CN115777533B - 一种以西南桦节间茎段为外植体的再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以西南桦节间茎段为外植体的再生方法。本发明方法包括茎段材料的培养、茎段愈伤诱导培养、不定芽分化培养、生根培养、炼苗及移栽的步骤。本发明在无性系水平上采用节间茎段有效地建立了西南桦再生体系，与已报道的带腋芽的茎段、萌芽条等作为外植体构建的直接器官发生体系相比，该法具有生长周期短、材料利用率高、操作简单、繁殖系数高等优势。本发明不仅可以应用于优良无性系苗木的规模化生产，还可为通过转基因研究进行西南桦种质创新奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以西南桦节间茎段为外植体的再生方法。
背景技术
西南桦(Betula alnoides Buch.-Ha m.ex D.Don)为我国南方造林面积最大的乡土珍贵阔叶树种之一，其木材材质优良，是制作木地板、高档家具、乐器等的优良材料，其树皮可用于治疗感冒、产后疼痛以及消化系统和骨科疾病等多种疾病，具有较高的经济价值。同时，西南桦在生物多样性和地力维持、水源涵养以及碳素固定等方面都发挥着重要作用，被广泛应用于生态公益林和珍贵用材林建设。因其重要的生态和经济价值，被列为国家科技计划研究的重要树种之一，对其遗传改良的范围也在不断扩大，其主要目标是培育速生、优质和高抗的林木新品种。因此利用分子生物学手段为林木新品种培育提供材料，具有重要的应用前景。其中遗传转化技术是林木改良的有效手段，而高效稳定的再生体系是遗传转化的必要前提。
西南桦的离体培养主要有直接器官发生、间接器官发生及体胚发生3种形态重建方式。目前能形成完整植株的主要是通过直接器官发生途径，特别是腋芽萌发途径，但该途径的增殖率通常较低，只适合于西南桦优良品种的大规模扩繁并不适用于遗传转化方法。间接器官发生是离体培养中通过外植体诱导愈伤组织再分化的形态建成过程。相比直接器官发生具有更高的潜在繁殖系数，其作为分子育种的平台也更具优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种间接器官发生途径再生西南桦的方法，即一种以西南桦节间茎段为外植体，经过愈伤诱导和分化的再生方法，可为建立西南桦遗传转化体系以及其种苗的工厂化生产提供技术支撑，具有重要的理论和实践意义。
本发明的一种以西南桦节间茎段为外植体的再生方法，包括以下步骤：
a.将西南桦试管苗接种至茎段伸长培养基，在光照强度1000lx条件下培养15d后，进行黑暗培养7d，继续在光照强度2000lx条件下培养8d，获得茎段伸长的无菌苗；
b.取步骤a培养获得的无菌苗，避开腋芽只取茎段节间部分，剪成4 -7mm长度茎段接种至愈伤诱导培养基，暗培养15d，培养诱导愈伤；
c.将步骤b的愈伤接种至不定芽分化培养基，在2000lx光照条件下培养，促进愈伤分化出不定芽；
d.待步骤c中的不定芽长至2-3cm高度，剪下接种至生根培养基，光照条件下培养，获得生根苗；然后适时炼苗、移栽。
优选，所述的茎段伸长培养基：每升含有NAA 0.15mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
优选，所述的愈伤诱导培养基：每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPB5培养基，pH 6.0。
优选，所述的WPB5培养基为，用B5培养基的有机物质替换WPM培养基中有机物质、保留WPM培养基其余组分的培养基，WPB5培养基中每升含有机物质为肌醇100mg、VB110mg、VB6 1mg、烟酸1mg。
优选，所述的不定芽分化培养基：每升含有槲皮素0.05mg、6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
优选，所述的不定芽分化培养基：每升含有水杨酸2μmol、6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
优选，所述的生根培养基：每升含有NAA 0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
优选，所述的步骤a、c和d中的在光照条件下培养，其光照时间为16h/d。
优选，所述的步骤a、b、c和d中的培养温度为23℃-25℃。
优选，所述的西南桦试管苗为西南桦2号无性系试管苗。
本发明的有益效果：本发明在无性系水平上采用节间茎段有效地建立了西南桦再生体系，具有生长周期短、材料利用效率高、操作简单、繁殖系数高等优势，是一种可直接用于西南桦遗传转化的高频再生体系。
附图说明
图1是实施例1中各阶段培养的西南桦2号无性系的生长状态；图A：在茎段伸长培养基上，光照培养(1000lx，光照时间16h/d)15d后暗培养7d，再光照培养(2000lx，光照时间16h/d)8d后，西南桦2号无性系的生长状态；图B：西南桦2号无性系节间茎段在愈伤诱导培养基(每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPB5培养基)上暗培养15d时的生长状态；图C：西南桦2号无性系节间茎段经愈伤诱导后在不定芽分化培养基上光照培养60d时的生长状态；图D：不定芽在生根培养基上光照培养30d的生长状态；图E：生根苗移栽70d时的生长状态。
图2为对比例1中在茎段伸长培养基(每升含有NAA 0.15mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基)上，2000lx光照培养(光照时间16h/d)30d后，西南桦2号无性系的生长状态。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例及对比例中所用的西南桦为西南桦2号无性系。
以下实施例及对比例中光照条件下培养的光照时间均为16h/d；各阶段的培养温度均为23℃-25℃。
以下实施例或对比例中所用的WPM培养基为本领域已知配方的通用培养基，其成份和配置方法见G.LOYD et al.；Commercially-feasible micropropagation ofmountain laurel,Kalmia latifolia,by use of shoot-tip culture.CombinedProceedings International Plant Propagators Society,30,421(1980).WPB5培养基为用B5培养基的有机物质替换WPM培养基中有机物质、保留WPM培养基其余组成的培养基，WPB5培养基中每升含有机物质为肌醇100mg、VB1 10mg、VB6 1mg、烟酸1mg。以下实施例或对比例中所用的MS培养基是指本领域已知配方的通用培养基，其成份和配置方法见ToshioMurashige,Folke Skoog；A Revised Medium For Rapid Growth And Bio Assays WithTobacco Tissue Cultures.Physiollogia Plantarum,15:473-497(1962)；1/2MS培养基是MS培养基中大量元素减半，而其它成分不变的培养基。
实施例1
一种以西南桦节间茎段为外植体的再生方法(器官发生途径的组织培养再生方法)，包括以下步骤：
(1)茎段材料培养：将西南桦2号无性系试管苗(无菌苗)接种至茎段伸长培养基，在光照强度1000lx条件下培养15d后，进行黑暗培养7d，继续在光照强度2000lx条件下培养8d，在茎段伸长培养基共培养1个月后获得茎段伸长的无菌苗(图1A)用于茎段取材。所述的茎段伸长培养基：每升含有NAA 0.15mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0；所述的光照条件下培养的光照时间为16h/d。
(2)茎段愈伤诱导培养：取步骤(1)的健壮无菌苗，避开腋芽只取茎段节间部分，剪成4-7mm长度茎段接种至愈伤诱导培养基，暗培养15d(图1B)，培养诱导愈伤。所述的愈伤诱导培养基：每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPB5培养基，pH6.0。WPB5培养基为用B5培养基的有机物质替换WPM培养基中有机物质、保留WPM培养基其余组成的培养基，WPB5培养基中每升含有机物质为肌醇100mg、VB1 10mg、VB6 1mg、烟酸1mg。
(3)不定芽分化：将步骤(2)的愈伤接种至不定芽分化培养基，在2000lx光照条件下培养(光照时间16h/d)，促进愈伤分化出不定芽。培养60d的生长状态如图1C所示。所述的不定芽分化培养基：每升含有槲皮素0.05mg、6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。培养2个月后分化率达94.44％，净增殖系数达6.23，总增殖系数达5.89。
(4)生根培养：待步骤(3)的不定芽长至2-3cm左右高度，剪下接种至生根培养基，培养获得生根苗。培养30d的生长状态如图1D所示。所述的生根培养基：每升含有NAA0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
(5)炼苗移栽：将步骤(4)的生根苗在自然光下闭瓶炼苗15-20d后，洗净根部残留的培养基，移栽于混合基质(黄心土：珍珠岩：蛭石体积比为3：2：2)中，然后立即覆膜保湿，移栽1周后逐渐进行通风降湿，待移栽苗叶片不再萎蔫时完全去除覆盖材料。生根苗移栽70d时的生长状态如图1E所示。
实施例2
本实施例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于：本实施例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素，而含有水杨酸2μmol/L；即本实施例的不定芽分化培养基每升含有水杨酸2μmol、6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH6.0。
实施例3
本实施例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于：本实施例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素，而含有水杨酸1μmol/L；即本实施例的不定芽分化培养基每升含有水杨酸1μmol、6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH6.0。
实施例4
本实施例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于：本实施例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本实施例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA30.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
实施例5
本实施例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下两点：
(1)本实施例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为先在光照强度2000lx条件下培养15d，黑暗培养7d后转到光照强度1000lx条件下培养8d后用于茎段取材，所述的光照条件下培养的光照时间为16h/d。
(2)本实施例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本实施例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
实施例6
本实施例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下两点：
(1)本实施例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为先在光照强度2000lx条件下培养15d，黑暗培养7d后转到光照强度2000lx条件下培养8d后用于茎段取材，所述的光照条件下培养的光照时间为16h/d。
(2)本实施例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本实施例的不定芽分化培养基每升含有6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
实施例7
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下两点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度1000lx条件下培养30d后用于茎段取材，所述的光照条件下培养的光照时间为16h/d。
(2)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例1
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下两点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx、光照时间16h/d的条件下培养30d(图2)，然后用于茎段取材。
(2)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例2
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于：本对比例的不定芽分化培养基中含有槲皮素浓度为0.1mg/L；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有槲皮素0.1mg、6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例3
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下两点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为先在光照强度1000lx条件下培养15d，黑暗培养7d后转到光照强度1000lx条件下培养8d后用于茎段取材，所述的光照条件下培养的光照时间为16h/d。
(2)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例4
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的步骤(2)茎段愈伤诱导培养中，茎段接种至愈伤诱导培养基中暗培养的时间为20d。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例5
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中NAA浓度与实施例1不同，每升含有NAA 0.1mg；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPB5培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例6
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于：本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素，而含有水杨酸5μmol/L；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有水杨酸5μmol、6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH6.0。
对比例7
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下两点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为先在光照强度1000lx条件下培养15d，然后黑暗培养15d后用于茎段取材，所述的光照条件下培养的光照时间为16h/d。
(2)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例8
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于：本对比例的不定芽分化培养基中含有槲皮素浓度为0.2mg/L；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有槲皮素0.2mg、6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例9
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下两点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为先在光照强度2000lx条件下培养15d，然后黑暗培养15d后用于茎段取材，所述的光照条件下培养的光照时间为16h/d。
(2)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例10
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，所述的光照条件下培养的光照时间为16h/d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中TDZ浓度与实施例1不同，每升含有TDZ 2.0mg；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 2.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPB5培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例11
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中NAA浓度与实施例1不同，每升含有NAA 0.5mg；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.5mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPB5培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例12
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中TDZ浓度与实施例1不同，每升含有TDZ 0.5mg；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 0.5mg、NAA 0.5mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPB5培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例13
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中所用的基本培养基为WPM培养基；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例14
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中NAA浓度与实施例1不同，每升含有NAA 0.05mg；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.05mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPB5培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例15
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的步骤(2)茎段愈伤诱导培养中，茎段接种至愈伤诱导培养基中暗培养的时间为10d。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例16
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中TDZ浓度与实施例1不同，每升含有TDZ 0.1mg；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 0.1mg、NAA 0.5mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPB5培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例17
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中所用的基本培养基为1/2MS培养基；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 1.0mg、NAA0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为1/2MS培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例18
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中不含NAA；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 1.0mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPB5培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例19
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(1)茎段材料培养中，试管苗接种至茎段伸长培养基后的培养方式为在光照强度2000lx条件下培养30d后用于茎段取材，光照时间为16h/d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中所用的基本培养基为MS培养基；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为MS培养基，pH6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例20
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(2)愈伤诱导培养中，是剪取叶片(而非茎段)接种至愈伤诱导培养基中暗培养15d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中所用的基本培养基为MS培养基；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为MS培养基，pH6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例21
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下两点：
(1)本对比例的步骤(2)愈伤诱导培养中，是剪取叶片(而非茎段)接种至愈伤诱导培养基中暗培养15d。
(2)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例22
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(2)愈伤诱导培养中，是剪取叶片(而非茎段)接种至愈伤诱导培养基中暗培养15d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中所用的基本培养基为WPM培养基；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA 1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
对比例23
本对比例其余条件方法均与实施例1相同，与实施例1不同在于以下三点：
(1)本对比例的步骤(4)愈伤诱导培养中，是剪取叶片(而非茎段)接种至愈伤诱导培养基中暗培养15d。
(2)本对比例的愈伤诱导培养基中所用的基本培养基为1/2MS培养基；即本对比例的愈伤诱导培养基每升含有TDZ 1.0mg、NAA 0.2mg、蔗糖20g和琼脂5.8g，余量为1/2MS培养基，pH 6.0。
(3)本对比例的不定芽分化培养基中不含有槲皮素；即本对比例的不定芽分化培养基每升含有6-BA1.0mg、GA3 0.5mg、蔗糖30g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
上述的实施例及对比例中不同的处理方式对西南桦茎段伸长及再生的影响结果见表1。表1中的平均株高和平均节间长度是指经对应的步骤(1)茎段材料培养阶段的结果，分化率、净增殖系数、总增殖系数为经对应的步骤(1)、(2)培养至步骤(3)不定芽分化阶段的结果。其中分化率(％)＝分化愈伤组织数/接种愈伤组织数×100；净增殖系数＝不定芽总数/分化愈伤组织数；总增殖系数＝不定芽总数/接种愈伤组织数。
表1不同处理方式对西南桦茎段伸长及再生的影响
Claims (4)
1.一种以西南桦节间茎段为外植体的再生方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将西南桦试管苗接种至茎段伸长培养基，在光照强度1000 lx条件下培养15 d后，进行黑暗培养7 d，继续在光照强度2000 lx条件下培养8 d，获得茎段伸长的无菌苗；所述的茎段伸长培养基：每升含有NAA 0.15 mg、蔗糖20 g和琼脂5.8 g，余量为WPM培养基，pH6.0；
b.取步骤a培养获得的无菌苗，避开腋芽只取茎段节间部分，剪成4 -7 mm长度茎段接种至愈伤诱导培养基，暗培养15 d，培养诱导愈伤；所述的愈伤诱导培养基：每升含有TDZ1.0 mg、NAA 0.2 mg、蔗糖20 g和琼脂5.8 g，余量为WPB5培养基，pH 6.0；所述的WPB5培养基为用B5培养基的有机物质替换WPM培养基中有机物质、保留WPM培养基其余组成的培养基，WPB5培养基中每升含有机物质为肌醇100 mg、VB1 10 mg、VB6 1 mg、烟酸1 mg；
c.将步骤b的愈伤接种至不定芽分化培养基，在2000 lx光照条件下培养，促进愈伤分化出不定芽；所述的不定芽分化培养基，为如下的（1）或（2）；（1）每升含有槲皮素0.05 mg、6-BA 1.0 mg、GA3 0.5 mg、蔗糖30 g和琼脂5.8 g，余量为WPM培养基，pH 6.0；（2）所述的不定芽分化培养基：每升含有水杨酸2 μmol、6-BA 1.0 mg、GA3 0.5 mg、蔗糖30 g和琼脂5.8g，余量为WPM培养基，pH 6.0；
d.待步骤c中的不定芽长至2-3 cm高度，剪下接种至生根培养基，光照条件下培养，获得生根苗；然后适时炼苗、移栽；所述的生根培养基：每升含有NAA 0.2 mg、蔗糖20 g和琼脂5.8 g，余量为WPM培养基，pH 6.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a、c和d中的光照时间为16 h/d。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a、b、c和d中的培养温度为23℃-25℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的西南桦试管苗为西南桦2号无性系试管苗。
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| Enhanced In Vitro Shoot Regeneration in Oldenlandia umbellata L. by Using Quercetin: A Naturally Occurring Auxin-Transport Inhibitor;S. R. Saranya Krishnan等;《Proc. Natl. Acad. Sci., India, Sect. B Biol. Sci.》;第1-6页 * |
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