CN108419671A - 一种多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法 - Google Patents

Abstract

本发明主要涉及中药组织培养繁殖育苗技术领域，公开了一种多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，包括：材料选择、培养基制备、嫩芽消毒、嫩芽接种、培养管理、炼苗移植；本发明提供的多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，方法简单，操作方便，生根率达到94%，移植后成活率达到96%，节约大量育苗成本；选择嫩芽作为组织培养的材料，能够进行光合作用，减少对培养基中营养成分的依赖，同时嫩芽采取后置于低温氨甲环酸溶液中进行浸泡，加快嫩芽细胞的分裂，提高嫩芽生根率；向MS培养基中加入甲钴胺和亚硒酸钠，能够抑制嫩芽上的杂菌生长，提高伤口处细胞的原生质活性，加快愈伤组织的形成和分化，提高育苗效率。

Description

一种多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法

技术领域

本发明主要涉及中药组织培养繁殖育苗技术领域，尤其涉及一种多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法。

背景技术

黄精的种类很多，有滇黄精、黄精、囊丝黄精及多花黄精，其中以多花黄精的品质最佳，多花黄精含有丰富的多糖、低聚糖、黄酮、蒽醌、皂苷和木脂素等，为滋补上品，能够能够润肺止咳、健脾养胃、抗病原微生物、治疗糖尿病、缓解疲劳、抗氧化、延缓衰老、止血、保护心脑血管、抗病毒，随着人们对多花黄精保健功能的认识，其需求量也在不断增加，多花黄精的规模化繁殖育苗和种植成为一种发展趋势；目前多花黄精多为根茎繁殖和种子繁殖，根茎繁殖容易使多花黄精失去优良性状，种子繁殖的周期太长，种子采收后需要沙藏5个月左右，播种后4个月出生根茎才能完全长成，而且发芽率只能达到70%左右，3~4年才能采挖，种植效率太低；因此多花黄精新的繁殖繁殖方法成为研究热点，文献“多花黄精组织培养技术，周建金等”报道了多花黄精的以根茎为材料进行组织培养，而黄精是以根茎为中药材，对中药造成很大的浪费，并且文献中先将根茎进行诱导培养，愈伤组织形成后再进行切分，进行增殖培养，然后再将芽苗转入生根培养基进行生根培养，反复多次进行切分和转移，容易使培养组织受到杂菌污染，而且操作时需要在超净工作台，需要专人进行培养，浪费大量的人力和物力，因此，需要一种新的多花黄精组织培养技术。

发明内容

为了弥补已有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法。

一种多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，包括以下步骤：

（1）材料选择：选择性状优良的多花黄精，剪取嫩芽，避免对中药材料根茎的浪费，而且嫩芽的叶片能够进行光合作用，减少嫩芽对培养基中营养成分的依赖，流水冲洗40~60分钟，置于质量浓度为10~15mg/L的氨甲环酸溶液中，于6~8℃浸泡2~3小时，加快嫩芽细胞的分裂，促进愈伤组织的形成和分化，提高嫩芽生根率，得培养嫩芽；

（2）培养基制备：配置MS组织培养的固体培养基，加入甲钴胺和亚硒酸钠，使甲钴胺质量浓度为1.2~1.4mg/L，亚硒酸钠质量浓度为11~13mg/L，能够抑制嫩芽上的杂菌生长，避免感染腐烂，提高伤口处细胞的原生质活性，促进细胞分裂，加快愈伤组织的形成和分化，缩短根系的形成时间，提高育苗效率，分装于培养瓶中，于121℃灭菌25~30分钟，自然冷却，得培养基；

（3）嫩芽消毒：将培养嫩芽置于超净工作台中，先用体积分数为75%的酒精浸泡30~40秒，无菌水冲洗4~5次，再置于0.2%的升汞中浸泡10~15分钟，无菌水冲洗7~8次，清除表面粘附的杂菌，避免嫩茎污染腐烂，提高嫩茎生根率，得消毒嫩芽；

（4）嫩芽接种：将消毒嫩芽的伤口处接触升汞的部位切除，避免杂菌感染，提高原生质活性，将嫩茎全部倾斜扦插于培养基中，能够减少培养基的用量，节约成本，同时倾斜扦插于基质中，利于嫩茎接触氧气，增强伤口处原生质的活力，促进愈伤组织的形成和分化，加快根系的形成和嫩芽的成活，得接种嫩芽；

（5）培养管理：1~15天，温度为26~27℃、湿度为94~96%、光照为300~400lx、光照时间为11~12小时/d，光照较弱，利于嫩茎组织中水分的保持，平衡嫩茎的光合作用和呼吸作用，避免嫩茎萎蔫；16~40天，温度为24~25℃、湿度为94~96%、光照为600~700lx、光照时间为12~13小时/d、每隔4小时用紫外灯照射8~10分钟，愈伤组织逐渐形成，逐渐增加光照，提高嫩茎的光合作用，促进嫩茎对营养成分的吸收和积累，加快根系的分化形成，增加紫外光照，提高嫩芽的抗逆性，避免杂菌增殖；41~50天，嫩芽生根，温度为27~28℃、湿度为95~97%、光照为1200~1400lx、光照时间为12~13小时/d、每隔6小时用紫外灯照射15~20分钟，分化产生根系，进一步增加光照，提高光合作用，养分的积累加快根系的生长，紫外光照能够增强嫩芽的抗逆性，诱导根系快速生长，缩短组织培养繁殖育苗的时间，得生根苗；

（6）炼苗移植：生根8~10天后，将生根苗的培养瓶打开，接受自然环境30~40分钟，以后每天延长20分钟，连续炼苗4~5天，增强生根苗对环境的适应能力，提高移植成活率，节约大量育苗成本，即可移植于室外进行栽植，得移植多花黄精苗。

所述步骤（1）的嫩芽，最顶端叶片与紧邻叶片的距离为8~10mm时，连同嫩茎一起剪取，嫩茎长度为8~10mm。

所述步骤（2）的固体培养基，琼脂添加量为4.5~4.7g/L，利于嫩芽的接种。

所述步骤（4）的倾斜扦插，倾斜角度为30~45°。

所述多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法得到的移植多花黄精苗。

本发明的优点是：本发明提供的多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，方法简单，操作方便，生根率达到94%，移植后成活率达到96%，可进行批量大规模育苗，明显提高了多花黄精的育苗效率，避免了多花黄精传统组织培养对根茎的浪费，节约大量育苗成本；选择具有优良性状的多花黄精嫩芽作为组织培养的材料，避免对中药材料根茎的浪费，而且嫩芽的叶片能够进行光合作用，减少嫩芽对培养基中营养成分的依赖，同时嫩芽采取后置于低温氨甲环酸溶液中进行浸泡，加快嫩芽细胞的分裂，促进愈伤组织的形成和分化，提高嫩芽生根率；向MS培养基的琼脂含量较少，利于嫩芽的接种，同时培养基中加入甲钴胺和亚硒酸钠，能够抑制嫩芽上的杂菌生长，避免感染腐烂，提高伤口处细胞的原生质活性，促进细胞分裂，加快愈伤组织的形成和分化，缩短根系的形成时间，提高育苗效率；嫩芽经多次消毒，清除表面粘附的杂菌，避免嫩茎污染腐烂，提高嫩茎生根率；扦插时切除伤口的表层组织，避免杂菌感染，提高原生质活性，扦插时将嫩茎倾斜全部扦插于基质中，能够减少培养基的用量，节约成本，同时倾斜扦插于基质中，利于嫩茎接触氧气，增强伤口处原生质的活力，促进愈伤组织的形成和分化，加快根系的形成和嫩芽的成活；接种后分阶段调节培养环境，1~15天时光照较弱，利于嫩茎组织中水分的保持，平衡嫩茎的光合作用和呼吸作用，避免嫩茎萎蔫，16~40天时愈伤组织逐渐形成，逐渐增加光照，提高嫩茎的光合作用，促进嫩茎对营养成分的吸收和积累，加快根系的分化形成，增加紫外光照，提高嫩芽的抗逆性，避免杂菌增殖，41~50天时分化产生根系，进一步增加光照，提高光合作用，养分的积累加快根系的生长，紫外光照能够增强嫩芽的抗逆性，诱导根系快速生长，缩短组织培养繁殖育苗的时间；生根后进行炼苗，增强生根苗对环境的适应能力，提高移植成活率，节约大量育苗成本。

具体实施方式

下面用具体实施例说明本发明。

实施例1

一种多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，包括以下步骤：

（1）材料选择：选择性状优良的多花黄精，剪取嫩芽，避免对中药材料根茎的浪费，而且嫩芽的叶片能够进行光合作用，减少嫩芽对培养基中营养成分的依赖，流水冲洗40~60分钟，置于质量浓度为10mg/L的氨甲环酸溶液中，于6~8℃浸泡2~3小时，加快嫩芽细胞的分裂，促进愈伤组织的形成和分化，提高嫩芽生根率，得培养嫩芽；所述的嫩芽，最顶端叶片与紧邻叶片的距离为8~10mm时，连同嫩茎一起剪取，嫩茎长度为8~10mm；

（2）培养基制备：配置MS组织培养的固体培养基，加入甲钴胺和亚硒酸钠，使甲钴胺质量浓度为1.2mg/L，亚硒酸钠质量浓度为11mg/L，能够抑制嫩芽上的杂菌生长，避免感染腐烂，提高伤口处细胞的原生质活性，促进细胞分裂，加快愈伤组织的形成和分化，缩短根系的形成时间，提高育苗效率，分装于培养瓶中，于121℃灭菌25分钟，自然冷却，得培养基；所述的固体培养基，琼脂添加量为4.5g/L，利于嫩芽的接种；

（3）嫩芽消毒：将培养嫩芽置于超净工作台中，先用体积分数为75%的酒精浸泡30~40秒，无菌水冲洗4~5次，再置于0.2%的升汞中浸泡10~15分钟，无菌水冲洗7~8次，清除表面粘附的杂菌，避免嫩茎污染腐烂，提高嫩茎生根率，得消毒嫩芽；

（4）嫩芽接种：将消毒嫩芽的伤口处接触升汞的部位切除，避免杂菌感染，提高原生质活性，将嫩茎全部倾斜扦插于培养基中，倾斜角度为30~45°，能够减少培养基的用量，节约成本，同时倾斜扦插于基质中，利于嫩茎接触氧气，增强伤口处原生质的活力，促进愈伤组织的形成和分化，加快根系的形成和嫩芽的成活，得接种嫩芽；

（5）培养管理：1~15天，温度为26℃、湿度为94%、光照为300lx、光照时间为11小时/d，光照较弱，利于嫩茎组织中水分的保持，平衡嫩茎的光合作用和呼吸作用，避免嫩茎萎蔫；16~40天，温度为24℃、湿度为94%、光照为600lx、光照时间为12小时/d、每隔4小时用紫外灯照射8~10分钟，愈伤组织逐渐形成，逐渐增加光照，提高嫩茎的光合作用，促进嫩茎对营养成分的吸收和积累，加快根系的分化形成，增加紫外光照，提高嫩芽的抗逆性，避免杂菌增殖；41~50天，嫩芽生根，温度为27℃、湿度为95%、光照为1200lx、光照时间为12小时/d、每隔6小时用紫外灯照射15分钟，分化产生根系，进一步增加光照，提高光合作用，养分的积累加快根系的生长，紫外光照能够增强嫩芽的抗逆性，诱导根系快速生长，缩短组织培养繁殖育苗的时间，得生根苗；

（6）炼苗移植：生根8~10天后，将生根苗的培养瓶打开，接受自然环境30分钟，以后每天延长20分钟，连续炼苗4~5天，增强生根苗对环境的适应能力，提高移植成活率，节约大量育苗成本，即可移植于室外进行栽植，得移植多花黄精苗。

实施例2

一种多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，包括以下步骤：

（1）材料选择：选择性状优良的多花黄精，剪取嫩芽，避免对中药材料根茎的浪费，而且嫩芽的叶片能够进行光合作用，减少嫩芽对培养基中营养成分的依赖，流水冲洗40~60分钟，置于质量浓度为13mg/L的氨甲环酸溶液中，于6~8℃浸泡2~3小时，加快嫩芽细胞的分裂，促进愈伤组织的形成和分化，提高嫩芽生根率，得培养嫩芽；所述的嫩芽，最顶端叶片与紧邻叶片的距离为8~10mm时，连同嫩茎一起剪取，嫩茎长度为8~10mm；

（2）培养基制备：配置MS组织培养的固体培养基，加入甲钴胺和亚硒酸钠，使甲钴胺质量浓度为1.3mg/L，亚硒酸钠质量浓度为12mg/L，能够抑制嫩芽上的杂菌生长，避免感染腐烂，提高伤口处细胞的原生质活性，促进细胞分裂，加快愈伤组织的形成和分化，缩短根系的形成时间，提高育苗效率，分装于培养瓶中，于121℃灭菌28分钟，自然冷却，得培养基；所述的固体培养基，琼脂添加量为4.6g/L，利于嫩芽的接种；

（3）嫩芽消毒：将培养嫩芽置于超净工作台中，先用体积分数为75%的酒精浸泡30~40秒，无菌水冲洗4~5次，再置于0.2%的升汞中浸泡10~15分钟，无菌水冲洗7~8次，清除表面粘附的杂菌，避免嫩茎污染腐烂，提高嫩茎生根率，得消毒嫩芽；

（4）嫩芽接种：将消毒嫩芽的伤口处接触升汞的部位切除，避免杂菌感染，提高原生质活性，将嫩茎全部倾斜扦插于培养基中，倾斜角度为30~45°，能够减少培养基的用量，节约成本，同时倾斜扦插于基质中，利于嫩茎接触氧气，增强伤口处原生质的活力，促进愈伤组织的形成和分化，加快根系的形成和嫩芽的成活，得接种嫩芽；

（5）培养管理：1~15天，温度为26.5℃、湿度为95%、光照为350lx、光照时间为11小时/d，光照较弱，利于嫩茎组织中水分的保持，平衡嫩茎的光合作用和呼吸作用，避免嫩茎萎蔫；16~40天，温度为24.5℃、湿度为95%、光照为650lx、光照时间为13小时/d、每隔4小时用紫外灯照射8~10分钟，愈伤组织逐渐形成，逐渐增加光照，提高嫩茎的光合作用，促进嫩茎对营养成分的吸收和积累，加快根系的分化形成，增加紫外光照，提高嫩芽的抗逆性，避免杂菌增殖；41~50天，嫩芽生根，温度为27.5℃、湿度为96%、光照为1300lx、光照时间为13小时/d、每隔6小时用紫外灯照射18分钟，分化产生根系，进一步增加光照，提高光合作用，养分的积累加快根系的生长，紫外光照能够增强嫩芽的抗逆性，诱导根系快速生长，缩短组织培养繁殖育苗的时间，得生根苗；

（6）炼苗移植：生根8~10天后，将生根苗的培养瓶打开，接受自然环境35分钟，以后每天延长20分钟，连续炼苗4~5天，增强生根苗对环境的适应能力，提高移植成活率，节约大量育苗成本，即可移植于室外进行栽植，得移植多花黄精苗。

实施例3

一种多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，包括以下步骤：

（1）材料选择：选择性状优良的多花黄精，剪取嫩芽，避免对中药材料根茎的浪费，而且嫩芽的叶片能够进行光合作用，减少嫩芽对培养基中营养成分的依赖，流水冲洗40~60分钟，置于质量浓度为15mg/L的氨甲环酸溶液中，于6~8℃浸泡2~3小时，加快嫩芽细胞的分裂，促进愈伤组织的形成和分化，提高嫩芽生根率，得培养嫩芽；所述的嫩芽，最顶端叶片与紧邻叶片的距离为8~10mm时，连同嫩茎一起剪取，嫩茎长度为8~10mm；

（2）培养基制备：配置MS组织培养的固体培养基，加入甲钴胺和亚硒酸钠，使甲钴胺质量浓度为1.4mg/L，亚硒酸钠质量浓度为13mg/L，能够抑制嫩芽上的杂菌生长，避免感染腐烂，提高伤口处细胞的原生质活性，促进细胞分裂，加快愈伤组织的形成和分化，缩短根系的形成时间，提高育苗效率，分装于培养瓶中，于121℃灭菌30分钟，自然冷却，得培养基；所述的固体培养基，琼脂添加量为4.7g/L，利于嫩芽的接种；

（3）嫩芽消毒：将培养嫩芽置于超净工作台中，先用体积分数为75%的酒精浸泡30~40秒，无菌水冲洗4~5次，再置于0.2%的升汞中浸泡10~15分钟，无菌水冲洗7~8次，清除表面粘附的杂菌，避免嫩茎污染腐烂，提高嫩茎生根率，得消毒嫩芽；

（4）嫩芽接种：将消毒嫩芽的伤口处接触升汞的部位切除，避免杂菌感染，提高原生质活性，将嫩茎全部倾斜扦插于培养基中，倾斜角度为30~45°，能够减少培养基的用量，节约成本，同时倾斜扦插于基质中，利于嫩茎接触氧气，增强伤口处原生质的活力，促进愈伤组织的形成和分化，加快根系的形成和嫩芽的成活，得接种嫩芽；

（5）培养管理：1~15天，温度为27℃、湿度为96%、光照为400lx、光照时间为12小时/d，光照较弱，利于嫩茎组织中水分的保持，平衡嫩茎的光合作用和呼吸作用，避免嫩茎萎蔫；16~40天，温度为25℃、湿度为96%、光照为700lx、光照时间为13小时/d、每隔4小时用紫外灯照射10分钟，愈伤组织逐渐形成，逐渐增加光照，提高嫩茎的光合作用，促进嫩茎对营养成分的吸收和积累，加快根系的分化形成，增加紫外光照，提高嫩芽的抗逆性，避免杂菌增殖；41~50天，嫩芽生根，温度为28℃、湿度为97%、光照为1400lx、光照时间为13小时/d、每隔6小时用紫外灯照射20分钟，分化产生根系，进一步增加光照，提高光合作用，养分的积累加快根系的生长，紫外光照能够增强嫩芽的抗逆性，诱导根系快速生长，缩短组织培养繁殖育苗的时间，得生根苗；

（6）炼苗移植：生根8~10天后，将生根苗的培养瓶打开，接受自然环境40分钟，以后每天延长20分钟，连续炼苗4~5天，增强生根苗对环境的适应能力，提高移植成活率，节约大量育苗成本，即可移植于室外进行栽植，得移植多花黄精苗。

对比例1

步骤（1）中的嫩茎改为根茎，其余方法，同实施例1。

对比例2

去除步骤（1）中的氨甲环酸溶液，其余方法，同实施例1。

对比例3

去除步骤（2）中的甲钴胺，其余方法，同实施例1。

对比例4

去除步骤（2）中的亚硒酸钠，其余方法，同实施例1。

对比例5

步骤（3）中改为0.1%的升汞，其余方法，同实施例1。

对比例6

去除步骤（4）中的切除，其余方法，同实施例1。

对比例7

步骤（4）中改为竖直扦插，其余方法，同实施例1。

对比例8

步骤（5）中一直保持温度为27℃、湿度为96%、光照为400lx、光照时间为12小时/d，其余方法，同实施例1。

对比例9

去除步骤（6）中的炼苗，其余方法，同实施例1。

对比例10

现有文献“多花黄精组织培养技术，周建金等”中的组织培养方法。

实施例和对比例多花黄精组织培养育苗方法的育苗效果：

在安徽省霍山县，选择性状良好的多花黄精，分别按实施例和对比例的方法，各组采取组织培养的材料100份，各组分别用该组的方法处理后进行组织培养，统计多花黄精组织培养的生根时间、生根率及移植成活率，结果取平均值，实施例和对比例多花黄精组织培养育苗方法的育苗效果见表1。

表1：实施例和对比例多花黄精组织培养育苗方法的育苗效果

项目	生根时间/(d)	生根率/(%)	移植成活率/(%)
				实施例1	46	92	94
实施例2	44	94	96
				实施例3	49	93	94
对比例1	45	92	91
				对比例2	67	88	90
对比例3	74	89	92
				对比例4	72	87	91
对比例5	48	90	92
				对比例6	49	92	93
对比例7	62	89	91
				对比例8	56	91	92
对比例9	47	92	63
				对比例10	120	90	91

从表1的结果表明，实施例的多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，生根时间明显较对比例短，生根率和移植成活率明显较对比例高，说明本发明提供的多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法具有很好的育苗效果。

Claims (5)

1.一种多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）材料选择：选择性状优良的多花黄精，剪取嫩芽，流水冲洗40~60分钟，置于质量浓度为10~15mg/L的氨甲环酸溶液中，于6~8℃浸泡2~3小时，得培养嫩芽；

（2）培养基制备：配置MS组织培养的固体培养基，加入甲钴胺和亚硒酸钠，使甲钴胺质量浓度为1.2~1.4mg/L，亚硒酸钠质量浓度为11~13mg/L，分装于培养瓶中，于121℃灭菌25~30分钟，自然冷却，得培养基；

（3）嫩芽消毒：将培养嫩芽置于超净工作台中，先用体积分数为75%的酒精浸泡30~40秒，无菌水冲洗4~5次，再置于0.2%的升汞中浸泡10~15分钟，无菌水冲洗7~8次，得消毒嫩芽；

（4）嫩芽接种：将消毒嫩芽的伤口处接触升汞的部位切除，将嫩茎全部扦插于培养基中，得接种嫩芽；

（5）培养管理：1~15天，温度为26~27℃、湿度为94~96%、光照为300~400lx、光照时间为11~12小时/d；16~40天，温度为24~25℃、湿度为94~96%、光照为600~700lx、光照时间为12~13小时/d、每隔4小时用紫外灯照射8~10分钟；41~50天，嫩芽生根，温度为27~28℃、湿度为95~97%、光照为1200~1400lx、光照时间为12~13小时/d、每隔6小时用紫外灯照射15~20分钟，得生根苗；

（6）炼苗移植：生根8~10天后，将生根苗的培养瓶打开，接受自然环境30~40分钟，以后每天延长20分钟，连续炼苗4~5天，即可移植于室外进行栽植，得移植多花黄精苗。

2.根据权利要求1所述多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，其特征在于，所述步骤（1）的嫩芽，最顶端叶片与紧邻叶片的距离为8~10mm时，连同嫩茎一起剪取，嫩茎长度为8~10mm。

3.根据权利要求1所述多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，其特征在于，所述步骤（2）的固体培养基，琼脂添加量为4.5~4.7g/L。

4.根据权利要求1所述多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法，其特征在于，所述步骤（4）的扦插，将嫩茎倾斜30~45°斜插于培养基中。

5.一种权利要求1~4任一项所述多花黄精的茎尖组织培养繁殖育苗方法得到的移植多花黄精苗。