CN106434368A - 一种云南白灵芝液体菌种的培养方法 - Google Patents
一种云南白灵芝液体菌种的培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是一种云南白灵芝液体菌种规模化生产方法。精选自然生长的云南白灵芝(Ganoderma leucocontextum)子实体，利用组织分离法获得纯菌株。通过人工栽培试验，优选人工栽培云南白灵芝子实体进行选育，经过5‑10代的系统培育得到稳定性好，代谢能力强，生产效率高的云南白灵芝原始母种。使用固化和液体培养基制备母种，使用液体培养基按照液体菌种培养方法进行云南白灵芝丝体的发酵培养，规模化生产云南白灵芝原种和栽培种。具有成本低、易实现、可广泛地应用于云南白灵芝的大规模人工生产中。本发明中所提供的培养基和液体菌种生产方法，特别适合云南白灵芝的菌种制备与菌丝体的规模化液体发酵培养，利用该培养基和生产方法，可快速进行云南白灵芝丝体发酵培养，实现云南白灵芝自然资源的可持续利用。
Description
技术领域
本发明属于野生食用菌驯化栽培技术领域，特别是一种云南白灵芝(Ganoderma leucocontextum )液体菌种的培养方法。
背景技术
灵芝是祖国中医药宝库中的珍品，素有"仙草"之誉。东汉时期的《神农本草经》、明代李时珍的《本草纲目》，都对灵芝的功效有详细的极为肯定的记载，在传统中医学中也有证实。灵芝中含有多种活性成分如多糖、甾类、三萜类、碱基、核苷、虫漆酸、有机锗以及多种生物碱等，有调节免疫、抗肿瘤、抗癌等功效。灵芝作为有数千年药用历史的传统珍贵药材，药用价值很高。现代药理学与临床实践进一步证明灵芝有抗氧化、清除自由基、保护放射性损伤及化学治疗药物损伤等药理作用。现代研究表明, 灵芝能够有效促进新生神经元的分化和减少氧化压力引起的神经元毒性,具有神经保护功能, 能够预防治疗帕金森综合征(Parkinson’s disease)等神经系统疾病, 在保健品、药品研发上具有广阔的应用空间。
云南白灵芝是生长在云南高海拔地区的灵芝种类，是灵芝属(Ganoderma)中少见的低温型种类，自然生长在海拔2500米以上区域，以菌肉是肉质、白色、质地均匀而得名，价值很高，非常稀少。在云南省每年能够收集到的野生云南白灵芝数量只有几千公斤，而且越来越难以采集，物以稀为贵，云南白灵芝的价格一路飙升，更刺激了云南白灵芝产区群众的采集热情，但这对云南白灵芝野生资源的破坏是毁灭性的，同时也制约了云南白灵芝的可持续利用和产业化发展。
发明内容
为了开发珍稀云南白灵芝资源, 利用本地区有利条件发展食药用菌生产, 本发明的目的在于培育出稳定性好，代谢能力强，生产效率高的云南白灵芝原始母种并提供一种新的栽培云南白灵芝的液体菌种规模化培养方法，该方法能快速地进行云南白灵芝丝体的液体发酵培养，解决了云南白灵芝的人工栽培、产业化发展的菌种供应问题。
本发明是一种云南白灵芝液体菌种规模化生产方法。精选自然生长的云南白灵芝(Ganoderma leucocontextum)子实体，利用组织分离法获得纯菌株。通过人工栽培试验，优选人工栽培云南白灵芝子实体进行选育，经过5-10代的系统培育得到稳定性强，生产效率高的云南白灵芝原始母种。使用固化和液体培养基制备母种，使用液体培养基按照液体菌种培养方法进行云南白灵芝丝体的发酵培养，规模化生产云南白灵芝原种和栽培种。具有成本低、易实现、可广泛地应用于云南白灵芝的大规模人工生产中。本发明中所提供的培养基和液体菌种生产方法，特别适合云南白灵芝的菌种制备与菌丝体的规模化液体发酵培养，利用该培养基和生产方法，可快速进行云南白灵芝丝体发酵培养，实现云南白灵芝自然资源的可持续利用。
本发明的云南白灵芝液体菌种规模化生产方法包括母种的来源（获得），固化和液体母种制备、液体原种的制备、液体栽培种的制备。具体如下：
1、精选自然生长的云南白灵芝(Ganoderma leucocontextum)子实体，利用组织分离法获得纯菌株。通过人工栽培试验，优选人工栽培云南白灵芝子实体进行选育，经过5-10代的系统培育得到稳定性好，代谢能力强，生产效率高的云南白灵芝原始母种；
2、配制扩大母种：
A、母种液体摇瓶种子培养：挑取0.5-2㎝3大小的云南白灵芝原始试管母种，加入1-10mL无菌水，在无菌条件下使用振荡器震荡2-10分钟，使之成糊状，接入装有100-500mL母种液体培养基的摇瓶中进行液体母种培养，培养条件：旋转式摇床100-300转/分钟，培养温度为10-30℃，培养5-20天成为成熟液体母种；
B、固化母种扩繁培养：将云南白灵芝原始试管母种挑取米粒大小的1-5块转接入含有母种固化培养基的250-500mL三角瓶中，接种块间距1-5厘米，在10-30℃条件下培养10-20天菌落基本相连接即成为成熟固化母种；
所述液体培养基由葡萄糖5-10g，麦芽糖5-10g，鲜香蕉泥10-20g，鲜土豆泥10-20g，蛋白胨1-3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g,水1000 mL组成，pH自然；母种固化培养基是在上述液体培养基中添加琼脂10-20g配制而成；
3、原种液体摇瓶种子培养：
A、在500-1000mL摇瓶中装入150-800mL液体培养基，0.14 MPa高压蒸汽灭菌20-40分钟，待冷却到室温后，严格无菌操作按液体培养基体积百分比1-10%的接种量接入成熟液体母种进行液体原种培养，培养条件：旋转式摇床100-300转/分钟，培养温度为10-30℃，培养10-20天成为成熟液体原种；
B、在500-1000mL摇瓶中装入150-800mL原种液体培养基，0.14 MPa高压蒸汽灭菌20-40分钟，待冷却到室温后，严格按无菌操作程序，将经过高速分散器分散后的成熟固化母种接种到摇瓶中，接种量为每250-500mL三角瓶的成熟固化母种分散后接种5-10瓶500-1000mL摇瓶，接种后进行原种液体摇瓶种子培养，培养条件：旋转式摇床100-300转/分钟，培养温度为10-30℃，培养10-20天成为成熟液体原种；
原种液体培养基组成为：葡萄糖15-30g，麦芽糖15-30g，蛋白胨3-5g，酵母粉3-5g，磷酸氢二钾2-4g，硫酸镁1-2g, 硫酸锌0.2g、氯化锰0.2g、硫酸亚铁0.2g、单宁0.1g,水1000mL组成，pH自然；
4、栽培种发酵罐培养：
以发酵培养基体积百分比1-10%的接种量把成熟液体原种接入装有100-300升无菌发
酵培养基的栽培种子罐进行液体栽培种培养，培养条件为：培养温度10-30℃，通气量1:0.3-0.8V/V·min，搅拌速度50-200转/分钟，保持罐压0.02-0.10 MPa，经过10-20天通气培养，达到对数生长期即可得到云南白灵芝液体菌种；
原种液体培养基组成为：10-30目细麸皮2-10g,葡萄糖10-20g，麦芽糖10-20g，蛋白胨2-3g，酵母粉2-3g，磷酸氢二钾2-4g，硫酸镁1-2g, 硫酸锌0.2g、氯化锰0.2g、硫酸亚铁0.2g、单宁0.1g,水1000mL组成，pH自然；
采用本发明培育的菌株和工艺培养云南白灵芝种可以快速和规模化培养，与传统的固体发酵方式培养菌种相比，培养基的配方简单，降低了生产成本，云南白灵芝液体菌种在此条件下生长良好，极大地缩短了菌种培养时间。本发明工艺生产的菌丝体在液体状态下主要是依靠断裂的菌丝体片段作为新的生长点，在此基础上培养获得大量菌丝。由于采用处于对数生长期的强壮菌种，保证了菌种接种后的及时萌发和定植生长，能有效形成生长优势保证发菌质量，解决了云南白灵芝人工栽培、产业化发展过程中的一些关键技术问题。具有成本低、易实现、可广泛地应用于云南白灵芝的大规模人工生产中。本发明中所提供的培养基和液体菌种生产方法，特别适合云南白灵芝的菌种制备与菌丝体的规模化液体发酵培养，利用该培养基和生产方法，可快速进行云南白灵芝丝体发酵培养，实现云南白灵芝自然资源的可持续利用和产业化。
具体实施方式
实施例1：
1、云南白灵芝原始母种的获得：
精选自然生长的云南白灵芝(Ganoderma leucocontextum)子实体，利用组织分离法获得纯菌株。通过人工栽培试验，优选人工栽培云南白灵芝子实体进行选育，经过5-10代的系统培育得到稳定性好，代谢能力强，生产效率高的云南白灵芝原始母种；
2、配制扩大母种：
母种液体摇瓶种子培养：挑取1㎝3大小的云南白灵芝原始试管母种，加入5mL无菌水，在无菌条件下使用振荡器震荡5分钟，使之成糊状，接入装有150mL母种液体培养基的摇瓶中进行液体母种培养，培养条件：旋转式摇床150转/分钟，培养温度为20-30℃，培养10天成为成熟液体母种；
所述液体培养基由葡萄糖10g，麦芽糖5g，鲜香蕉泥20g，鲜土豆泥10g，蛋白胨2g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g,水1000 mL组成，pH自然；
3、原种液体摇瓶种子培养：
在500mL摇瓶中装入200mL液体培养基，0.14 MPa高压蒸汽灭菌30分钟，待冷却到室温后，严格无菌操作按液体培养基体积百分比2%的接种量接入成熟液体母种进行液体原种培养，培养条件：旋转式摇床150转/分钟，培养温度为20-30℃，培养10天成为成熟液体原种；
原种液体培养基组成为：葡萄糖30g，麦芽糖15g，蛋白胨5g，酵母粉3g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁1g, 硫酸锌0.2g、氯化锰0.2g、硫酸亚铁0.2g、单宁0.1g,水1000mL组成，pH自然；
4、栽培种发酵罐培养：
以发酵培养基体积百分比5%的接种量把成熟液体原种接入装有150升无菌发酵培养基的栽培种子罐进行液体栽培种培养，培养条件为：培养温度20-30℃，通气量1:0.3-0.8V/V·min，搅拌速度100转/分钟，保持罐压0.02-0.10 MPa，经过10-20天通气培养，达到对数生长期即可得到云南白灵芝液体菌种；
原种液体培养基组成为：10-30目细麸皮5g,葡萄糖20g，麦芽糖10g，蛋白胨3g，酵母粉2g，磷酸氢二钾4g，硫酸镁2g, 硫酸锌0.2g、氯化锰0.2g、硫酸亚铁0.2g、单宁0.1g,水1000mL组成，pH自然；
栽培种发酵罐培养完毕将液体菌种按无菌操作转移到其他容器妥善保存，并尽快应用于云南白灵芝的规模化人工栽培生产中。
实施例 2：
1、云南白灵芝原始母种的获得：
与“实施例1”相同；
2、配制扩大母种：
固化母种扩繁培养：将云南白灵芝原始试管母种挑取米粒大小的5块转接入含有母种固化培养基的500mL三角瓶中，接种块间距3-5厘米，在20-30℃条件下培养10-20天菌落基本相连接即成为成熟固化母种；
所述固化培养基由鲜香蕉泥20g，琼脂15g，鲜土豆泥10g，葡萄糖10g，麦芽糖5g，蛋白胨2g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g,水1000 mL组成，pH自然；
3、原种液体摇瓶种子培养：
在500mL摇瓶中装入200mL原种液体培养基，0.14 MPa高压蒸汽灭菌30分钟，待冷却到室温后，严格按无菌操作程序，将经过高速分散器分散后的成熟固化母种接种到摇瓶中，接种量为每500mL三角瓶的成熟固化母种分散后接种10瓶500mL摇瓶，接种后进行原种液体摇瓶种子培养，培养条件：旋转式摇床200转/分钟，培养温度为20-30℃，培养10-20天成为成熟液体原种；
原种液体培养基组成为：葡萄糖15g，麦芽糖30g，蛋白胨3g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁1g, 硫酸锌0.2g、氯化锰0.2g、硫酸亚铁0.2g、单宁0.1g,水1000mL组成，pH自然；
（4）栽培种发酵罐培养：
与“实施例1”相同；
栽培种发酵罐培养完毕将液体菌种按无菌操作转移到其他容器妥善保存，并尽快应用于云南白灵芝的规模化人工栽培生产中。
实施例 3：
1、云南白灵芝原始母种的获得：
与“实施例1”相同；
2、配制扩大母种：
与“实施例1”相同；
3、原种液体摇瓶种子培养：
在1000mL摇瓶中装入700mL液体培养基，0.14 MPa高压蒸汽灭菌40分钟，待冷却到室温后，严格无菌操作按液体培养基体积百分比10%的接种量接入成熟液体母种进行液体原种培养，培养条件：旋转式摇床250转/分钟，培养温度为20-30℃，培养10天成为成熟液体原种；
原种液体培养基组成为：葡萄糖15g，麦芽糖30g，蛋白胨4g，酵母粉4g，磷酸氢二钾4g，硫酸镁2g, 硫酸锌0.2g、氯化锰0.2g、硫酸亚铁0.2g、单宁0.1g,水1000mL组成，pH自然；
4、栽培种发酵罐培养：
以发酵培养基体积百分比10%的接种量把成熟液体原种接入装有200升无菌发酵培养基的栽培种子罐进行液体栽培种培养，培养条件为：培养温度20-30℃，通气量1:0.3-0.8V/V·min，搅拌速度150转/分钟，保持罐压0.02-0.10 MPa，经过10天通气培养，达到对数生长期即可得到云南白灵芝液体菌种；
原种液体培养基组成为：10-30目细麸皮10g,葡萄糖10g，麦芽糖15g，蛋白胨2g，酵母粉2g，磷酸氢二钾4g，硫酸镁2g, 硫酸锌0.2g、氯化锰0.2g、硫酸亚铁0.2g、单宁0.1g,水1000mL组成，pH自然；
栽培种发酵罐培养完毕将液体菌种按无菌操作转移到其他容器妥善保存，并尽快应用于云南白灵芝的规模化人工栽培生产中。
Claims (9)
1.一种云南白灵芝液体菌种规模化生产方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1) 精选自然生长的云南白灵芝(Ganoderma leucocontextum)子实体，利用组织分离法获得纯菌株。
2.通过人工栽培试验，优选人工栽培云南白灵芝子实体进行选育，经过5-10代的系统培育得到稳定性好，代谢能力强，生产效率高的云南白灵芝原始母种；
(2) 配制扩大母种：
A、母种液体摇瓶种子培养：挑取0.5-2㎝3大小的云南白灵芝原始试管母种，加入1-10mL无菌水，在无菌条件下使用振荡器震荡2-10分钟，使之成糊状，接入装有100-500mL母种液体培养基的摇瓶中进行液体母种培养，培养条件：旋转式摇床100-300转/分钟，培养温度为10-30℃，培养5-20天成为成熟液体母种。
3.B、固化母种扩繁培养：将云南白灵芝原始试管母种挑取米粒大小的1-5块转接入含有母种固化培养基的250-500mL三角瓶中，接种块间距1-5厘米，在10-30℃条件下培养10-20天菌落基本相连接即成为成熟固化母种。
4.所述液体培养基由葡萄糖5-10g，麦芽糖5-10g，鲜香蕉泥10-20g，鲜土豆泥10-20g，蛋白胨1-3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g,水1000 mL组成，pH自然；母种固化培养基是在上述液体培养基中添加琼脂10-20g配制而成。
5.(3) 原种液体摇瓶种子培养：
A、在500-1000mL摇瓶中装入150-800mL液体培养基，0.14 MPa高压蒸汽灭菌20-40分钟，待冷却到室温后，严格无菌操作按液体培养基体积百分比1-10%的接种量接入成熟液体母种进行液体原种培养，培养条件：旋转式摇床100-300转/分钟，培养温度为10-30℃，培养10-20天成为成熟液体原种。
6.B、在500-1000mL摇瓶中装入150-800mL原种液体培养基，0.14 MPa高压蒸汽灭菌20-40分钟，待冷却到室温后，严格按无菌操作程序，将经过高速分散器分散后的成熟固化母种接种到摇瓶中，接种量为每250-500mL三角瓶的成熟固化母种分散后接种5-10瓶500-1000mL摇瓶，接种后进行原种液体摇瓶种子培养，培养条件：旋转式摇床100-300转/分钟，培养温度为10-30℃，培养10-20天成为成熟液体原种。
7.原种液体培养基组成为：葡萄糖15-30g，麦芽糖15-30g，蛋白胨3-5g，酵母粉3-5g，磷酸氢二钾2-4g，硫酸镁1-2g, 硫酸锌0.2g、氯化锰0.2g、硫酸亚铁0.2g、单宁0.1g,水1000mL组成，pH自然。
8.（4）栽培种发酵罐培养：
以发酵培养基体积百分比1-10%的接种量把成熟液体原种接入装有100-300升无菌发
酵培养基的栽培种子罐进行液体栽培种培养，培养条件为：培养温度10-30℃，通气量1:0.3-0.8V/V·min，搅拌速度50-200转/分钟，保持罐压0.02-0.10 MPa，经过10-20天通气培养，达到对数生长期即可得到云南白灵芝液体菌种。
9.原种液体培养基组成为：10-30目细麸皮2-10g,葡萄糖10-20g，麦芽糖10-20g，蛋白胨2-3g，酵母粉2-3g，磷酸氢二钾2-4g，硫酸镁1-2g, 硫酸锌0.2g、氯化锰0.2g、硫酸亚铁0.2g、单宁0.1g,水1000mL组成，pH自然。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170222 |