CN111183902B - 一种卷叶黄精组织培养方法 - Google Patents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
Abstract
本发明公开了一种卷叶黄精组织培养方法，包括以下步骤：将卷叶黄精块茎在流水中洗净，然后在洗衣粉溶液中浸泡，流水洗净后次氯酸钠溶液浸泡，无菌水冲洗，晾干，得预处理后卷叶黄精块茎；用乙醇表面灭菌，冲洗，再放入氯化汞溶液灭菌，冲洗，吸干水分，得灭菌后卷叶黄精块茎；切成小块，再接入分化培养基中，培养得分化后黄精不定芽；接入增殖培养基中，培养得黄精不定芽丛；切成芽块，接入生根培养基中，培养得黄精苗；半遮光放置，消毒后定植，培养得黄精种苗，然后移植于室外土壤。本发明以卷叶黄精块茎为外植体，经组织培养快速获取黄精种苗，实现黄精的快速繁殖，有效解决了黄精存活率低、繁殖所需时间长种苗生长慢和质量不稳定的问题。
Description
技术领域
本发明涉及卷叶黄精组织培养技术领域，具体涉及一种卷叶黄精组织培养方法。
背景技术
黄精为我国常用的中药材，是百合科黄精属多年生草本植物根茎的总称。黄精化学成份主要有糖类、黄酮及蒽醌类化合物、甾体皂苷、生物碱、强心苷、木脂素、维生素和多种对人体有用的氨基酸及微量元素等；药理研究认为，黄精具有延长寿命、抗衰老、影响心血管系统、提高免疫能力、抗炎、抗病原微生物、抗疲劳、提高学习记忆力、抑制肿瘤细胞等作用，且安全无毒、无致突变性。临床应用研究报道，黄精及其制剂对呼吸系统、心血管系统、消化系统以及白细胞减少症、糖尿病、结核病、老年痴呆、外生殖器感染、足癣甲癣、蛲虫病、慢性肝炎、秃发、习惯性流产和不育症、慢性荨麻疹、痛风性关节炎、瘰疠等疾病均有明显疗效。另外，黄精还可用于制饮料、做蜜饯、加工保健品和护肤品、充当猪饲料添加剂以及作蔬菜和观赏花卉等。可见其用途非常广泛。
随着黄精药用价值和保健价值越来越被人们认识，黄精原料的需求量也越来越大，致使野生黄精的无计划采集加剧，导致其资源枯竭加速，影响可持续开发利用。因此，为了保证黄精原料来源、实行产业化种植将成为必然趋势。近年来虽然有些地方开始人工种植黄精，但人工栽培技术还处于野生变家种阶段，运用块茎或种子培育黄精种苗，存活率低，质量不稳定，繁殖所需要的时间长，繁殖种苗生长慢，难以达到快速大量繁殖、大批量生产的要求。
植物的离体快速繁殖，是目前植物组织培养中应用最广泛、最有效的技术，尤其对于新引进品种、灭菌苗、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可实现离体快速增殖，且不受地区、气候影响，繁殖速度比常规生产快数百万倍，能迅速提供大量优质种苗。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种卷叶黄精组织培养方法，以卷叶黄精块茎为外植体，经组织培养快速获取黄精种苗，实现黄精的快速繁殖，有效解决了黄精存活率低、繁殖所需时间长种苗生长慢和质量不稳定的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种卷叶黄精组织培养方法，包括以下步骤：
(1)预处理：将当年生卷叶黄精块茎洗净，然后在浓度为2～6vt％的洗衣粉溶液中浸泡5～10min，用流水洗净，再用0.001wt％次氯酸钠溶液浸泡8～12min，继续用流水洗净，最后用无菌水冲洗10～15min，晾干，得预处理后的卷叶黄精块茎；
(2)灭菌：将步骤(1)所得预处理后的卷叶黄精块茎，先用75vt％乙醇表面浸泡15～30s，无菌水冲洗3～5次，再放入0.05～0.2vt％的氯化汞溶液中，并滴加3～6滴0.1～0.2vt％的聚山梨酯-80溶液，灭菌10～30min，继续用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸吸干水分，得灭菌后的卷叶黄精块茎；
(3)诱导分化：将步骤(2)所得灭菌后的卷叶黄精块茎切成小块，再接入分化培养基中，在1800～2300lx光照和23～26℃温度下培养20～30d，得分化后黄精不定芽；分化培养基在MS培养基的基础上还包括1.5～2mg/L甲钴胺、3～4mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.1～0.4mg/L萘乙酸、25～30g/L蔗糖和6～9g/L琼脂；
(4)不定芽增殖：将步骤(3)所得黄精不定芽接入增殖培养基中，在25～28℃温度下暗培养3～4d，然后25～28℃温度下光照培养15～20d，每天在1500～2000lx下光照10～14h，得黄精不定芽丛；增殖培养基在MS培养基的基础上还包括0.1～0.12mg/L链霉素、0.7～1mg/L芦荟提取物、1～1.5mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、1～2mg/L TDZ、0.5～1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5～1mg/L吲哚乙酸、25～30g/L蔗糖和6～9g/L琼脂；
(5)生根培养：将步骤(4)所得不定芽丛切成2～4个不定芽的芽块，接入生根培养基中，在1800～2300lx光照和23～26℃温度下培养20～30d，每天光照12～14h，得黄精苗；生根培养基在MS培养基的基础上还包括0.2～0.3mg/L 0.2～0.3mg/L海带提取物、0.5～0.7mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.5～1.2mg/L萘乙酸、0.5～1mg/L吲哚丁酸、25～30g/L蔗糖和6～9g/L琼脂；
(6)种苗移植：将步骤(5)所得黄精苗半遮光放置3～4d，经0.05～0.2vt％高锰酸钾溶液消毒后，定植在基质上，在20～25℃温度、自然光条件下培养8～10d，得黄精种苗，然后移植于室外土壤。
进一步，分化培养基在MS培养基的基础上还包括1.8mg/L甲钴胺、3.5mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.3mg/L萘乙酸、28g/L蔗糖和8g/L琼脂。
进一步，增殖培养基在MS培养基的基础上还包括0.11mg/L链霉素、0.9mg/L芦荟提取物、1.3mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、1.5mg/L TDZ、0.8mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.8mg/L吲哚乙酸、28g/L蔗糖和7g/L琼脂。
进一步，芦荟提取物通过以下方法制备得到：将芦荟与水按质量比1:1混合后搅碎，得芦荟浆汁混合物；然后加入芦荟浆汁混合物总质量0.7～1％的淀粉酶酶解2h，再加入芦荟浆汁混合物2倍体积的75～90vt％乙醇浸泡15～20d，在85℃温度下水浴蒸发乙醇后，加入等量蒸馏水得芦荟提取物。
进一步，生根培养基在MS培养基的基础上还包括0.25mg/L海带提取物、0.6mg/L6-苯甲基腺嘌呤、0.8mg/L萘乙酸、0.8mg/L吲哚丁酸、28g/L蔗糖和7g/L琼脂。
进一步，海带提取物通过以下方法制备得到：将海带捣碎后加入15倍体积水浸泡5～7min，然后在70～80℃水浴加热后抽滤3～5次，合并滤液，浓缩至原体积的20～30％，再加入75vt％沉淀离心，得海带提取物。
进一步，步骤(1)的次氯酸钠溶液中含有3vt％的活性氧。
进一步，分化培养基、增殖培养基和生根培养基pH值为5.8±0.5。
进一步，步骤(6)中的基质是由土壤、腐殖质土、草木灰和珍珠岩按体积比1:1:1:1混合而成的混合物。
进一步，在进行卷叶黄精组织培养时，湿度为70～80％。
进一步，步骤(3)和步骤(6)中均采用无菌小刀进行切块。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明提供的组织培养方法，以卷叶黄精块茎为外植体，先后经预处理、灭菌、诱导分化、不定芽增殖、生根培养和种苗移植，快速获得了可以直接室外种植的黄精种苗，缩短了黄精种苗繁殖周期，又能较好地保持优良性状，且所得种苗相较于野生种苗质量稳定，其由科学的培养方法所得，并在土壤、腐殖质土、草木灰和珍珠岩混合而成的基质上进行种苗移植，存活率较高，可以实现黄精的工业化种植，达到快速大量繁殖、大批量生产的要求，便于黄精的大规模推广种植。
2、在预处理时，通过牙刷洗净，洗衣粉溶液和含有活性氧次氯酸钠浸泡等操作，可以初步除去卷叶黄精块茎表面的污垢和细菌真菌等；然后再经过乙醇和氯化汞的灭菌，在卷叶黄精块茎表面进行灭菌，且可以加入聚山梨酯-80溶液，可以促使氯化汞有效的渗透块茎表层，使得消毒效果更好，从而提高后续的培养的成活率。
3、在诱导分化、不定芽增殖和生根培养过程中分别采用分化培养基、增殖培养基和生根培养基，这是分别针对黄精愈伤组织的不同阶段配置专门的培养基；块茎在分化培养基的作用下快速诱导处愈伤组织，然后转入增殖培养基中进行增殖，增殖后再接入生根培养基中进行生根培养，最后经基质定植后获得黄精种苗，大大缩短了成苗时间，实现快速繁殖生长，获得了大量的种苗，可以实现黄精的工业化种植。
4、分化培养基在MS培养基基础上含有甲钴胺、6-苯甲基腺嘌呤、萘乙酸、蔗糖和琼脂，甲钴胺能够抑制杂菌生长，提高伤口处细胞的原生质活性，促进细胞分裂，加快愈伤组织的形成和分化；6-苯甲基腺嘌呤、萘乙酸促进芽的形成，诱导愈伤组织发生，可以有效提高卷叶黄精块茎的不定芽诱导率和不定芽数量，达到较好的效果。
5、增殖培养基在MS培养基的基础上含有链霉素、芦荟提取物、6-苯甲基腺嘌呤、TDZ、2，4-二氯苯氧乙酸、吲哚乙酸、蔗糖和琼脂，链霉素是细菌和放线菌的抑制剂，防止细菌污染；芦荟提取物中富含芦荟苷，可加速不定芽丛的生长和分化，缩短不定芽丛生长时间，同时芦荟提取物中的芦荟大黄素可抑制培养基中微生物的生长，减少了培养基的污染，可与链霉菌协同起到抑菌杀菌的作用，防止菌群污染，进一步提高黄精的存活率；TDZ是一种高活性细胞分裂素，能促进愈伤组织、侧芽以及不定芽的发生，在增殖过程中具有良好的效果，而6-苯甲基腺嘌呤、2，4-二氯苯氧乙酸和吲哚乙酸可以进一步促进不定芽的增殖作用，获得更多的不定芽，达到更好的增殖效果。
6、生根培养基在MS培养基的基础上含有海带提取物、6-苯甲基腺嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸、蔗糖和琼脂，海带提取物中含有多糖活性成分，可以促进根细胞的生长和伸长，增强生根能力，且可以进一步加强组织的形成和分化，缩短生根时间；吲哚丁酸可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成；6-苯甲基腺嘌呤和萘乙酸也可以促进生根。
具体实施方式
实施例1
一种卷叶黄精组织培养方法，包括以下步骤：
(1)预处理：将当年生卷叶黄精块茎在流水中用牙刷洗净，然后在浓度为2vt％的洗衣粉溶液中浸泡5min，用流水洗净，再用0.001wt％次氯酸钠溶液浸泡8min，继续用流水洗净，最后用无菌水冲洗10min，晾干，得预处理后的卷叶黄精块茎；其中，次氯酸钠溶液中含有3vt％的活性氧；
(2)灭菌：将步骤(1)所得预处理后的卷叶黄精块茎置于超净工作台上，先用75vt％乙醇表面浸泡15s，无菌水冲洗3次，再放入0.05vt％的氯化汞溶液中，并滴加3滴0.1vt％的聚山梨酯-80溶液，灭菌10min，继续用无菌水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，得灭菌后的卷叶黄精块茎；
(3)诱导分化：将步骤(2)所得灭菌后的卷叶黄精块茎切成小块，再接入分化培养基中，在1800～2300lx光照和23℃温度下培养20d，得分化后黄精不定芽；分化培养基在MS培养基的基础上还包括1.5mg/L甲钴胺、3mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、25g/L蔗糖和6g/L琼脂；
(4)不定芽增殖：将步骤(3)所得黄精不定芽接入增殖培养基中，在25℃温度下暗培养3d，然后25℃温度下光照培养15d，每天在1500～2000lx下光照10h，得黄精不定芽丛；增殖培养基在MS培养基的基础上还包括0.1mg/L链霉素、0.7mg/L芦荟提取物、1mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、1mg/L TDZ、0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/L吲哚乙酸、25g/L蔗糖和6g/L琼脂；
(5)生根培养：将步骤(4)所得不定芽丛切成2～4个不定芽的芽块，接入生根培养基中，在1800～2300lx光照和23℃温度下培养20d，每天光照12h，得黄精苗；生根培养基在MS培养基的基础上还包括0.2mg/L海带提取物、0.5mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.5mg/L萘乙酸、0.5mg/L吲哚丁酸、25g/L蔗糖和6g/L琼脂；
(6)种苗移植：将步骤(5)所得黄精苗半遮光放置3d，经0.05vt％高锰酸钾溶液消毒后，定植在基质上，在20℃温度、自然光条件下培养8d，得黄精种苗，然后移植于室外土壤。其中，基质是由土壤、腐殖质土、草木灰和珍珠岩按体积比1:1:1:1混合而成的混合物。
实施例2
一种卷叶黄精组织培养方法，包括以下步骤：
(1)预处理：将当年生卷叶黄精块茎在流水中用牙刷洗净，然后在浓度为2vt％的洗衣粉溶液中浸泡8min，用流水洗净，再用0.001wt％次氯酸钠溶液浸泡10min，继续用流水洗净，最后用无菌水冲洗13min，晾干，得预处理后的卷叶黄精块茎；其中，次氯酸钠溶液中含有3vt％的活性氧；
(2)灭菌：将步骤(1)所得预处理后的卷叶黄精块茎置于超净工作台上，先用75vt％乙醇表面浸泡25s，无菌水冲洗4次，再放入0.1vt％的氯化汞溶液中，并滴加3～6滴0.15vt％的聚山梨酯-80溶液，灭菌20min，继续用无菌水冲洗4次，最后用无菌滤纸吸干水分，得灭菌后的卷叶黄精块茎；
(3)诱导分化：将步骤(2)所得灭菌后的卷叶黄精块茎切成小块，再接入分化培养基中，在1800～2300lx光照和25℃温度下培养25d，得分化后黄精不定芽；分化培养基在MS培养基的基础上还包括1.8mg/L甲钴胺、3.5mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.3mg/L萘乙酸、28g/L蔗糖和8g/L琼脂；
(4)不定芽增殖：将步骤(3)所得黄精不定芽接入增殖培养基中，在26℃温度下暗培养3d，然后26℃温度下光照培养18d，每天在1500～2000lx下光照12h，得黄精不定芽丛；增殖培养基在MS培养基的基础上还包括0.11mg/L链霉素、0.9mg/L芦荟提取物、1.3mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、1.5mg/L TDZ、0.8mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.8mg/L吲哚乙酸、28g/L蔗糖和7g/L琼脂；
(5)生根培养：将步骤(4)所得不定芽丛切成2～4个不定芽的芽块，接入生根培养基中，在1800～2300lx光照和25℃温度下培养25d，每天光照13h，得黄精苗；生根培养基在MS培养基的基础上还包括0.25mg/L海带提取物、0.6mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.8mg/L萘乙酸、0.8mg/L吲哚丁酸、28g/L蔗糖和7g/L琼脂；
(6)种苗移植：将步骤(5)所得黄精苗半遮光放置3d，经0.1vt％高锰酸钾溶液消毒后，定植在基质上，在23℃温度、自然光条件下培养9d，得黄精种苗，然后移植于室外土壤。其中，基质是由土壤、腐殖质土、草木灰和珍珠岩按体积比1:1:1:1混合而成的混合物。
实施例3
一种卷叶黄精组织培养方法，包括以下步骤：
(1)预处理：将当年生卷叶黄精块茎在流水中用牙刷洗净，然后在浓度为6vt％的洗衣粉溶液中浸泡10min，用流水洗净，再用0.001wt％次氯酸钠溶液浸泡12min，继续用流水洗净，最后用无菌水冲洗15min，晾干，得预处理后的卷叶黄精块茎；其中，次氯酸钠溶液中含有3vt％的活性氧；
(2)灭菌：将步骤(1)所得预处理后的卷叶黄精块茎置于超净工作台上，先用75vt％乙醇表面浸泡30s，无菌水冲洗5次，再放入0.2vt％的氯化汞溶液中，并滴加6滴0.2vt％的聚山梨酯-80溶液，灭菌30min，继续用无菌水冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干水分，得灭菌后的卷叶黄精块茎；
(3)诱导分化：将步骤(2)所得灭菌后的卷叶黄精块茎切成小块，再接入分化培养基中，在1800～2300lx光照和26℃温度下培养30d，得分化后黄精不定芽；分化培养基在MS培养基的基础上还包括2mg/L甲钴胺、4mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.4mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和9g/L琼脂；
(4)不定芽增殖：将步骤(3)所得黄精不定芽接入增殖培养基中，在28℃温度下暗培养4d，然后28℃温度下光照培养20d，每天在1500～2000lx下光照14h，得黄精不定芽丛；增殖培养基在MS培养基的基础上还包括0.12mg/L链霉素、1mg/L芦荟提取物、1.5mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、2mg/L TDZ、1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、1mg/L吲哚乙酸、30g/L蔗糖和9g/L琼脂；
(5)生根培养：将步骤(4)所得不定芽丛切成2～4个不定芽的芽块，接入生根培养基中，在1800～2300lx光照和26℃温度下培养30d，每天光照14h，得黄精苗；生根培养基在MS培养基的基础上还包括0.3mg/L海带提取物、0.7mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、1.2mg/L萘乙酸、1mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和9g/L琼脂；
(6)种苗移植：将步骤(5)所得黄精苗半遮光放置3～4d，经0.05～0.2vt％高锰酸钾溶液消毒后，定植在基质上，在20～25℃温度、自然光条件下培养8～10d，得黄精种苗，然后移植于室外土壤。其中，基质是由土壤、腐殖质土、草木灰和珍珠岩按体积比1:1:1:1混合而成的混合物。
对比例1
对比例1与实施例2不同之处在于：分化培养基中缺少甲钴胺，其余与实施例2相同。
对比例2
对比例2与实施例2不同之处在于：增殖培养基中缺少芦荟提取物，其余与实施例2相同。
对比例3
对比例3与实施例2不同之处在于：生根培养基中缺少海带提取物，其余与实施例2相同。
对比例4
一种点花卷叶黄精组织培养的快速繁殖方法，包括种子的消毒、无菌苗的获得、芽的诱导、生根诱导，其主要步骤如下：
(1)取点花黄精的种子，进行消毒处理；
(2)将步骤(1)消毒处理过的点花黄精的种子接种到ZW+3.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA的培养基中进行无菌苗的培育，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，培养温度25±2℃，光照强度3500lx，光照时间12h/d；
(3)取步骤(2)诱导出来的无菌苗切去根部接入1/2MS+0.2-0.3mg/L6-BA+1.0-1.5mg/LNAA培养基中进行腋芽的诱导和继代，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8，光照3000lx，光期12h/d，温度25±2℃；
(4)将步骤(3)培养出来的丛生芽进行生根诱导。
在实施例1～3和对比例1～4的培养过程中，统计其生长情况，其结果见表1。
表1卷叶黄精生长情况统计表
由表1可知，采用本发明提供的组织培养方法，在培养过程中，不定芽发芽率、生根率和获得率均高于常规方法，而不定芽污染率则较低，且所得种苗叶色浓绿，茎高粗壮。同时，分化培养基、增殖培养基和生根培养基能够起到促进发芽与生根、防止污染和提高存活率的作用。由此可见，本方法可以实现黄精的快速繁殖，获得率较高，所得种苗质量稳定，能较好的保持其优良性状，达到快速大量繁殖、大批量生产的要求，便于黄精的大规模推广种植。
虽然本发明的具体实施方式对本发明进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (8)
1.一种卷叶黄精组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理：将当年生卷叶黄精块茎洗净，然后在浓度为2～6vt％的洗衣粉溶液中浸泡5～10min，用流水洗净，再用0.001wt％次氯酸钠溶液浸泡8～12min，继续用流水洗净，最后用无菌水冲洗10～15min，晾干，得预处理后的卷叶黄精块茎；次氯酸钠溶液中含有3vt％的活性氧；
(2)灭菌：将步骤(1)所得预处理后的卷叶黄精块茎，先用75vt％乙醇表面浸泡15～30s，无菌水冲洗3～5次，再放入0.05～0.2vt％的氯化汞溶液中，并滴加3～6滴0.1～0.2vt％的聚山梨酯-80溶液，灭菌10～30min，继续用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸吸干水分，得灭菌后的卷叶黄精块茎；
(3)诱导分化：将步骤(2)所得灭菌后的卷叶黄精块茎切成小块，再接入分化培养基中，在1800～2300lx光照和23～26℃温度下培养20～30d，得分化后黄精不定芽；所述分化培养基在MS培养基的基础上还包括1.5～2mg/L甲钴胺、3～4mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.1～0.4mg/L萘乙酸、25～30g/L蔗糖和6～9g/L琼脂；
(4)不定芽增殖：将步骤(3)所得黄精不定芽接入增殖培养基中，在25～28℃温度下暗培养3～4d，然后25～28℃温度下光照培养15～20d，每天在1500～2000lx下光照10～14h，得黄精不定芽丛；所述增殖培养基在MS培养基的基础上还包括0.1～0.12mg/L链霉素、0.7～1mg/L芦荟提取物、1～1.5mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、1～2mg/L TDZ、0.5～1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5～1mg/L吲哚乙酸、25～30g/L蔗糖和6～9g/L琼脂；所述芦荟提取物通过以下方法制备得到：将芦荟与水按质量比1:1混合后搅碎，得芦荟浆汁混合物；然后加入芦荟浆汁混合物总质量0.7～1％的淀粉酶酶解2h，再加入芦荟浆汁混合物2倍体积的75～90vt％乙醇浸泡15～20d，在85℃温度下水浴蒸发乙醇后，加入等量蒸馏水得芦荟提取物；
(5)生根培养：将步骤(4)所得不定芽丛切成2～4个不定芽的芽块，接入生根培养基中，在1800～2300lx光照和23～26℃温度下培养20～30d，每天光照12～14h，得黄精苗；所述生根培养基在MS培养基的基础上还包括0.2～0.3mg/L海带提取物、0.5～0.7mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.5～1.2mg/L萘乙酸、0.5～1mg/L吲哚丁酸、25～30g/L蔗糖和6～9g/L琼脂；
(6)种苗移植：将步骤(5)所得黄精苗半遮光放置3～4d，经0.05～0.2vt％高锰酸钾溶液消毒后，定植在基质上，在20～25℃温度、自然光条件下培养8～10d，得黄精种苗，然后移植于室外土壤。
2.如权利要求1所述的卷叶黄精组织培养方法，其特征在于，所述分化培养基在MS培养基的基础上还包括1.8mg/L甲钴胺、3.5mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.3mg/L萘乙酸、28g/L蔗糖和8g/L琼脂。
3.如权利要求1所述的卷叶黄精组织培养方法，其特征在于，所述增殖培养基在MS培养基的基础上还包括0.11mg/L链霉素、0.9mg/L芦荟提取物、1.3mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、1.5mg/L TDZ、0.8mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.8mg/L吲哚乙酸、28g/L蔗糖和7g/L琼脂。
4.如权利要求1所述的卷叶黄精组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基在MS培养基的基础上还包括0.25mg/L海带提取物、0.6mg/L 6-苯甲基腺嘌呤、0.8mg/L萘乙酸、0.8mg/L吲哚丁酸、28g/L蔗糖和7g/L琼脂。
5.如权利要求1或4所述的卷叶黄精组织培养方法，其特征在于，所述海带提取物通过以下方法制备得到：将海带捣碎后加入15倍体积水浸泡5～7min，然后在70～80℃水浴加热后抽滤3～5次，合并滤液，浓缩至原体积的20～30％，再加入75vt％沉淀离心，得海带提取物。
6.如权利要求1所述的卷叶黄精组织培养方法，其特征在于，所述分化培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基pH值为5.8±0.5。
7.如权利要求1所述的卷叶黄精组织培养方法，其特征在于，步骤(6)中的基质是由土壤、腐殖质土、草木灰和珍珠岩按体积比1:1:1:1混合而成的混合物。
8.如权利要求1所述的卷叶黄精组织培养方法，其特征在于，在进行卷叶黄精组织培养时，湿度为70～80％。
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