CN108531440A - 一种人参细胞培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人参细胞诱导培养基和人参细胞的诱导方法。人参细胞诱导培养基包括：MS基础培养基，0.2mg/L‑0.5mg/L 6‑BA(6‑苄基嘌呤)、2‑4mg/L NAA(萘乙酸)及20g/L‑30g/L蔗糖。采用本发明方法制备得到的人参细胞，其中的皂苷含量高，人参细胞遗传性稳定，受环境因素影响小，可以作为人参皂苷生物合成分子调控研究的理想模型，并探索实现工程化细胞大规模生产人参皂苷的有效途径，值得推广应用。

Description

一种人参细胞培养基及其应用
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种人参不定根诱导培养基及其应用。
背景技术
药用植物人参是我国传统的名贵中药材，被誉为药中之王。其产品具有广阔的市场。人参Panax ginseng C.A.Meyer为五加科人参属植物，主要分布在中国东北、韩国和日本。它的次生代谢产物人参皂苷(ginsenoside)为异戊二烯单元(五碳)构成的四环三萜达玛烷类化合物，由人参二醇和人参三醇型皂苷组成，主要分布于根部，其次为茎和叶。迄今为止，分离并确定了结构的皂苷成分有50余种。现代研究认为，人参的主要药效活性成分为人参皂苷，不仅对中枢神经、心血管、免疫和内分泌系统具有药理作用，还表现出抗肿瘤、抗应激及抗氧化等多种活性，临床应用十分广泛。近年来随着人参等中药产业化的推进，人参单体皂苷生物活性和药理作用研究的逐步深入，对人参皂苷的需求量显著增加，据估计，世界每年仅销售各种人参未成品就达数10亿美元。
然而人参生长缓慢，种植年限长，对环境条件要求严格，栽培技术复杂，生产受到很大限制。由于多年来的过度采挖，人参赖以生存的森林生态环境遭到严重破坏，野生人参资源枯竭，目前用于药用的多为栽培人参。然而人参的栽培生产周期长(约6年左右)，繁殖系数低，不能连作(种植过人参的土壤20-30年内难以再利用)，且对土壤环境要求严格。占地面积大，且其品质易受气候、栽培条件及病虫害的影响，供应难以满足市场的需求；农残超标、老参地等问题也极大地限制了人工栽培人参的发展前景。
特别是人参皂苷含量低，难以满足临床应用需求。通过人参愈伤组织诱导培养，建立细胞培养体系，可以作为人参皂苷生物合成分子调控研究的理想模型，并探索实现工程化细胞大规模生产人参皂苷的有效途径。人参组织培养方法具有不受生长季节限制、不携带病毒、培养周期短等优点，且易于进行工业化大规模生产，因此具有很大的发展前途。
近几年，一些科研院所及高校，有诱导出的人参细胞细胞系的报道，虽具有较好的生长特性及人参皂苷合成能力。但仍存在不足：(1)人参皂苷含量低；(2)对外在环境适应能力差；(3)细胞遗传稳定性差，传代次数增加后，发生退化迹象等。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术中人工诱导的人参细胞系皂苷含量低、细胞遗传稳定性差得的问题，提供一种人参皂苷细胞系及其建立方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种人参细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基包括：MS基础培养基，0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2-4mg/L NAA(萘乙酸)及20g/L-30g/L蔗糖。
优选的，所述人参细胞培养基还包括0.6g/L-0.8g/L琼脂。
优选的，所述人参细胞培养基包含6-BA为0.5mg/L，NAA为4mg/L，蔗糖为30mg/L。
优选的，所述诱导培养基包含琼脂为0.7g/L。
本发明进一步提供一种人参细胞系的诱导方法，包括如下步骤：
(1)人参愈伤组织制备：取野生人参根为外植体，消毒后去除表面表皮，接种在愈伤诱导培养基上，培养获得人参愈伤组织，
(2)人参细胞的培养：取步骤(1)中的人参愈伤组织，接种在人参细胞培养基中，30-40天转接一次，
(3)人参细胞的继代和筛选：对步骤(2)中的细胞不断继代培养，筛选得到三种人参细胞组织系：白色系、绿色系、黄色系，通过对其生长速度、人参皂甙含量的检测，确定黄色系为长势较好，人参皂甙含量最高的细胞系。
优选的，步骤(3)中黄色系的筛选条件为：选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团粒状，质地均匀、略偏硬为特征的培养物继代。
优选的，所述步骤(1)中的愈伤诱导培养基包括，MS基础培养基，0.5mg/LGA(赤霉素)、30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂。
优选的，所述步骤(2)中的人参细胞培养基包括，MS基础培养基，0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)、0.6g/L-0.8g/L琼脂及20g/L-30g/L蔗糖。
本发明进一步提供一种人参细胞系，所述细胞系由上述的诱导方法制备得到。
本发明通过提供一种人参细胞的诱导方法。采用本发明提供的细胞培养基和人参细胞的诱导方法，制备得到的人参细胞皂苷含量高，人参皂甙含量占培养物干重的4-5％；生长旺盛，细胞生长速率可达10-15g干重/升/月。稳定性高，可无限传代。通过本发明方法可进行大规模生产，所生产的培养物质量稳定产量高；利用本发明方法制备得到的人参细胞可以提取人参中的活性物质皂苷，解决了人参短缺的问题，本发明方法不占耕地，不破坏野生资源，保护了生态环境，适合广泛推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
1.培养基的配置
(1)配制人参愈伤诱导培养基，MS基础培养基(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L GA(赤霉素)、20g/L-30g/L蔗糖、0.6g/L-0.8g/L琼脂。
(2)配制人参细胞培养基，MS基础培养基(配方见附表1)中添加0.2mg/L-0.5mg/L6-BA(6-苄基嘌呤)、2-4mg/L NAA(萘乙酸)、0.6g/L-0.8g/L琼脂及20g/L-30g/L蔗糖。
2.人参细胞的诱导
(1)人参愈伤组织制备：取野生人参根为外植体，消毒后去除表面表皮，接种在愈伤诱导培养基上，培养获得人参愈伤组织，
(2)人参细胞的培养：取步骤(1)中的人参愈伤组织，接种在人参细胞培养基中，30-40天转接一次，
(3)人参细胞的继代和筛选：对步骤(2)中的细胞不断继代培养，筛选得到三种人参细胞组织系：白色系、绿色系、黄色系，通过对其生长速度、人参皂甙含量的检测，确定黄色系为长势较好，人参皂甙含量最高的细胞系。
步骤(3)中黄色系的筛选条件为：选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团粒状，质地均匀、略偏硬为特征的培养物继代。
黄色细胞组织转接量的要求：为更好的优化种子、纯化细胞系，继代时接种块大小控制在3mm以下。如此反复，对所选择细胞系逐步驯化。
附表1：MS基础培养基配方
实施例1配制人参愈伤诱导培养基
配制MS基础培养基(配方见附表1)，在MS基础培养基中添加0.5mg/LGA(赤霉素)、30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂。将配好的培养基高温灭菌后，冷却倒平板备用。
实施例2配制人参细胞培养基
配制MS基础培养基(配方见附表1)，在MS基础培养基中添加0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、4mg/L NAA(萘乙酸)、0.8g/L琼脂及30g/L蔗糖。将配好的培养基高温灭菌后，冷却倒平板备用。
实施例3人参细胞的诱导
(1)人参愈伤组织制备：取野生人参根为外植体，消毒后去除表面表皮，接种在实施例1配置的愈伤诱导培养基上，培养获得人参愈伤组织，
(2)人参细胞的培养：取步骤(1)中的人参愈伤组织，接种在实施例2配置的人参细胞培养基中，35天转接一次，
(3)人参细胞的继代和筛选：对步骤(2)中的细胞不断继代培养，筛选得到三种人参细胞组织系：白色系、绿色系、黄色系，通过对其生长速度、人参皂甙含量的检测，确定黄色系为长势较好，人参皂甙含量最高的细胞系。
步骤(3)中黄色系的筛选条件为：选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团粒状，质地均匀、略偏硬为特征的培养物继代。
黄色细胞组织转接量的要求：为更好的优化种子、纯化细胞系，继代时接种块大小控制在3mm以下。如此反复，对所选择细胞系逐步驯化。
实施例4人参细胞中皂苷含量的测定
采用标准曲线法测定，将本发明制备得到的人参不定根和野生人参根，烘干后作为样品测定。
(I)标准曲线的绘制：
①取Re 10.0g溶于甲醇中，定容为1.0mg/ml；
②取Re对照品溶液0、10、20、30、40、60、80、100μl；
③分别置于8支试管中(10ml，具塞)，90℃以下水浴蒸干；
④冰水浴字样试管中加5％香草醛醇溶液0.5ml溶解，加5ml72％硫酸摇匀，60℃恒温水浴10min后，置冰水浴冷却10分钟；
⑤冰水浴15min后在751分光光度仪544nm处检测；以0μl管为空白对照，人参皂苷Re标准品为样品管进行比色测定，制定标准曲线C＝0.2509A+0.0006，R2＝0.9998，用于样品中人参皂苷含量(％)测定；(曲线为单位自行测定数据)
样品中总皂苷的测定：
取人参不定根干燥后的样品，粉碎(60目以上)，取约0.5g，精密称定，用中性滤纸包好，置索式提取器中，加入乙醚，微沸回流提取1h，弃去乙醚液，供试品药包挥干乙醚溶剂，再置另一索式提取器中加入甲醇浸泡过夜，次日再加入适量甲醇开始微沸回流提取，回流6次以上，以人参皂苷提尽为准。回收甲醇，少量甲醇于平底烧瓶中减压蒸干。用蒸馏水溶解提取物，加水30mL－40mL置分液漏斗中用水饱和的正丁醇30mL进行萃取，共4次。取上层液蒸干，加甲醇溶解后，转移至25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
精密吸取供试品溶液200μL，置具塞刻度试管中，蒸干甲醇后，参照标准曲线制作项下的测试方法测定吸收度。
附表2：皂苷占人参细胞(根)干重比例
皂苷/野生人参根干重 2.64％
皂苷/本发明的人参细胞干重 5.00％
实施例5：人参细胞生长速率测定
取一定量的实施例3制备得到的黄色细胞，继代培养2次，每30天转接一次，60天后，测定细胞的干重，计算细胞的生长速率可达14g干重/升/月。
实施例6：细胞稳定性试验
取一定量的实施例3制备得到的黄色细胞，经过多次继代培养后，测定其中的皂苷的含量，发现其中的皂苷含量趋于稳定。表明，采用本方法制备得到的人参细胞遗传性质稳定，受环境因素影响较小。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种人参细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基包括：MS基础培养基，0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2-4mg/L NAA(萘乙酸)及20g/L-30g/L蔗糖。
2.根据权利要求1所述的人参细胞培养基，其特征在于：所述培养基还包括0.6g/L-0.8g/L琼脂。
3.根据权利要求1-2任一权利要求所述的人参细胞培养基，其特征在于：所述6-BA为0.5mg/L，所述NAA为4mg/L，所述蔗糖为30mg/L。
4.根据权利要求2所述的人参细胞培养基，其特征在于：所述琼脂为0.7g/L。
5.一种人参细胞系的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)人参愈伤组织制备：取野生人参根为外植体，消毒后去除表面表皮，接种在愈伤诱导培养基上，培养获得人参愈伤组织，
(2)人参细胞的培养：取步骤(1)中的人参愈伤组织，接种在人参细胞培养基中，30-40天转接一次，
(3)人参细胞的继代和筛选：对步骤(2)中的细胞不断继代培养，筛选得到三种人参细胞组织系：白色系、绿色系、黄色系，通过对其生长速度、人参皂甙含量的检测，确定黄色系为长势较好，人参皂甙含量最高的细胞系。
6.根据权利要求5所述的人参不定根的诱导方法，其特征在于：步骤(3)中黄色系的筛选条件为：选择生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团粒状，质地均匀、略偏硬为特征的培养物继代。
7.根据权利要求5所述的人参细胞的诱导方法，其特征在于：步骤(1)中的愈伤诱导培养基包括，MS基础培养基，0.5mg/L GA(赤霉素)、30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂。
8.根据权利要求5所述的人参细胞的诱导方法，其特征在于：步骤(2)中的人参细胞培养基包括，MS基础培养基，0.2mg/L-0.5mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、2mg/L-4mg/L NAA(萘乙酸)、0.6g/L-0.8g/L琼脂及20g/L-30g/L蔗糖。
9.一种人参细胞系，其特征在于，由权利要求5-8任一权利要求所述的诱导方法制备得到。
10.权利要求1-4任一权利要求所述的人参细胞培养基在人参细胞诱导中的应用。
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