppm일 때는 0ppm인 경우에 비해 현저히 낮은 생장률을 보였다. 따라서, 인삼 부정근의 생육에 가장 적합한 무기 게르마늄의 농도는 10ppm이며 그 이상이 될 경우에는 생장을 저해하는 것을 알 수 있었다.

도 2는 상기 조건하에서 인삼 부정근의 게르마늄 함량을 조사한 결과로서, GeO₂의 농도 및 배양기간이 증가할수록 인삼 부정근 내의 게르마늄 함량은 증가하였다.

도 3은 상기 조건하에서 인삼 부정근의 사포닌 함량 및 총 사포닌 함량을 조 사한 결과로서, 무기 게르마늄의 농도가 증가할수록 인삼 부정근의 사포닌 함량 및 총 사포닌 함량은 감소하였다.

(2) 무기 게르마늄의 첨가시기에 따른 영향

GeO₂를 배지에 첨가하는 시기를 ⅰ)게르마늄 흡수 단계 초기(이하 '0주 처리구'라 함)와 ⅱ)게르마늄 흡수 단계 개시일로부터 2주 경과 후(이하 '2주 처리구'라 함)로 나누고, GeO₂의 농도별(0, 5, 10, 50, 100ppm)로 비교하였다.

도 4는 2주 처리구의 인삼 부정근 생장률을 나타내는 것으로, 도 1과 비교할 때 게르마늄 흡수 단계 개시일로부터 4주까지의 생장은 2주 처리구가 더 우수한 것으로 나타났으나 4주 이후부터는 0주 처리구의 생장률이 훨씬 높았다.

도 5는 2주 처리구의 게르마늄 함량을 나타내는 것으로, GeO₂의 농도가 증가할수록 인삼 부정근 내의 게르마늄 함량이 증가하였고, 0주 처리구의 경우 100ppm의 조건에서 2주째부터 게르마늄이 검출되었고, 4주째부터는 모든 농도 조건에서 게르마늄이 검출되었다. 반면 2주 처리구의 경우, 게르마늄 첨가 후 2주째(그래프상 x축의 4주에 해당)부터 모든 농도 조건에서 게르마늄이 검출되었으며, 100ppm을 제외한 나머지 농도 조건에서 0주 처리구에 비해 게르마늄 함량이 낮게 나타났다. 100ppm 조건하에서는 0주 처리구에 비해 게르마늄 함량이 약 2배 정도 높은 것으로 나타났다. 게르마늄 흡수 단계 개시일로부터 4주 경과 후에는 2주 처리구가 0주 처리구에 비해 게르마늄 함량이 월등히 높아졌다.

도 6은 2주 처리구의 사포닌 함량 및 총 사포닌 함량을 나타내는 것으로, 게르마늄의 농도가 증가할수록 인삼 부정근의 사포닌 함량 및 총 사포닌 함량은 감소하였다.

(3) 배지의 초기 pH 영향

배지의 초기 pH 영향을 알아보기 위해 배지에 GeO₂ 50ppm을 첨가하고, 초기 pH를 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5로 각각 구분하여 결과를 측정하였다.

도 7은 배지의 초기 pH에 따른 인삼 부정근의 생장률, 게르마늄 함량 및 사포닌 함량을 나타낸 결과로, 인삼 부정근의 생장률은 pH가 증가함에 따라 증가하여 pH 5.5에서 3.63g으로 최대값을 나타냈고, pH 6 이상의 약한 산성 조건에서는 생장률이 감소하는 것으로 나타났다. 게르마늄의 함량은 pH 5.5의 조건하에서 20.37mg%의 최대값을 나타냈으며, pH 6.0 이상에서 배양한 인삼 부정근의 게르마늄 함량이 높게 나타났다. 사포닌 함량은 pH 6.0의 조건에서 0.279%로 가장 높게 나타났으나, pH 5.5의 경우와 큰 차이는 없었다.

(4) 게르마늄 흡수 촉진제의 영향

게르마늄 흡수 촉진제의 영향을 알아보기 위해 게르마늄 흡수용 배지에 킬레이트제인 시트르산(citric acid), 옥살산(oxalic acid), 인산(phosphoric acid), EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid), EGTA(ethylene glycol-bis(β- aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid)를 각각 0, 0.1, 1.0, 10mM씩 첨가하고, GeO₂ 50ppm을 첨가하여 비교하였다.

실험 결과, 게르마늄과 함께 첨가되어 효과적으로 인삼 부정근의 게르마늄 흡수를 촉진하는 킬레이트제는 옥살산, 인산, EDTA이고, 그 중에서도 인산이 부정근의 게르마늄 흡수 촉진에 있어 가장 바람직한 킬레이트제로 판단되었다.

(5) 생장률, 사포닌 함량, 게르마늄 함량, 총 사포닌 함량, 총 게르마늄 함량의 측정

부정근의 생장률은 무게를 측정하여 생체중량으로 나타냈다.

사포닌 함량은 시료 1g을 80% 메탄올로 3회 추출하고, 여과, 농축 후 ethyl ether를 가하여 지질 등을 제거한 다음, 수포화 n-부타놀 추출방법으로 추출, 분리하여 vanillin-H₂SO₄ 비색법으로 정량하였다. 사포닌의 진세노사이드(ginsenoid) 분석은 n-부타놀 분획을 메탄올 1㎖에 녹여 HPLC (Waters Associates HPLC)를 이용하여 수행하였다(표 1 참조).

<표 1> 진세노사이드 분석을 위한 HPLC 장비 및 실험조건

Instrument	Waters Associates HPLC
Column	μ-Bondapak C18 3.9㎜×300㎜
Detector	Waters 486 absorbance detector (203㎚)
Solvent	Solvent A : Acetonitrile
	Solvent B : H2O
Gradient table	Waters 600 gradient controller
	Time	Flow	%A	%B
	Initial	1.5	10	90
	30	2.0	30	70
	50	2.0	30	70
	51	2.0	10	90
	60	1.5	10	90
Injection volume	20㎕

게르마늄의 함량은 배양한 인삼 부정근을 수거하여 50% EDTA로 수세하고 3차 증류수로 다시 3회 수세한 후, 70℃에서 열풍 건조시켜 분쇄하고 40 mesh의 체를 통과시켜 시료로 사용하여 측정하였다. Abbasi(Abbasi, S.A. J. Environ. Anal. Chem . 33, 149-160 (1987))의 방법을 변형하여 상기 시료 0.1g에 0.5㎖의 conc. H₂SO₄를 첨가하고 70℃에서 5분간 가열한 후, HNO₃ 0.5㎖를 첨가하여 100℃에서 15분간 분해한 후 H₂O₂ 0.2㎖를 첨가하고 10㎖로 정용한 후, ICP(Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry)로 표 2와 같은 조건하에서 측정하였다.

<표 2> 게르마늄 분석을 위한 ICP 장비 및 실험조건

Instrument parameters :

ICP/Perkin Elmer Optima 3300XL

plasma power 1300W

plasma gas 15min-1

nebulizing gas 0.8min-1

auxillary gas 0.5min-1

read delay 20sec

spectrum rate 0.1

spectrum range 0.5㎚

replicate 3

viewing height 10㎜

Elemental parameters :

Ge wavelength 209.426㎚

(6) 실험 결과

독립적 측정 결과, 인삼 부정근의 생장에 가장 적합한 GeO₂의 농도는 10ppm, 첨가시기는 게르마늄 흡수 단계 초기(0주), pH는 5.5였다. 한편 게르마늄의 흡수가 가장 좋았던 경우의 GeO₂의 농도는 100ppm, 첨가시기는 게르마늄 흡수 단계 개시일로부터 2주 경과 후, pH는 5.5이었다. 게르마늄을 첨가하지 않고 배지의 pH를 6.0으로 하였을 경우 사포닌 함량이 가장 높게 나타났다. 게르마늄의 흡수를 촉진하는 킬레이트제를 조사한 결과 EDTA, 인산, 옥살산이 효과적인 것으로 나타났고, 생장률과 게르마늄 흡수 촉진 능력 및 사포닌 함량의 모든 면을 고려하였을 때 인산이 가장 효과적으로 게르마늄 흡수 촉진작용을 하였다.

실시예 5. 반응표면분석법에 의한 배양 최적조건 결정

Stat-graphics(STSC Inc. Rockville, MD, USA)내의 중심합성계획(central composite design) 프로그램을 이용하여 GeO₂의 농도, GeO₂의 첨가시기, 배지의 초 기 pH, 인산의 농도를 독립변수로 3 수준 - 4 인자의 프랙셔널 팩토리얼 블럭(fractional factorial block)을 정하였다. GeO₂의 농도(X₁)는 최대 110ppm, 최소 10ppm, 중간값 60ppm이 되도록 첨가하였으며, GeO₂의 첨가시기(X₂)는 게르마늄 흡수 단계 시작일로부터 최대 2주, 최소 0주, 중간값 1주로 하였고, 배지의 초기 pH(X₃)는 최대 6.5, 최소 4.5, 중간값 5.5로 맞추었으며, 인산의 농도(X₄)는 최대 10mM, 최소 0.1mM, 중간값 5.05mM이 되도록 각각 독립변수의 수준을 설정하였다. 이 때 SH 배지를 기본으로 하고, 생장조절제로 0.5mg/ℓ BAP와 3.0mg/ℓ NAA를 첨가하였다.

3 수준 - 4 인자에 의해 계획된 프랙셔널 팩토리얼 블럭에 따라 배지를 제조하여 부정근 0.6g씩을 100㎖ 플라스크에 접종하고 25℃ 암조건하에서 60rpm으로 6주간 진탕 배양한 뒤 생장률과 사포닌 함량, 게르마늄 함량을 측정하였다(표 3 참조).

생장률과 사포닌 함량 및 게르마늄 함량을 각각 종속변수로 설정하고 각 독립변수들 간의 관계를 SAS(SAS Institute Inc. Cary, NC, USA)로 다중회기분석 및 분산분석을 실시한 후 유의성이 인정되는 변수만을 채택하여 각 종속변수에 해당하는 모델식을 설정하고 이를 반응표면분석법에 의하여 등고분석과 3차원 분석을 실시하여 최적조건을 설정하였다(도 8 내지 22 참조).

<표 3> 본 발명의 실험계획의 프랙셔날 팩토리알 블럭 및 결과

처리번호	코드화된변수				Process var.				생체중량 (g/flask)	사포닌 (%)	게르마늄(mg%)	총사포닌(mg%)	총게르마늄(mg)
	X1	X2	X3	X4	X1	X2	X3	X4
1	-1	-1	-1	+1	10	0	4.5	10.0	2.62*	0.226	6.752	5.91	0.177
2	-1	-1	+1	-1	10	0	6.5	0.10	2.11	0.285*	7.420	6.00	0.157
3	-1	+1	-1	-1	10	2	4.5	0.10	2.25	0.213	6.501	4.78	0.146
4	-1	+1	+1	+1	10	2	6.5	10.0	2.07	0.233	6.154	4.81	0.127
5	+1	-1	-1	-1	110	0	4.5	0.10	1.69	0.203	39.83	3.43	0.673
6	+1	-1	+1	+1	110	0	6.5	10.0	1.34**	0.213	37.89	2.85**	0.508
7	+1	+1	-1	+1	110	2	4.5	10.0	2.16	0.240	42.37	5.18	0.915**
8	+1	+1	+1	-1	110	2	6.5	0.10	1.74	0.212	46.37*	3.68	0.805
9	0	0	0	0	60	1	5.5	5.05	2.08	0.243	28.88	5.05	0.600
10	0	0	0	0	60	1	5.5	5.05	2.08	0.243	28.88	5.05	0.600
11	-1	-1	-1	-1	10	0	4.5	0.10	2.13	0.225	6.539	4.79	0.139
12	-1	-1	+1	+1	10	0	6.5	10.0	1.89	0.207	6.065	3.90	0.114
13	-1	+1	-1	+1	10	2	4.5	10.0	2.14	0.213	6.135	4.55	0.131
14	-1	+1	+1	-1	10	2	6.5	0.10	2.49	0.252	4.257**	6.26	0.106*
15	+1	-1	-1	+1	110	0	4.5	10.0	1.97	0.212	39.24	4.17	0.771
16	+1	-1	+1	-1	110	0	4.5	0.10	1.72	0.240	39.98	4.12	0.686
17	+1	+1	-1	-1	110	2	6.5	0.10	2.21	0.223	14.18	4.93	0.910
18	+1	+1	+1	+1	110	2	4.5	10.0	1.87	0.198**	34.20	3.70	0.640
19	0	0	0	0	60	1	5.5	5.05	2.08	0.243	28.88	5.05	0.600
20	0	0	0	0	60	1	5.5	5.05	2.08	0.243	28.88	5.05	0.600
21	+1	0	0	0	110	1	5.5	5.05	1.99	0.237	40.00	4.72	0.796
22	-1	0	0	0	10	1	5.5	5.05	2.32	0.273	6.845	6.33*	0.159
23	0	+1	0	0	60	2	5.5	5.05	2.04	0.238	25.26	4.86	0.515
24	0	-1	0	0	60	0	5.5	5.05	2.06	0.256	23.22	5.27	0.478
25	0	0	+1	0	60	1	6.5	5.05	1.72	0.278	30.77	4.78	0.529
26	0	0	-1	0	60	1	4.5	5.05	1.93	0.227	23.80	4.38	0.459
27	0	0	0	+1	60	1	5.5	10.0	1.76	0.229	28.10	4.02	0.493
28	0	0	0	-1	60	1	5.5	0.10	1.84	0.215	26.76	3.95	0.491
29	0	0	0	0	60	1	5.5	5.05	2.08	0.243	28.88	5.05	0.600
30	0	0	0	0	60	1	5.5	5.05	2.08	0.243	28.88	5.05	0.600

X₁ : GeO₂ 농도(ppm), X₂ : GeO₂의 첨가시기(weeks), X₃ : 배지의 pH, X₄ : H₃PO₄ 농도(mM), X= -1 : 각 독립변수의 최소값, X= 0 : 각 독립변수의 중간값, X= +1 : 각 독립변수의 최대값, * : 각 종속변수의 최대값, ** : 각 종속변수의 최소값

(1) 생장률 증가 조건의 최적화

무기 게르마늄을 첨가한 인삼 부정근 배양에서 생장률을 증가시키기 위하여 게르마늄 흡수용 배지 내 GeO₂ 농도, GeO₂ 첨가시기, pH, 인산의 농도를 독립변수로 설정하고, 부정근의 생체중량을 종속변수 Y로 설정하여 다중회기분석을 실시하여 95% 유의수준에서 유의성이 있는 변수만을 채택하여 모델식 Y = -0.014155X₁ + 0.909692X₃ + 0.156681X₄ - 0.085092X₃ ² + 0.000087X₁ ² - 0.005811X₄ ² - 0.018554X₃X₄를 얻었고, 분산분석을 수행한 결과 상기 모델식은 F값이 99.9% 수준에서 유의성이 있었으며, 반응표면분석법을 수행하여 도 8 내지 도 10과 같은 결과를 얻었다.

도 8은 독립변수 GeO₂의 농도별 부정근의 생장률을 나타낸 등고선도 및 반응표면곡선으로, GeO₂ 10ppm일 때 pH 4.75, 인산 6mM 부근에서 반응값이 2.45g으로 최대값을 나타냈고(도 8(a)), GeO₂ 60ppm일 때 pH 6.5, 인산 10mM 부근에서 1.71g으로 최소값을 나타냈다(도 8(b)).

도 9는 독립변수 pH 변화에 따른 부정근의 생장률을 나타낸 등고선도 및 반응표면곡선으로, pH 4.5일 때 GeO₂ 10ppm, 인산 6.25mM 부근에서 2.43g으로 최대값을 나타냈고(도 9(a)), pH 6.5일 때 GeO₂ 80ppm, 인산 10mM 부근에서 1.58g의 최소값을 나타냈다(도 9(c)).

도 10은 독립변수 인산의 농도에 따른 부정근의 생장률을 나타낸 등고선도 및 반응표면곡선으로, 인산 10mM일 때 GeO₂ 10ppm, pH 4.5 부근에서 2.36g으로 최대값을(도 10(c)), 인산 0.1mM일 때 GeO₂ 80ppm, pH 6.5 부근에서 0.59g으로 최소값을 나타냈다(도 10(a)).

(2) 사포닌 생산 조건의 최적화

무기 게르마늄을 첨가한 인삼 부정근의 배양에서 사포닌 함량을 증가시키기 위하여 게르마늄 흡수용 배지 내 GeO₂의 농도, GeO₂의 첨가시기, pH, 인산의 농도를 독립변수로 설정하고, 부정근의 사포닌 함량을 종속변수 Y로 설정하여 다중회기분석을 수행하여 95% 유의수준에서 유의성이 있는 상수, 변수를 채택하여 모델식 Y = 0.163105 + 0.020585X₄ + 0.000624X₁ - 0.000143X₁X₃ + 0.002427X₃ ² - 0.002091X₃X₄ - 0.001007X₄ ²를 얻었다. 분산분석을 수행한 결과 상기 모델식은 F값이 99.9% 수준에서 유의성이 있었고, 반응표면분석법을 수행하여 도 11 내지 도 13과 같은 결과를 얻었다.

도 11은 독립변수 GeO₂의 농도별 사포닌 함량 변화에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, GeO₂ 10ppm일 때 pH 6.5, 인산 3.5mM 부근에서 0.274%의 최대값을 나타냈고(도 11(a)), GeO₂ 110ppm일 때 pH 6.25, 인산 10mM 부근에서 0.205%로 최소값을 나타냈다(도 11(c)).

도 12는 독립변수 pH에 따른 사포닌 함량 변화에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, pH 6.5일 때 GeO₂ 10ppm, 인산 3.5mM 부근에서 0.273%로 최대값을 보였으며(도 12(c)), 최소값은 pH 4.5일 때 GeO₂ 110ppm, 인산 0.1mM 부근에서 0.202%으로 나타났다(도 12(a)).

도 13은 독립변수 인산의 농도별 사포닌 함량 변화에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, 인산 5.05mM일 때 GeO₂ 10ppm, pH 6.5 부근에서 0.271%로 최대값을 보였으며(도 13(b)), 인산 10mM일 때 GeO₂ 110ppm, pH 6.5 부근에서 0.202%으로 최소 값을 나타냈다(도 13(c)).

(3) 게르마늄 함량 증가 조건의 최적화

무기 게르마늄을 첨가한 인삼 부정근의 배양에서 게르마늄 함량을 증가시키기 위하여 게르마늄 흡수용 배지 내 GeO₂의 농도, GeO₂의 첨가시기, pH, 인산의 농도를 독립변수로 설정하고, 부정근의 게르마늄 함량을 종속변수 Y로 설정하여 다중회기분석을 수행하여 95% 유의수준에서 유의성이 있는 상수, 변수를 채택하여 모델식 Y = 1.923873 + 0.463443X₁ + 3.637977X₂ - 0.001157X₁ ² + 0.025253X₁X₂ - 2.075548X₂ ² - 0.0023X₁X₂X₄를 얻었다. 분산분석을 수행한 결과 상기 모델식은 F값이 99.9% 수준에서 유의성이 있었고, 반응표면분석법을 수행하여 도 14 내지 도 16와 같은 결과를 얻었다.

도 14는 독립변수 GeO₂의 농도에 따른 게르마늄의 함량에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, GeO₂ 110ppm일 때 GeO₂ 첨가시기 1.5주, 인산 0.1mM 부근에서 43.1mg%의 최대값을 나타냈고(도 14(c)), GeO₂ 10ppm일 때 GeO₂ 첨가시기 2주, 인산 10mM 부근에서 최소값을 나타냈다(도 14(a)).

도 15은 독립변수 GeO₂의 첨가시기별 게르마늄 함량에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, GeO₂ 첨가시기가 2주인 경우, GeO₂ 110ppm, 인산 0.1mM 부근에서 42.4mg%로 최대값을 보였으며, GeO₂ 첨가시기가 2주째이고 GeO₂ 10ppm, 인산 10mM 부근에서 6.4mg%의 최소값을 나타냈다(도 15(c)).

도 16는 독립변수 인산의 농도별 게르마늄 함량에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, 인산 0.1mM일 때 GeO₂ 110ppm, GeO₂ 첨가시기 1주 부근에서 39.9mg%로 최대값을 보였으며(도 16(a)) 인산이 10mM일 때 GeO₂ 10ppm, GeO₂ 첨가시기 1주 부근에서 8.1mg%로 최소값을 나타냈다(도 16(c)).

(4) 총 사포닌 생산 조건의 최적화

무기 게르마늄을 첨가한 인삼 부정근의 배양에서 총 사포닌 함량을 증가시키기 위하여 게르마늄 흡수용 배지 내 GeO₂의 농도, GeO₂의 첨가시기, pH, 인산의 농도를 독립변수로 설정하고, 부정근의 총 사포닌 함량을 종속변수 Y로 설정하여 다중회기분석을 수행하여 95% 유의수준에서 유의성이 있는 상수, 변수를 채택하여 모델식 Y = 1.78225 + 0.72924X₃ + 0.802324X₄ + 0.000192X₁ ² - 0.006925X₁X₃ - 0.09181X₃X₄ - 0.036675X₄ ² + 0.000124X₁X₃X₄를 얻었다. 분산분석을 수행한 결과 상기 모델식은 F값이 99.9% 수준에서 유의성이 있었고, 반응표면분석법을 수행하여 도 17 내지 도 19와 같은 결과를 얻었다.

도 17은 독립변수 GeO₂의 농도별 총 사포닌 함량의 변화에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, GeO₂ 10ppm일 때 pH 6.5, 인산 3mM 부근에서 6.38mg%의 최대값을 나타냈다(도 17(a)).

도 18은 독립변수 pH 변화에 따른 총 사포닌 함량의 변화에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, pH 6.5, GeO₂ 10ppm, 인산 3mM 부근에서 6.27mg%의 최대값을 나타냈다(도 18(c)).

도 19는 독립변수 인산의 농도별 총 사포닌 함량의 변화에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, 인산 5.05mM 일 때 GeO₂ 10ppm, pH 6.25 부근에서 5.94mg%의 최대값을 나타냈다(도 19(b)).

(5) 총 게르마늄 생산 조건의 최적화

무기 게르마늄을 첨가한 인삼 부정근의 배양에서 총 게르마늄 함량을 증가시키기 위하여 게르마늄 흡수용 배지 내 GeO₂의 농도, GeO₂의 첨가시기, pH, 인산의 농도를 독립변수로 설정하고, 부정근의 총 게르마늄 함량을 종속변수 Y로 설정하여 다중회기분석을 수행하여 95% 유의수준에서 유의성이 있는 상수, 변수를 채택하여 모델식 Y = 0.036578 + 0.009575X₁ + 0.022619X₄ - 0.000027X₁ ² + 0.000567X₁X₄ - 0.002141X₄ ² - 0.000114X₁X₃X₄를 얻었다. 분산분석을 수행한 결과 상기 모델식은 F값이 99.9% 수준에서 유의성이 있었고, 반응표면분석법을 수행하여 도 20 내지 도 22와 같은 결과를 얻었다.

도 20은 독립변수 GeO₂ 농도에 따른 총 게르마늄 함량에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, GeO₂ 110ppm일 때 pH 4.5, 인산 6.8mM 부근에서 0.84mg의 최대값을 나타냈다(도 20(c)).

도 21은 독립변수 pH 변화에 따른 총 게르마늄 함량에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, pH 5.5, GeO₂ 110ppm, 인산 0.1mM 부근에서 0.72mg의 최대값을 나타냈다(도 21(b)).

도 22는 독립변수 인산의 농도별 총 게르마늄 함량에 대한 등고선도 및 반응표면곡선으로, 인산 5.05mM 일 때 GeO₂ 110ppm, pH 4.5 부근에서 0.82mg의 최대값을 나타냈다(도 22(b)).

(6)반응표면분석법에 의한 게르마늄 함유 부정근의 배양 최적조건

반응표면분석법을 이용한 모델링 방법으로 실험한 결과, 생장률을 위한 최적조건은 무기 게르마늄 10ppm, 첨가시기 1주, pH 4.7, 인산 6mM로 이 조건에 의해 얻어진 생체중량은 2.47g이었다.

그리고, 사포닌 생산의 최적조건은 무기 게르마늄 10ppm, 첨가시기 1주, pH 6.5, 인산 3.5mM 로, 이 조건에서 얻어진 사포닌 함량은 0.275%였다.

한편, 게르마늄 생산의 최적조건은 무기 게르마늄 110ppm, 첨가시기 1.5주, pH 5.5, 인산 0.1mM 로서, 이 조건에 의한 예상 게르마늄 함량은 43.8mg%였다.

나아가, 게르마늄 생산과 생장률을 종합적으로 평가하기 위해 총 게르마늄 함량의 최적조건을 찾은 결과, 총 게르마늄 함량은 무기 게르마늄 110ppm, 첨가시기 1주, pH 4.5, 인산 6.2mM 일 때 0.86mg으로 예상되었다.

또한, 사포닌 생산과 생장률을 종합적으로 평가하기 위해 총 사포닌 함량의 최적조건을 찾은 결과 무기 게르마늄 10ppm, 첨가시기 1주, pH 6.5, 인산 3.0mM에서 최대 6.40mg%의 값이 예상되었다.

실시예 6. 부정근 내에 축적된 유기 게르마늄 확인

GeO₂ 100ppm이 첨가된 배지에서 배양한 인삼 부정근을 50mM citrate buffer(pH 6.0)로 추출한 후, dialysis membrane(M.W. cut-off :6,000)으로 투석하여 투석막 내부 내용물의 게르마늄 함량을 ICP로 측정함으로써, 부정근 내에서 유기 상태로 전환된 게르마늄의 함량을 측정하였다. 또한, 무기 게르마늄이 부정근 내에서 유기 게르마늄으로 전환되어 단백질과 결합한 비율을 확인하기 위하여 (NH₄)₂SO₄ 100%로 단백질을 침전시켜 48시간 동안 투석한 후 건조하여 ICP로 게르마 늄의 함량을 측정하였다(표 2 참조).

실험결과, 인삼 부정근이 흡수한 29.4mg%의 게르마늄 중 약 20% 정도에 해당하는 5.86mg%의 게르마늄이 유기 게르마늄으로 전환되었음을 확인하였다.

그리고, 인삼 부정근 내의 유기 게르마늄이 단백질과 결합되어 있는지 확인한 결과 인삼 부정근 내의 유기 게르마늄 5.86mg%의 약 10% 정도에 해당하는 0.59mg%가 분자량 6,000 이상의 단백질과 결합하여 유기 상태로 존재하고 있음을 확인하였다. 이로써 흡수한 무기 게르마늄의 일부만이 단백질과 결합하여 유기화되고 나머지는 다른 유기물과 결합하여 유기화되는 것을 알 수 있었다.

본 발명에 의해 상대적으로 저렴한 무기 게르마늄을 처리하여 생체 내에서 여러 가지 의학적 효능을 나타내는 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼의 부정근을 효율적으로 생산할 수 있다. 본 발명에 의해 인삼 또는 산삼의 부정근의 생장 및 사포닌 함량에 영향을 적게 주면서도 유기 게르마늄을 다량 함유하는 인삼 또는 산삼을 효율적으로 생산할 수 있으므로, 의약품 및 식품의 원료 생산면에서 비용절감 효과가 있다.

Claims (7)

1. 캘러스를 유도하는 단계, 상기 유도된 캘러스로부터 부정근을 형성시키는 단계 및 상기 형성시킨 부정근을 증식시키는 단계를 포함하는 액체배양에 의한 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법에 있어서,

   상기 증식시킨 부정근을 무기 게르마늄이 첨가된 소정의 배지에 접종하고 20~30℃, 암조건에서 진탕 배양하여 상기 부정근에 게르마늄을 흡수시키는 단계가 더 포함되고,

   상기 게르마늄 흡수 단계의 소정 배지의 무기 게르마늄의 농도는 10 내지 110ppm인 것을 특징으로 하는 무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 게르마늄 흡수 단계의 소정 배지는 3.0mg/ℓ NAA(1-Naphtalene acetic acid)와 0.5mg/ℓBAP(6-Benzyl amino purine)가 식물생장조절제로 첨가된 Schenk-Hilderbrant(SH) 배지로, 초기 pH가 4.5 내지 6.5인 것을 특징으로 하는 무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 게르마늄 흡수 단계의 소정 배지는 게르마늄 흡수촉진제로 EDTA(Ethylene Diamine Tetra Acetic acid), 인산(phosphoric acid), 옥살산(oxalic acid) 중에서 선택된 어느 하나가 첨가된 것을 특징으로 하는 무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법
4. 제 3 항에 있어서,

   상기 게르마늄 흡수 단계의 소정 배지는 게르마늄 흡수촉진제로 인산(phosphoric acid)이 0.1 내지 6.2mM의 농도로 첨가된 것을 특징으로 하는 무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서,

   상기 게르마늄 흡수 단계의 무기 게르마늄은 상기 증식시킨 부정근을 상기 게르마늄 흡수용 배지에 접종하여 배양하기 시작한 날로부터 7~12일 되는 때에 첨가된 것을 특징으로 하는 무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법
7. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 게르마늄 흡수 단계는 3 수준 - 4 인자(3 level - 4 factor)에 의해 계획된 프랙셔널 팩토리얼 블럭에 따른 반응표면분석법에 의하여 상기 증식시킨 부정근을 초기 pH가 4.5이고 인산 농도가 6.2mM인 상기 게르마늄 흡수용 배지에서 배양하되, 무기 게르마늄은 상기 증식시킨 부정근을 상기 게르마늄 흡수용 배지에 접종한 날로부터 7일째에 110ppm의 농도로 첨가된 것을 특징으로 하는 무기 게르마늄 첨가 액체배양에 의한 유기 게르마늄을 함유하는 인삼 또는 산삼 부정근의 생산방법

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