CN109220796B - 一种云木香组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种云木香组织培养方法，包括(1)无菌体系建立、(2)愈伤组织诱导、(3)愈伤组织增殖、(4)丛生芽分化、(5)丛生芽生根系列步骤。本发明的云木香组织培养方法显著提高了愈伤组织诱导率、增殖系数、丛生芽分化率、生根率，组培效率高，成本低，具备市场化应用价值。

Description

一种云木香组织培养方法
技术领域
本发明涉及中药组培领域，尤其涉及一种云木香组织培养方法。
背景技术
云木香(Aucklandia lappa Decne.)为菊科云木香属植物，以根入药。有行气止痛，健脾消食的功效，主要用于胸脘胀痛，泻痢后重，食积不消，不思饮食等症，以云木香为原料药的中药制剂有近200种，年需求量约4500吨。云木香原产克什米尔，我国引种于云南丽江，后在广西、四川、贵州、陕西等省均有栽培，云南滇西北为主要产区，一般栽于海拔2000-4000米的高山地区。
云木香不仅可入药，由于其全株含芳香油，经提取后可用作高级香水香精或化妆品，亦是食用调料的重要来源之一，除满足国内市场外，亦成为中国的主要出口药材品种之一。近年来，随着用途的不断开发，云木香市场需求量逐年上升，栽培面积亦随之扩大。
由于云木香药材目前生产上主要用种子进行繁殖，而种子繁殖通过长期的杂交，存在种间品系的多极分化，使得有效成分木香烃内酯、去氢木香烃内酯以及香料成分芳香油含量在国内栽培过程中出现不定向变异，最终导致云木香质量参差不齐，同时传统种子繁殖的繁殖周期为3-4年，繁殖周期长，对高品质云木香品系的规模化生产存在瓶颈。
针对以上不足，本发明利用现代生物组培技术，提出了一种云木香组织培养方法，不仅能最大限度保持优良母本的性状，还具有繁殖周期短、成本低的优点。
发明内容
针对以上所述现有技术的不足，提出了一种操作简便、生产效率高、生产成本低的云木香组织培养方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种云木香组织培养方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)无菌体系建立、(2)愈伤组织诱导、(3)愈伤组织增殖、(4)丛生芽分化、(5)丛生芽生根；
优选地，步骤(1)所述的无菌体系建立包含以下步骤：取云木香种子，经消毒后接种于无菌苗诱导培养基中，在人工控制的环境下培养；
优选地，步骤(2)所述的愈伤组织诱导包含以下步骤：取无菌苗，茎叶分别剪成0.8～1.2cm，接种于愈伤诱导培养基中，在人工控制的环境下培养；
优选地，步骤(3)所述的愈伤组织增殖包含以下步骤：将诱导出的愈伤组织切成小块接种于愈伤增殖培养基中，在人工控制的环境下培养；
优选地，步骤(4)所述的丛生芽分化包含以下步骤：将经增殖培养或诱导培养的愈伤组织切成小块，接种于丛生芽分化培养基中，在人工控制的环境下培养；
优选地，步骤(5)所述的丛生芽生根包含以下步骤：将诱导出的丛生芽切成单芽，接种在生根培养基中，在人工控制的环境下培养；
更加优选地，步骤(1)所述的无菌苗诱导培养基为：1/2MS+GA3 0.1～1.0mg/L+活性炭0.5g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为23～27℃，光照强度1000～2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养；
更加优选地，步骤(2)所述的愈伤诱导培养基为：改良MS+NAA0.2～2.0mg/L+6-BA0.5～2.0mg/L+活性炭0.5g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为23～27℃，光照强度1000～2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养；
更加优选地，步骤(3)所述的愈伤增殖培养基为：改良MS+NAA0.1～1.0mg/L+6-BA1.0～3.0mg/L+活性炭0.5g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为23～27℃，光照强度1000～2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养；
更加优选地，步骤(4)所述的丛生芽分化培养基为：改良MS+6-BA 0.5～3.0mg/L+香蕉50g/L+土豆50g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为23～27℃，光照强度3000～4000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养；
更加优选地，步骤(5)所述的生根培养基为：改良MS+NAA0.2～1.0mg/+IBA 1.0～2.0mg/L+活性炭1.0g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤：培养温度为23～27℃，光照强度3000～4000lx，单日光照时间12h进行光暗交替培养；
更加优选地，所述的改良MS培养基的成分为：NH4NO3：0.40g/L，KH2PO4：0.17g/L，MgSO4·7H2O：0.37g/L，KNO3：1.90g/L，CaCl2·2H2O：0.22g/L，EDTA-Na2：37.30mg/L，FeSO4.7H2O：27.80mg/L，肌醇：100.00mg/L，烟酸：0.50mg/L，甘氨酸：2.00mg/L，VB6：0.50mg/L，VB1：0.10mg/L，KI：0.83mg/L，H3BO3：6.20mg/L，MnSO4.H2O：16.90mg/L，ZnSO4.7H2O：8.60mg/L，NaMoO4.2H2O：0.25mg/L，CuSO4.5H2O：0.025mg/L。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的云木香组织培养方法，是一种无性繁殖方法，能最大程度的保持亲本性状，仅需少量种子，经过短期培养后，即可获得大量完整健壮种苗。
(2)本发明可根据用途筛选木香烃内酯及去氢木香烃内酯含量较高或芳香油含量较高的株系，人工干预自交获得的种子经过本发明的无性快繁，可定向性规模化生产优质种苗。
(3)本发明的云木香组织培养方法，愈伤增值率、丛生芽分化率、丛生芽生根率高，成本低廉，具有极高的产业推广价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步的说明，但本发明并不局限于此。
实施例1
1、取优质品系的云木香种子，用手术刀剥去种皮，后用洗洁精溶液涮洗7min，漂洗3次后用自来水冲淋40min。
2、将清洁好的云木香种子，用3％双氧水浸泡4h，75％酒精消毒30s，无菌水涮洗3次，0.05％升汞溶液消毒8min，无菌水涮洗7次。
3、将消毒好的种子用无菌纸吸去表面水分，接种于1/2MS+GA3 0.1～1.0mg/L+活性炭0.5g/L无菌苗诱导培养基中，在温度为25±1℃，以光照强度2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替的环境下培养40天。
4、将诱导出的无菌苗的茎、叶分别切成0.8～1.2cm，接种于改良MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+活性炭0.5g/L的愈伤诱导培养基中，在温度为25±1℃，以光照强度2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替的环境下培养40天，记录愈伤组织诱导情况。
5、将诱导出的愈伤组织切成0.5～1.0cm大小，接种于改良MS+NAA 0.1mg/L+6-BA1.0mg/L+活性炭0.5g/L的愈伤增殖培养基中，在温度为25±1℃，以光照强度2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替的环境下培养40天，记录愈伤组织增殖情况。
6、将经愈伤增殖获得的愈伤组织切成1.0～1.5cm的小块，接种于改良MS+6-BA0.5mg/L+香蕉50g/L+土豆50g/L的丛生芽分化培养基中，在温度为25±1℃，以光照强度4000lx，单日光照时间12h进行光暗交替的环境下培养60天，记录丛生芽分化情况。
7、将诱导出的丛生芽，切成单芽，按极性接种于改良MS+NAA0.2mg/L+IBA 2.0mg/L+活性炭1.0g/L的生根培养基中，在温度为25±1℃，光照强度4000lx，单日光照时间12h进行光暗交替环境下培养35天，记录生根情况。
改良MS培养基的成分为：NH4NO3：0.40g/L，KH2PO4：0.17g/L，MgSO4·7H2O：0.37g/L，KNO3：1.90g/L，CaCl2·2H2O：0.22g/L，EDTA-Na2：37.30mg/L，FeSO4·7H2O：27.80mg/L，肌醇：100.00mg/L，烟酸：0.50mg/L，甘氨酸：2.00mg/L，VB6：0.50mg/L，VB1：0.10mg/L，KI：0.83mg/L，H3BO3：6.20mg/L，MnSO4·H2O：16.90mg/L，ZnSO4·7H2O：8.60mg/L，NaMoO4·2H2O：0.25mg/L，CuSO4·5H2O：0.025mg/L。
实施例2
1、取优质品系的云木香种子，人工剥去种皮，用洗洁精溶液涮洗10min，漂洗4次后用自来水冲淋60min。
2、将清洁好的云木香种子，用3％双氧水浸泡3h，75％酒精消毒20s，无菌水涮洗3次，0.05％升汞溶液消毒10min，无菌水涮洗8次。
3、将消毒好的种子用无菌纸吸去表面水分，接种于1/2MS+GA3 1.0mg/L+活性炭0.5g/L无菌苗诱导培养基中，在温度为25±2℃，以光照强度1000lx，单日光照时间12h进行光暗交替的环境下培养45天。
4、将诱导出的无菌苗的茎、叶分别切成0.8～1.2cm，接种于改良MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+活性炭0.5g/L的愈伤诱导培养基中，在温度为25±2℃，以光照强度1000lx，单日光照时间12h进行光暗交替的环境下培养50天，记录愈伤组织诱导情况。
5、将诱导出的愈伤组织切成0.5～1.0cm大小，接种于改良MS+NAA 0.6mg/L+6-BA3.0mg/L+活性炭0.5g/L的愈伤增殖培养基中，在温度为25±2℃，以光照强度2000lx，单日光照时间12h进行光暗交替的环境下培养40天，记录愈伤组织增殖情况。
6、将经愈伤诱导获得的愈伤或经愈伤增殖获得的愈伤组织切成1.0～1.5cm的小块，接种于改良MS+6-BA 2.0mg/L+香蕉50g/L+土豆50g/L的丛生芽分化培养基中，在温度为25±2℃，以光照强度3000lx，单日光照时间12h进行光暗交替的环境下培养60天，记录丛生芽分化情况。
7、将诱导出的丛生芽，切成单芽，按极性接种于改良MS+NAA 1.0mg/L+IBA 1.5mg/L+活性炭1.0g/L的生根培养基中，在温度为25±2℃，以光照强度3000lx，单日光照时间12h进行光暗交替环境下培养35天，记录生根情况。
改良MS培养基的成分为：NH4NO3：0.40g/L，KH2PO4：0.17g/L，MgSO4·7H2O：0.37g/L，KNO3：1.90g/L，CaCl2·2H2O：0.22g/L，EDTA-Na2：37.30mg/L，FeSO4·7H2O：27.80mg/L，肌醇：100.00mg/L，烟酸：0.50mg/L，甘氨酸：2.00mg/L，VB6：0.50mg/L，VB1：0.10mg/L，KI：0.83mg/L，H3BO3：6.20mg/L，MnSO4·H2O：16.90mg/L，ZnSO4·7H2O：8.60mg/L，NaMoO4·2H2O：0.25mg/L，CuSO4·5H2O：0.025mg/L。
对比例1
按照专利CN104285795说明书实施例1的方法进行培养。
对实施例1-2、对比例1各项数据进行统计分析，结果见下表。
Figure BDA0001822675550000061
Figure BDA0001822675550000071
由此可知，本发明的云木香组织培养方法，愈伤组织诱导率、增殖系数、丛生芽分化率、生根率均优于现有技术，可见本发明的组织培养方法具有市场推广价值。

Claims (1)

1.一种云木香组织培养方法,其特征在于,包含以下步骤:
(1)无菌体系建立:取云木香种子,经消毒后接种于无菌苗诱导培养基中,在人工控制的环境下培养；所述的无菌苗诱导培养基为:1/2MS+GA3 0.1~1. 0mg/L+活性炭0.5g/L;所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤:培养温度为23 ~27℃,光照强度1000~20001x,单日光照时间12h进行光暗交替培养；
(2)愈伤组织诱导:取无菌苗,茎叶分别剪成0.8~1.2cm,接种于愈伤诱导培养基中,在人工控制的环境下培养；所述的愈伤诱导培养基为:改良MS+NAA 0.2~2. 0mg/L+6-BA 0.5~2. 0mg/L+活性炭0.5g/L:所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤:培养温度为23~27℃,光照强度1000~20001x单日光照时间12h进行光暗交替培养；
(3)愈伤组织增殖:将诱导出的愈伤组织切成小块接种于愈伤增殖培养基中,在人工控制的环境下培养； 所述的愈伤增殖培养基为:改良MNS+NAA 0.1~1.0mg/L+6-BA 1.0~3.0mg/L+活性炭0.5g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤:培养温度为23~27℃,光照强度1000~20001x,单日光照时间12h进行光暗交替培养；
(4)丛生芽分化:将经增殖培养或诱导培养的愈伤组织切成小块,接种于丛生芽分化培养基中,在人工控制的环境下培养；所述的丛生芽分化培养基为:改良MS+6-BA 0. 5~3.0mg/L+香蕉50g/L+土豆50g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤:培养温度为23~27℃ ,光照强度3000~40001x,单日光照时间12h进行光暗交替培养；
(5)丛生芽生根:将诱导出的丛生芽切成单芽,接种在生根培养基中,在人工控制的环境下培养；所述的生根培养基为:改良MS+NAA 0. 2~1.0mg/+IBA1.0~2.0mg/L+活性炭1.0g/L；所述的在人工控制的环境下培养包含以下步骤:培养温度为23~27℃,光照强度3000~40001x,单日光照时间12h进行光暗交替培养；
所述步骤(2)-步骤(5)中的改良MS培养基的成分为: NH4NO3：0.40g/L，KH2P04：0.17g/L，MgS04·7H20：0.37g/L，KNO3：1. 90g/L，CaCl2·2H20:0. 22g/L，EDTA-Na2:37.30mg/L，FeSO4·7H20：27.80mg/L，肌醇：100.00mg/L，烟酸：0.50mg/L，甘氨酸：2.00mg/L，VB6：0.50mg/L，VB1：0.10mg/L，KI：0.83mg/L，H3BO3：6.20mg/L，MnS04·H20：16. 90mg/L，ZnS04·7H20：8 .60mg/L，NaMo04·2H20：0 .25mg/L，CuS04·5H20：0. 025mg/L。
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