CN1800365A - 有效提高西洋参悬浮细胞产量的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高西洋参悬浮细胞生长量的简易生产工艺，该工艺包括以下步骤：配制储备液，装瓶，灭菌，制成液体培养基，在无菌条件下接入西洋参对数生长期的悬浮细胞，放入摇床中悬浮暗培养，接种后2－6天，收集悬浮细胞，10－15天后补料，再培养5－10天，收获细胞，提取西洋参人参皂甙，利用该工艺，可使细胞生长量增长近20倍，比对照提高1－3倍，悬浮细胞的生长量可达500－850g/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物细胞悬浮培养技术，特别是有效提高西洋参悬浮细胞产量的生产工艺。
背景技术
我国作为中草药的发源地，虽然中药资源丰富，但蕴藏量有限。由于生态环境的破坏、无计划的采伐和栽培技术等原因而致使珍稀濒危药用植物种类不断增加。如80年代后期，甘草资源比50年代减少60％，麝香资源此50年代减少70％，其它如厚朴、杜仲、黄柏、麻黄、肉苁蓉、松贝等资源的破坏也十分严重。所以供需矛盾日益加剧。
在植物组织培养研究中，发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物如生物碱、色素、甾体、萜类等药用成分及香精等，其中有些是微生物和人工不能合成的，有些则是在整株植物含量甚微或本身资源就十分匮乏，而在培养的细胞中含量有时却很高。因此，利用植物细胞培养技术生产有用代谢产物，已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。
西洋参(Panax quinquefoiium)是五加科人参属的一种名贵中药材，其所含的西洋参皂甙是主要的药理成份，具有健胃、强心、镇定、降血糖和降血脂的功效，并有一定的防癌和抗衰老的作用。西洋参，最适生长于海拔1000米左右的山地阔叶林地带。喜阴，宜斜射光和散射光，忌强光：怕高温，生长期最适宜温度18℃～24℃：要求栽培土层深厚，土质为疏松、肥沃、腐殖质含量丰富、透水性强的偏酸性的壤土或沙质壤土。无论野生或是栽培的西洋参，由于其自身的生理特性，生长缓慢，一般需四至六年才能收获入药。它们的市场供需矛盾突出，价格昂贵，约1000元/kg。迄今为止其皂甙成分尚不能人工合成。因此，通过细胞培养方法大量生产西洋参皂甙，成为研究热点。我国的郑光植、方绮民、周立刚、原晓勇、张美萍等分别研究了西洋参细胞悬浮培养的培养条件，并测定了不同培养条件下悬浮培养物中有效成分的含量，为西洋参细胞培养的进一步研究提供了基础。
目前，西洋参细胞悬浮培养技术仍有不完善之处，缺乏适合大规模悬浮培养的高产、稳定的细胞株，细胞悬浮培养工艺不完善，悬浮细胞培养水平及皂甙产量较低，使利用悬浮细胞培养技术大规模工业化生产西洋参皂甙受到限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种西洋参悬浮细胞大量生产工艺，以实现提高西洋参悬浮细胞的产量，降低工业化生产成本和增加有效物质含量的目的。
本发明采用如下技术方案：
本发明所述的有效提高西洋参悬浮细胞产量的生产工艺，采用以下步骤：
(1)配制储备液；
储备液的成分及含量如下：
| 成分 | 含量(mg/L) | 成分 | 含量(mg/L) |
| 硝酸铵硝酸钾氯化钙硫酸镁磷酸二氢钾 | 18000-3500035000-410008000-89007000-78003100-3900 | 硫酸亚铁肌醇烟酸盐酸吡哆醇盐酸硫胺素 | 5500-560014000-4200060-25055-25050-260 |
| 碘化钾硼酸硫酸锌硫酸铜乙二胺四乙酸二钠 | 160-1711230-12801680-17601-97380-7490 | 甘氨酸硫酸锰钼酸钠氯化钴 | 200-10004400-450040-701-9 |
(2)配制培养液：在已配制好的储备液中加入去离子水稀释18-22倍，再依次加入白糖、水解乳蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸、α-萘乙酸、激动素和吲哚丁酸，，终浓度分别为1.5％-6％、0.3％-1％、0.5-1.5mg/L、0-0.5mg/L、0.2-1.0mg/L和0.2-1.0mg/L，然后调节pH值为5.5-6.5，充分搅拌后装瓶，100ml-500ml三角瓶，装液量为三角瓶容积的1/5-1/2。
(3)培养液灭菌：密封瓶口，将温度控制在115-122℃，压力控制在1.0-1.2kg/cm2，灭菌20-30分钟，培养液冷却后备用。
(4)接种、培养：制成的培养液中，在无菌条件下接入西洋参对数生长期的悬浮细胞，每升培养液接入15-50克鲜重的悬浮细胞，放入摇床中悬浮暗培养，接种后2-6天收集悬浮细胞，重新接种到新培养液中继续培养，每升培养液中接入15-50克鲜重的悬浮细胞，10-15天后补充培养液，补充量为培养体积的1/4-1/2，再培养5-10天，收获细胞，提取西洋参皂甙。
本发明工艺接种后培养温度控制在22-26℃，暗培养。
本发明工艺摇床转速为90-150rpm。
本发明积极效果如下：利用本发明工艺开展西洋参悬浮细胞培养，培养结束后，可使细胞生长量比接种量增长近15-30倍。比通常使用的悬浮细胞培养工艺，即接种后，在细胞培养过程中不换液，细胞生长量提高1-3倍。细胞的生长量(鲜重)可达到800g/L左右，细胞干重可达30g/L以上。
具体实施方式
实施例1：
配制1000ml悬浮细胞培养液，pH5.5，分装20个100ml三角瓶，每瓶30ml；分装2瓶500ml三角瓶，每瓶200ml。高压灭菌，压力控制在1.0kg/cm2，120℃，20min。取对数期西洋参悬浮细胞接种到500ml培养瓶中，接种量为每升培养液接入15克鲜重的悬浮细胞，培养温度24℃，摇床转速90rpm，暗培养。4天后，无菌条件下收集悬浮细胞，再将悬浮细胞转接到100ml三角瓶中，每升培养液接入15克鲜重的悬浮细胞，继续培养15天，每瓶补充新培养液10ml，再培养5天，收获细胞。平均每瓶收获鲜细胞22.2g。
实施例2：
配制1000ml悬浮细胞培养液，pH6.0，分装30个100ml三角瓶，每瓶30ml。高压灭菌，压力控制在1.1kg/cm2，115℃，22min。取对数期西洋参悬浮细胞分别接种到培养液中，每升培养液接入20克鲜重的悬浮细胞，接种15瓶。培养温度22℃，摇床转速100rpm，暗培养。2天后，无菌条件下分别收集细胞，再分别转接到新的培养液中，每升培养液接入20克鲜重的悬浮细胞，继续培养10天，每瓶补充培养液7.8ml，再培养8天，收获细胞。平均每瓶收获鲜细胞15.9g。
实施例3：
配制1000ml悬浮细胞培养液，pH6.5，分装20个100ml三角瓶，每瓶30ml；分装2瓶500ml三角瓶，每瓶200ml。高压灭菌，压力控制在1.2kg/cm2，122℃，30min。取对数期西洋参悬浮细胞接种到500ml培养瓶中，每升培养液接入30克鲜重的悬浮细胞，培养温度26℃，摇床转速150rpm，暗培养。6天后，无菌条件下收集悬浮细胞，再将悬浮细胞转接到100ml三角瓶中，每升培养液接入30克鲜重的悬浮细胞，继续培养10天，每瓶补充培养液12ml，再培养10天，收获细胞。平均每瓶收获鲜细胞27.0g。
实施例4：
配制1000ml悬浮细胞培养液，pH6.0，分装20个100ml三角瓶，每瓶30ml；分装2瓶500ml三角瓶，每瓶200ml。高压灭菌，120℃，20min。取对数期西洋参悬浮细胞接种到500ml培养瓶中，每升培养液接入50克鲜重的悬浮细胞，培养温度24℃，摇床转速90rpm，暗培养。5天后，无菌条件下收集悬浮细胞，再将悬浮细胞转接到100ml三角瓶中，每升培养液接入50克鲜重的悬浮细胞，，继续培养10天，每瓶补充培养液10ml，再培养5天，收获细胞。平均每瓶收获鲜细胞16.1g。
Claims (4)
1、一种有效提高西洋参悬浮细胞产量的生产工艺，其特征在于采用以下步骤：
(1)配制储备液；
(2)配制培养液：在已配制好的储备液中加入去离子水稀释18-22倍，再依次加入白糖、水解乳蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸、α-萘乙酸、激动素和吲哚丁酸，，终浓度分别为1.5％-6％、0.3％-1％、0.5-1.5mg/L、0-0.5mg/L、0.2-1.0mg/L和0.2-1.0mg/L，然后调节pH值为5.5-6.5，充分搅拌后装瓶，100ml-500ml三角瓶，装液量为三角瓶容积的1/5-1/2。
(3)培养液灭菌：密封瓶口，将温度控制在115-122℃，压力控制在1.0-1.2kg/cm2，灭菌20-30分钟，培养液冷却后备用。
(4)接种、培养：制成的培养液中，在无菌条件下接入西洋参对数生长期的悬浮细胞，每升培养液接入15-50克鲜重的悬浮细胞，放入摇床中悬浮暗培养，接种后2-6天收集悬浮细胞，重新接种到新培养液中继续培养，每升培养液中接入15-50克鲜重的悬浮细胞，10-15天后补充培养液，补充量为培养体积的10％-30％，再培养5-10天，收获细胞，提取西洋参人参皂甙。
2、根据权利要求1所述的一种有效提高西洋参悬浮细胞产量的生产工艺，其特征在于储备液的成分及含量如下：
成分
含量(mg/L)
成分
含量(mg/L)
硝酸铵硝酸钾氯化钙硫酸镁
18000-3500035000-410008000-89007000-7800
硫酸亚铁肌醇烟酸盐酸吡哆醇
5500-560014000-4200060-25055-250
磷酸二氢钾碘化钾硼酸硫酸锌硫酸铜乙二胺四乙酸二钠
3100-3900160-1711230-12801680-17601-97380-7490
盐酸硫胺素甘氨酸硫酸锰钼酸钠氯化钴
50-260200-10004400-450040-701-9
3、根据权利要求1所述的一种有效提高西洋参悬浮细胞产量的生产工艺，其特征在于接种后培养温度控制在22-26℃暗培养。
4、根据权利要求1所述的一种有效提高西洋参悬浮细胞产量的生产工艺，其特征在于摇床转速为90-150rpm。
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