CN117223608A - 胡豆莲的组培快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体公开了一种胡豆莲的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：采集胡豆莲的果实；将果实进行果皮的剥离和消毒，得种子(消毒后种子)；种子的无菌萌发；所得的无菌苗分割成下胚轴切段、茎段切段后进行增殖培养；增殖培养所得的新茎段有以下两种用途：用途一、分割成带1～2个节的切段用于进一步增殖培养；用途二、不分割用于后续的生根培养；生根培养所得的生根植株进行移栽。本发明成功实现了胡豆莲的组培快繁，可以短时间内快速培育出大量试管苗，为该濒危物种的恢复提供一条切实可行的繁殖方式。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种胡豆莲的组培快速繁殖方法。
背景技术
胡豆莲(Euchresta japonica Hook f.ex Regel)是一种豆科山豆根属的常绿灌木，于1865年首次发表，在中国、日本和韩国有分布，野外种群数量有限，都被列入珍稀濒危保护植物。在日本该物种已经濒临灭绝；在韩国，该物种被认定为8种濒危(I类)植物之一。韩国珍稀植物数据库根据世界自然保护联盟的标准，在国家一级保护植物的基础上，将该物种列为“极度濒危”(Choi et al,2013)。在我国，胡豆莲零星分布于于华南和西南的部分地区，生于海拔800～1350米的常绿阔叶林林下及阴湿山坡上。胡豆莲对生境要求极高，主要分布在人类干扰少的原始林中。近年来由于森林过度砍伐导致的生境破坏、民间采药及其自身生长缓慢、近亲繁殖、开花率低、座果率低等诸多因素，导致其有性繁殖率极低，野生种群极为稀少(Wu&Hong2010)。胡豆莲被列为国家二级重点保护野生植物，并被《中国生物多样性红色名录》列为易危(VU)物种(生态环境部和中国科学院,2020)。
胡豆莲，又名山豆根，为著名的药用植物，其主要成分是黄酮类，特别是异黄酮类丰富(Mizuno et al,1988,1992；Shirataki et al,1980,1981)。此外还含有生物碱类、甾类等成分(李厚聪等，2014)。其性味苦寒，有清热、解毒、消肿、镇痛等功效，主治肠炎腹泻、腹胀、腹痛、胃痛、咽喉痛、牙痛、疮疖肿毒，还有抗肿瘤、抗氧化、调血脂等功效(Toda&Shirataki，2006；林茂祥等，2007a)。
Hama et al.(2009)开发了一套胡豆莲的微卫星引物，为该物种的遗传结构的研究提供了便利。在此基础上，Choi et al(2013)利用9个微卫星引物对韩国极度濒危的胡豆莲进行了种群遗传结构及其保护的研究。可惜上述研究缺乏中国和日本的胡豆莲样品。Song et al(2012)对济州岛胡豆莲(豆科)野生地的植被结构和保护方案进行了研究。提出为了保护胡豆莲，急需通过种子发芽或组织培养等方式进行个体数量的增殖；通过发掘合适的野生地进行移植栽培。
据长期的野外观察，胡豆莲主要通过种子和压条进行自我繁殖。尽管胡豆莲种子发芽率高，但开花率和座果率极低，荚果内仅有1枚种子，因此用于繁殖的种子数量有限。胡豆莲长至50厘米以上会自然倒伏，接触地面的茎会长出不定根，根茎部往往能萌发新的枝条，2个枝条中间的茎会腐烂，最终形成2个独立个体。由于胡豆莲生长极其缓慢，虽然能通过压条方式补充有性生殖的不足，但其繁殖系数仍然非常低。
目前，对于胡豆莲的人工无性繁殖方法主要有扦插和组织培养两种方法。林茂祥等人(2007b，2009，2011)研究了不同生长素对胡豆莲扦插生根的影响。然而，由于胡豆莲生长缓慢，可以用于扦插繁殖的茎段有限，不能满足大规模繁殖的需要。因此，有必要开展胡豆莲组培快繁的研究。
韩如刚等人(2011)仅对胡豆莲组织培养过程中外植体的选择和消毒方法进行初步研究，没有成功建立胡豆莲的组织培养体系。目前仅见Setyawati et al(2023)对药用植物伏毛山豆根离体繁殖及次生代谢物生产研究，主要通过愈伤组织培养检测愈伤组织中黄酮的含量。
目前，国内外针对胡豆莲组培的研究仅处于一个探究阶段，尚未真正通过组织培养培养出完整植株。
需要说明的是：据《中华人民共和国药典》(2015年版)记载，中药广豆根或山豆根为豆科槐属(Sophora)越南槐(S.tonkinensis)的干燥根和根茎，与本发明所述的胡豆莲属于不同的物种。
CN103477991A的发明告知：一种山豆根组培苗专用初代培养基包含MS培养基、苄基嘌呤(BA)、奈乙酸(NAA)、蔗糖和琼脂，其特征在于苄基嘌呤(BA)的浓度为1.5～2.4mg/L，奈乙酸(NAA)的浓度为0.1～0.3mg/L，蔗糖的浓度为2％，琼脂的浓度为0.5％，PH值5.9～6.2。
CN102301951B的发明告知：一种广豆根组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：(1)外植体的选择与消毒；(2)种子萌发获得无菌试管苗：MS培养基中含0.5mg/L的6-BA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂；(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养：根据芽增殖倍率确定的最适培养基激素浓度为1.5mg/L的6-BA，0.5mg/L的IAA和0.5mg/L的KT；(4)丛生芽壮苗培养：MS壮苗培养基中含1.0mg/L的6-BA和不同浓度的IAA；(5)试管苗生根培养：培养基中添加1.5mg/L的IAA和0.5mg/L的ABT生根效果最好，生根率达96.8％。
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种胡豆莲的组培快速繁殖方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种胡豆莲的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)、取材：
采集胡豆莲的果实(荚果)；
2)、将果实进行果皮的剥离和消毒，得种子(消毒后种子)；
3)、种子的无菌萌发：
将种子播种于种子萌发培养基上，黑暗状态下培养2～3天后转入光/暗交替培养直至顶芽长至2～3cm时停止培养(培养时间约为6周左右)，得无菌苗；
4)、增殖培养(快速扩增)：
将无菌苗切除根部后，将下胚轴切成0.3～0.5cm的切段，得下胚轴切段；将子叶以上的茎段切成至少含有一个节的切段，得茎段切段(长度约0.5～0.8cm)；将下胚轴切段、茎段切段均转接于增殖培养基上进行增殖培养；
增殖培养基为以下任一：
增殖培养基Ⅰ：改良MS基本培养基+BA 0.4～1.0mg/l+NAA 0.05～0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
增殖培养基Ⅱ：改良MS基本培养基+mTR 0.4～1.0mg/l+NAA 0.05～0.15mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
所述增殖培养为：于23～25℃进行光/暗交替培养；待下胚轴切段或茎段切段上长出丛生状的不定芽(叶腋中长出)，且每个不定芽均为带有≥3个节的茎段时(即，每个不定芽一般为带有3～4个节的茎段，生长至约为2.5～3.5cm)，停止增殖培养，割取不定芽作为新茎段；
说明：所述丛生状的不定芽是指不定芽的数量至少为3个，一般为3～5个不等；
5)、生根培养：
任选以下一种方案：
方案一：
将步骤4)所得的新茎段转入生根培养基Ⅰ中进行生根培养；培养条件如下：先在23～25℃暗培养2～3天，然后转入光/暗交替培养；当新茎段的基部产生长度≥3cm的至少4条根(一般为4～6条根)时结束生根培养；
生根培养基Ⅰ：改良MS基本培养基+BA 0.05～0.2mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
方案二：
将步骤4)所得的新茎段转入生根培养基Ⅱ-1(激素培养基)上于23～25℃暗培养2～3天后转入光/暗交替培养3～5天，接着再转入生根培养基Ⅱ-2(无激素的培养基)置于光/暗交替培养，当新茎段的基部产生长度≥3cm的至少4条根(一般为4～6条根)时，结束生根培养；
生根培养基Ⅱ-1(激素培养基)为：改良MS基本培养基+NAA 0.2～1.0mg/l+IBA1.0～2.0mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
生根培养基Ⅱ-2(无激素的培养基)为：改良MS基本培养基+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
6)、移栽(生根植株的移栽)：
将步骤5)所得的生根幼苗(生根植株)取出后，栽培于基质上进行移栽。
作为本发明的胡豆莲的组培快速繁殖方法的改进：
将步骤4)所得的新茎段分割成带1～2个节的切段按照步骤4)所述方法转接于增殖培养基上进行进一步的增殖培养。
即，本发明中步骤4)所得的新茎段具有以下两种用途：
用途一、分割成带1～2个节的切段用于步骤4)的进一步增殖培养；
用途二、不分割用于后续的生根培养。
作为本发明的胡豆莲的组培快速繁殖方法的进一步改进：
所述改良MS培养基为：相对于常规MS培养基而言，将大量元素改为：NH4NO3 600mg/l、K2SO4 680mg/l、KH2PO4 200mg/l、MgSO4.7H2O 370mg/l、Ca(NO3)2.4H2O 800mg/l；其余同常规MS培养基。
作为本发明的胡豆莲的组培快速繁殖方法的进一步改进：
所述步骤3)中的种子萌发培养基：MS+蔗糖30g/l+琼脂7.0～7.1g/l，pH 5.8～6.0。
作为本发明的胡豆莲的组培快速繁殖方法的进一步改进，作为优选：
增殖培养基Ⅰ为改良MS基本培养基+BA 0.5mg/l+NAA 0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
增殖培养基Ⅱ为改良MS基本培养基+mTR 0.8mg/l+NAA 0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0。
生根培养基Ⅰ为改良MS基本培养基+BA 0.1mg/l+NAA 0.4mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
生根培养基Ⅱ-1为改良MS基本培养基+NAA 0.5mg/l+IBA 1.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
作为本发明的胡豆莲的组培快速繁殖方法的进一步改进：
所述步骤6)的基质为泥炭：珍珠岩＝5:1体积比的混合基质。
具体可为：已生根植株的培养瓶转移到自然温度和光照、阴凉干燥的环境下锻炼5～7天，然后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水(液面高度约1～2mm)，再放置1～2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到泥炭：珍珠岩＝5:1的混合基质上培养3～6周，开始1～2周温度为23～25℃，相对湿度为70～80％。随后即可逐渐过渡到自然的环境条件。
作为本发明的胡豆莲的组培快速繁殖方法的进一步改进，所述步骤2)为：
将果实上肉质的果皮剥去，用滴加洗洁精的自来水(200ml自来水加入2～3滴洗洁精)浸泡5～10分钟后，接着用自来水冲洗后放置到超净工作台上：先用75％乙醇处理30sec，再用20％次氯酸钠溶液灭菌12～15分钟，无菌水冲洗3～5次后，得到可用于播种的种子(为消毒后种子)。
作为本发明的胡豆莲的组培快速繁殖方法的进一步改进：
黑暗培养的温度为23～25℃；
光/暗交替培养时：光照培养时，光照强度为35～40μmol.m-2.s-1，时间为16小时，温度为23～25℃；黑暗培养时，培养时间为8小时，温度为23～25℃；上述光照和黑暗培养交替进行。
本发明具有如下技术优势：
1)胡豆莲的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约。
2)增殖速度快(茎段切段的增殖系数可高达10.5)，生产周期较短(全程从种子萌发到移栽约需18～20周)，便于大规模生产。
3)本发明的技术方法解决了胡豆莲快速繁殖过程中植株容易玻璃化的难点，达到技术稳定、繁殖系数高的要求，可应用于规模化生产。
4)可以保存胡豆莲的种质资源，减少对自然资源的破坏。
综上所述，本发明通过大量试验，摸索出一套成熟的方法，成功实现了胡豆莲的组培快繁，可以短时间内快速培育出大量试管苗，为该濒危物种的恢复提供一条切实可行的繁殖方式。
本发明通过大量试验，采用胡豆莲当年生的成熟荚果，摸索出一套成熟的方法，克服了组培苗的玻璃化以及生长缓慢等难题，成功实现了胡豆莲的组培快繁，可以短时间内快速培育出大量试管苗，为该极小种群的恢复提供一条切实可行的繁殖方式，为该珍稀濒危植物的保护以及民间药用提供一种切实可行的开发项目。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为胡豆莲组培快繁培养体系的建立；
图1中，
A.胡豆莲成熟果实；
B.去除果皮的种子；
C.种子在MS基本培养基上萌发形成的无菌苗；
D.无菌苗的下胚轴切段在增殖培养基(改良MS+BA 0.5mg/l+NAA 0.05mg/l)上的增殖培养；
E.茎段切段在增殖培养基(改良MS+mTR 0.8mg/l+NAA0.1 mg/l)上增殖培养；
F.新茎段在生根培养基(改良MS+BA 0.1mg/l+NAA0.4 mg/l)上生根。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明中所提及的缩写字母见如下缩略词如下：
| BA(即，6-BA) | N6-benzylaminopurine | 6-苄基腺嘌呤 |
| IBA | Indole-3-butyric acid | 吲哚丁酸 |
| KT | Kinetin | 激动素 |
| MS | Murashige and Skoog medium | MS培养基 |
| mTR | Meta-topolin riboside | N-(3-羟基苄基)腺苷 |
| NAA | a-Naphthaleneacetic acid | a-柰乙酸 |
| WPM | Wood plant medium | WPM培养基 |
黑暗培养(24小时全部黑暗培养)的温度为23～25℃；
光/暗交替培养(23～25℃)时：光照培养时，光照强度为35～40μmol.m-2.s-1，时间为16小时，温度为23～25℃；黑暗培养时，培养时间为8小时，温度为23～25℃；上述光照和黑暗培养交替进行。
实施例1、一种胡豆莲的组培快速繁殖方法，依次进行以下步骤：
1)、取材：
于10下旬至11月上旬，胡豆莲的肉质荚果呈黑色时，于野外采集果实。
2)、将果实进行果皮的剥离和消毒，得种子：
将果实上肉质的果皮剥去，用滴加洗洁精的自来水(200ml自来水加入2～3滴洗洁精)浸泡5～10分钟，接着用自来水充分冲洗后放置到超净工作台上。先用75％(体积％)乙醇处理30sec，再用20％(体积％)次氯酸钠溶液([原液活性氯(以Cl计)4.5～5.0％]灭菌12～15分钟，无菌水冲洗3～5次后，得到可用于播种的种子(消毒后的种子)。
3)、种子的无菌萌发：
将步骤2)所得的种子播种于种子萌发培养基上，黑暗状态下培养2～3天后转入光/暗交替培养直至顶芽长至2～3cm时停止培养(培养时间约为6周左右)，得无菌苗；
种子萌发培养基：MS+蔗糖30g/l+琼脂7.0～7.1g/l，pH 5.8～6.0。
种子萌发培养基的制备方法为：以MS培养基为基础培养基，在1L的MS培养基中分别加入30g蔗糖、7.0～7.1g琼脂后均匀混合，调节pH为5.8～6.0。可采用常规的1mol/l的KOH或1mol/l的HC1进行pH的调节。
4)、无菌苗下胚轴和茎段切段的增殖培养(快速扩增)：
将所得的无菌苗切除根部后，将下胚轴切成0.3～0.5cm的切段，得下胚轴切段；将子叶以上的茎段切成至少含有一个节的切段，得茎段切段(长度约0.5～0.8cm)；将下胚轴切段、茎段切段均转接于增殖培养基(为针对下胚轴切段和茎段切段的增殖培养基)上进行增殖培养；
说明：无菌苗如图1的C所述，是由由下至上的根部、下胚轴和茎段组成，带有根须的定义为根部；子叶以下定义为下胚轴，子叶以上定义为茎段。
增殖培养基为以下任一：
增殖培养基Ⅰ：改良MS基本培养基+BA 0.4～1.0mg/l+NAA 0.05～0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
增殖培养基Ⅱ：改良MS基本培养基+mTR 0.4～1.0mg/l+NAA 0.05～0.15mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
以增殖培养基Ⅰ为例，其制备方法为：以改良MS培养基为基本培养基，在每1L改良MS培养基加入BA 0.4～1mg，NAA 0.05～0.1mg，30g蔗糖，7.7～7.8g琼脂；并调节pH5.8～6.0。
改良MS培养基为相对于常规的MS培养基而言，仅仅更改大量元素的成分和含量，即大量元素改为：NH4NO3 600mg/l、K2SO4 680mg/l、KH2PO4 200mg/l、MgSO4.7H2O 370mg/l、Ca(NO3)2.4H2O 800mg/l；其余同常规的MS培养基。
备注说明：常规的MS培养基中，大量元素为：KNO3 1900mg/l、NH4NO3 1650mg/l、MgSO4.7H2O 370mg/l、KH2PO4 170mg/l、CaCl2.2H2O 440mg/l。
作为优选：增殖培养基Ⅰ为改良MS基本培养基+BA 0.5mg/l+NAA0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
作为优选：增殖培养基Ⅱ为改良MS基本培养基+mTR 0.8mg/l+NAA0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0。
增殖培养条件为：于23～25℃进行光/暗交替培养；待下胚轴切段或茎段切段上长出丛生状的不定芽(叶腋中长出)，且每个不定芽均为带有≥3个节的茎段时(即，每个不定芽一般为带有3～4个节的茎段，每个不定芽生长至约为2.5～3.5cm)，停止增殖培养，割取不定芽(将不定芽沿基部割取)作为新茎段；
所述丛生状的不定芽是指不定芽的数量至少为3个，一般为3～5个不等；
步骤4)培养时间约为6周左右；
该新茎段具有以下任一用途：
用途一、分割成带1～2个节的切段用于步骤4)的进一步增殖培养；
用途二、不分割用于后续的生根培养。
5)、生根培养：
任选以下任一的方案：
方案一：
将步骤4)所得的新茎段转入生根培养基Ⅰ中进行生根培养；培养条件如下：先在23～25℃暗培养2～3天，然后转入光/暗交替培养；当新茎段的基部产生长度≥3cm的4～6条根时结束生根培养；
生根培养基Ⅰ：改良MS基本培养基+BA 0.05～0.2mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
生根培养基Ⅰ制备方法为：以改良MS培养基为基本培养基，在每1L改良MS培养基中加入BA 0.05～0.2mg、NAA 0.2～0.5mg、蔗糖30g、琼脂7.7～7.8g，调节pH 5.8～6.0。
作为优选：生根培养基Ⅰ为改良MS基本培养基+BA 0.1mg/l+NAA 0.4mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
方案二：
将步骤4)所得的新茎段转入生根培养基Ⅱ-1(激素培养基)上与23～25℃暗培养2～3天后转入光/暗交替培养3～5天，接着再转入生根培养基Ⅱ-2(无激素的培养基)置于光/暗交替培养，当新茎段的基部产生长度≥3cm的4～6条根时，结束生根培养；
生根培养基Ⅱ-1(激素培养基)为：改良MS基本培养基+NAA 0.2～1.0mg/l+IBA1.0～2.0mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0，作为优选：生根培养基Ⅱ-1为改良MS基本培养基+NAA0.5mg/l+IBA1.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
生根培养基Ⅱ-2(无激素的培养基)为：改良MS基本培养基+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
6)、移栽(生根植株的移栽)：
将步骤5)所得的生根幼苗(生根植株)取出后，栽培于泥炭：珍珠岩＝5:1体积比的混合基质上进行移栽。
具体为：已生根植株的培养瓶转移到自然温度和光照、阴凉干燥的环境下锻炼5～7天，然后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水(液面高度约1～2mm)，再放置1～2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到泥炭：珍珠岩＝5:1的混合基质上培养3～6周，开始1～2周温度为23～25℃，相对湿度为70～80％。随后即可逐渐过渡到自然的环境条件。
实验1、对实施例1进行以下的具体参数限定：
步骤3)、采用种子萌发培养基，种子接种第7天开始萌发，约6周后，幼苗长至2～3cm，停止培养。
步骤4)、选用优选的增殖培养基Ⅰ：改良MS+BA 0.5mg/l+NAA 0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7g/l，pH 5.8。
生长2周，下胚轴切段和茎段切段叶腋处的腋芽开始萌发，而后继续培养，腋芽为丛生芽(即，呈丛生状的不定芽)，当培养6周后(从接种在增殖培养基上起算)，每个丛生芽上的不定芽的数目平均为3.5个，不定芽的平均高度为3.8cm。每个不定芽带有3～4个节。此时停止增殖培养，割取不定芽作为新茎段。
增殖倍数的计算公式为：每个切段(下胚轴切段、茎段切段)产生的不定芽的数目*芽伸长后节的数目。芽伸长后节的数目，即，每个不定芽带有的节的数目，按照最低的3个节计算，此方法的增殖倍数为3.5*3＝10.5倍。
步骤5)、将步骤4)所得的新茎段按照方案一进行生根培养；
选用优选的生根培养基Ⅰ：改良MS+BA 0.1mg/l+NAA 0.4mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7g/l，pH 5.8。2周开始生根，6周后统计，植株的生根率达到80％，平均根数为5.5，平均根长3.6cm，植株的平均高度为4.2cm。
炼苗6周后移栽到泥炭和珍珠岩体积比5:1配比的基质，成活率可达85％。
成活率＝移栽成活的植株数目/总的移栽植株的数目。
实验2、对实施例1进行以下的具体参数限定：
步骤3)、采用种子萌发培养基，种子接种第7天开始萌发，约6周后，幼苗长至2～3cm，停止培养。
步骤4)、选用优选的增殖培养基Ⅱ：改良MS+mTR 0.8mg/l+NAA 0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7g/l，pH 5.8；
生长2周，下胚轴切段和茎段切段叶腋处的腋芽开始萌发，而后继续培养，腋芽为丛生芽(即，呈丛生状的不定芽)，当培养6周后(从接种在增殖培养基上起算)，每个丛生芽上的不定芽的数目平均为3个，不定芽的平均高度为4.0cm。每个不定芽带有3～4个节。此时停止增殖培养，割取不定芽作为新茎段。
此方法的增殖倍数为3*3＝9倍。
而后，将新茎段分成以下两种用途：
用途一、将部分的新茎段分割成带1～2个节的切段按照上述步骤4)所述方法进行进一步增殖培养。
用途二、将部分的新茎段直接用于后续的生根培养。
步骤5)、将步骤4)所得的新茎段按照方案二进行生根培养；
选用优选的生根培养基Ⅱ-1以及生根培养基Ⅱ-2(无激素的培养基)；
优选的生根培养基Ⅱ-1为：改良MS+NAA 0.5mg/l+IBA 1.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7g/l，pH 5.8；
生根培养基Ⅱ-2(无激素的培养基)为：改良MS+蔗糖30g/l+琼脂7.7g/l，pH 5.8；
2周后开始生根，6周后统计，植株的生根率达到75％，植株平均高度达到4.0cm。
炼苗6周后移栽到泥炭和珍珠岩按体积比5:1配比的基质，成活率可达78％。
对比例1-1、将实验1的增殖培养基Ⅰ中BA的浓度由0.5mg/l改为1.5mg/l，其余等同于实验1，由于BA浓度太高，增殖培养时，植株产生矮化，当培养6周后，每个丛生芽上的不定芽的数量为4～5个，不定芽矮小，高度约为1.3cm，并且有一定程度的玻璃化，不利于进一步增殖。
对比例1-2、将实验1的增殖培养基Ⅰ中的改良MS改为MS，其余等同于实验1。增殖培养时，植株叶片和茎段发生轻度的玻璃化。增殖倍数6，移栽成活率仅为54％。
对比例1-3、将实验1的增殖培养基Ⅰ中NAA的浓度由0.05mg/l改成0.25mg/l；其余等同于实验1。增殖培养时，茎段基部愈伤组织较大，较硬，直径约0.8cm，不定芽伸长生长受到一定影响，高度约1.6cm。即，该对比例1-3存在茎段基部愈伤化和芽伸长受限的缺陷。
对比例1-4、取消实验1的生根培养基Ⅰ中BA的使用，即BA浓度改为0mg/l，其余等同于实验1。经过相同的生根培养时间(即，6周)，生根率为40％，且根短、细、数量少，移栽成活率为42％。
对比例2-1、将实验2中的增殖培养基Ⅱ由改良MS改为WPM，其余等同于实验2。所得结果为：植株生长较缓慢。增殖倍数约为4.5，移栽成活率约为55％。
对比例2-2、将实验2中的增殖培养基Ⅱ中的“mTR 0.8mg/l”改成“KT 0.8mg/l”，其余等同于实验2。所得结果为：丛生芽上的不定芽数量仅仅为2～3个，不定芽的茎段高度较矮，约2～2.5cm，增殖倍数约为5。
对比例2-3、将实验2生根培养过程中，将培养材料一直放在加有生长素的生根培养基Ⅱ-1上进行，即，中途不转移到无激素的生根培养基Ⅱ-2上，经过相同时间的生根培养，生根率为55％，根短，密集，较细，植株基部有较大的愈伤组织，移栽成活率为45％。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.胡豆莲的组培快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：
取材；获取种子；种子的无菌萌发；增殖培养；生根培养；移栽。
2.根据权利要求1所述的胡豆莲的组培快速繁殖方法，其特征在于：
1)、取材：
采集胡豆莲的果实；
2)、将果实进行果皮的剥离和消毒，得种子；
3)、种子的无菌萌发：
将种子播种于种子萌发培养基上，黑暗状态下培养2～3天后转入光/暗交替培养直至顶芽长至2～3cm时停止培养，得无菌苗；
4)、增殖培养：
将无菌苗切除根部后，将下胚轴切成0.3～0.5cm的切段，得下胚轴切段；将子叶以上的茎段切成至少含有一个节的切段，得茎段切段；将下胚轴切段、茎段切段均转接于增殖培养基上进行增殖培养；
增殖培养基为以下任一：
增殖培养基Ⅰ：改良MS基本培养基+BA 0.4～1.0mg/l+NAA 0.05～0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
增殖培养基Ⅱ：改良MS基本培养基+mTR 0.4～1.0mg/l+NAA 0.05～0.15mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
所述增殖培养为：于23～25℃进行光/暗交替培养；待下胚轴切段或茎段切段上长出丛生状的不定芽，且不定芽为带有≥3个节的茎段时，停止增殖培养，割取不定芽作为新茎段；
5)、生根培养：
任选以下一种方案：
方案一：
将步骤4)所得的新茎段转入生根培养基Ⅰ中进行生根培养；培养条件如下：先在23～25℃暗培养2～3天，然后转入光/暗交替培养；当新茎段的基部产生长度≥3cm的至少4条根时结束生根培养；
生根培养基Ⅰ：改良MS基本培养基+BA 0.05～0.2mg/l+NAA 0.2～0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
方案二：
将步骤4)所得的新茎段转入生根培养基Ⅱ-1上于23～25℃暗培养2～3天后转入光/暗交替培养3～5天，接着再转入生根培养基Ⅱ-2置于光/暗交替培养，当新茎段的基部产生长度≥3cm的至少4条根时，结束生根培养；
生根培养基Ⅱ-1为：改良MS基本培养基+NAA 0.2～1.0mg/l+IBA 1.0～2.0mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
生根培养基Ⅱ-2为：改良MS基本培养基+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
6)、移栽：
将步骤5)所得的生根幼苗取出后，栽培于基质上进行移栽。
3.根据权利要求2所述的胡豆莲的组培快速繁殖方法，其特征在于：
将步骤4)所得的新茎段分割成带1～2个节的切段按照步骤4)所述方法转接于增殖培养基上进行进一步的增殖培养。
4.根据权利要求2或3所述的胡豆莲的组培快速繁殖方法，其特征在于：
所述改良MS培养基为：相对于常规MS培养基而言，将大量元素改为：NH4NO3 600mg/l、K2SO4 680mg/l、KH2PO4 200mg/l、MgSO4.7H2O 370mg/l、Ca(NO3)2.4H2O 800mg/l；其余同常规MS培养基。
5.根据权利要求4所述的胡豆莲的组培快速繁殖方法，其特征在于：
所述步骤3)中的种子萌发培养基：MS+蔗糖30g/l+琼脂7.0～7.1g/l，pH 5.8～6.0。
6.根据权利要求5所述的胡豆莲的组培快速繁殖方法，其特征在于：
增殖培养基Ⅰ为改良MS基本培养基+BA 0.5mg/l+NAA 0.05mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
增殖培养基Ⅱ为改良MS基本培养基+mTR 0.8mg/l+NAA 0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0。
生根培养基Ⅰ为改良MS基本培养基+BA 0.1mg/l+NAA 0.4mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0；
生根培养基Ⅱ-1为改良MS基本培养基+NAA 0.5mg/l+IBA 1.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂7.7～7.8g/l，pH 5.8～6.0。
7.根据权利要求2～6任一所述的胡豆莲的组培快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤6)的基质为泥炭：珍珠岩＝5:1体积比的混合基质。
8.根据权利要求2～6任一所述的胡豆莲的组培快速繁殖方法，其特征在于所述步骤2)为：
将果实上肉质的果皮剥去，用滴加洗洁精的自来水浸泡5～10分钟后，接着用自来水冲洗后放置到超净工作台上：先用75％乙醇处理30秒，再用20％次氯酸钠溶液灭菌12～15分钟，无菌水冲洗3～5次后，得到可用于播种的种子。
9.根据权利要求2～7任一所述的胡豆莲的组培快速繁殖方法，其特征在于：
黑暗培养的温度为23～25℃；
光/暗交替培养时：光照培养时，光照强度为35～40μmol.m-2.s-1，时间为16小时，温度为23～25℃；黑暗培养时，培养时间为8小时，温度为23～25℃；上述光照和黑暗培养交替进行。
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