CN100438750C - 内生真菌在雪莲苗培养和雪莲栽培中的应用 - Google Patents

Abstract

一项内生真菌在雪莲(Saussurea sp.)苗培养和雪莲栽培中的应用技术，所用的两种内生真菌为DSE-1(Mycocentrospora sp.)和DSE-2(Leptodontidium sp.)。先在无菌条件下分别培养真菌和雪莲苗，再将雪莲苗与真菌移入共生基质中共生培养。使用该项技术可以省去雪莲的炼苗环节，或大大缩短雪莲的炼苗周期。该项技术在雪莲与真菌共生培养过程中未使用任何激素和化学促生长剂，能显著促进雪莲苗的生长发育，提高雪莲产量，提高雪莲中活性成分的含量。本发明在雪莲大规模产业化生产中有重要应用价值。

Description

内生真菌在雪莲苗培养和雪莲栽培中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体地说涉及两种内生真菌在雪莲苗培养和雪莲栽培中的应用和对雪莲的促生长效果。

背景技术

雪莲属菊科凤毛菊属(Saussurea DC.)植物，是我国高寒地区民间常用的一类名贵中草，分布于我国新疆、青海、甘肃、四川、云南和西藏等省区的高寒地区，民间多用于风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症的治疗。近年来，对雪莲的基础研究和应用开发不断深入，已经发展成为一种新的抗炎镇痛，终止早孕的中药，在护肤保健、防治心血管疾病、治疗风湿疼症、延缓衰老、抗癌和计划生育等方面有很大的开发利用潜力。

雪莲生长缓慢，商品需求量大，目前对雪莲的过度采挖已经使其药材资源处于濒危状态。一直以来，对雪莲的研究多涉及文献考证、药理、化学成分、组培及商品调查等方面，雪莲对其特殊生态环境的适应性研究方面尚无人问津。雪莲是一类典型的高山植物，其生长的生态条件极为严酷，具有温度低、风大、氧气稀薄、紫外辐射强等特点。由于在低温条件下有机物质的分解率和矿化率低，导致高山地区的土壤营养可利用性差，有机物质随海拔高度增加而相对增加，直接利用有机物质成为高山植物的一条有效的营养途径。高山植物的根常和一些内生、寄生真菌及老根中的腐生真菌相关联，其中一类有深色隔膜的内生真菌(Dark septateendophytes，简称DSE真菌)可以引起寄主植物的共生反应。目前的研究情况表明，DSE真菌可能属于子囊菌的几个不同的属，在北极和高山环境中普遍存在的，且随海拔高度的增加，DSE真菌的存在更普遍。DSE真菌具有能有效利用有机物质的多种酶，与植物共生会对植物生长有促进作用。

在对雪莲的研究中，我们观察到在雪莲的根中存在DSE真菌等多种不同的内生真菌，并对它们进行了分离纯化，然后利用内生真菌和宿主植物共生培养的技术，将雪莲与DSE真菌共生培养，从中筛选出对雪莲的生长发育具有促进作用的优良菌株。这项工作对保存雪莲种质资源、提高药效，开辟雪莲大面积栽培繁殖具有重大理论意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供雪莲内生真菌的培养方法、雪莲无菌苗快速繁殖的方法和内生真菌与雪莲苗共同培养的方法，该方法繁殖率高，生产周期短，可以提高雪莲产量。

本发明的另一目的在于促进雪莲苗的生长发育，提高栽培雪莲的抗病害能力，提高栽培雪莲中活性成分的含量，以便大规模产业化生产雪莲，解决雪莲药用资源紧缺的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术是先分别培养内生真菌和雪莲苗，再将内生真菌与雪莲苗共生培养。本发明采用的两种内生真菌由新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.etKir.)根中分离得到，经鉴定为Mycocentrospora属真菌DSE-1(Mycocentrospora sp.)和Leptodontidium属真菌DSE-2(Leptodontidium sp.)，这两种真菌于2005年10月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏编号分别为：Mycocentrospora属真菌DSE-1：CGMCCNo.1516；Leptodontidium属真菌DSE-2：CGMCC No.1517。保藏和存活证明见附件。

具体地说，本发明所述的技术步骤方法如下(除有特殊说明外，本发明中所述的比例均为重量百分比)：

1.内生真菌的培养

将上述两种DSE真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于22-28℃恒温培养15-20天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中分别进行发酵培养制成种子菌种；种子菌种可以进一步接入液体或固体培养基进行放大培养。

DSE真菌液体培养的培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物，其中葡萄糖的加入量为1.5-4％；无机盐类成分可以为硫酸镁，磷酸二氢钾，或磷酸氢二钾，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾以任意比例混合的混合物，其加入量为硫酸镁0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.1-0.5％，或磷酸氢二钾0.1-0.5％，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以为麦麸(煮汁)，其加入量为1-5％。培养基pH 5.0-6.5。三角瓶或其他容器振荡培养或发酵罐通气培养，培养容器装量30-60％。培养基灭菌后接入上述DES真菌，种子菌种接种量为培养容器装量的5-15％。DSE真菌液体培养的培养条件为：振荡转速90-130转/分钟，22-26℃暗培养15-25天。培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用。

DSE真菌固体培养的培养基含有豆饼粉、富含纤维素的天然添加物和经人工加工生产的营养物质，其中豆饼粉的加入量为0.5-2％；富含纤维素的天然添加物可以为阔叶树锯末，或小麦秸，或玉米秸，或玉米芯，或阔叶树锯末、小麦秸、玉米秸和玉米芯四种天然物中的任意两种或两种以上以任意比例混合的混合物，其加入量均为20-25％；经人工加工生产的营养物质可以为甘油和玉米浆，其加入量为甘油1-7％，玉米浆0.2-1％。培养基pH 5.0-6.5。试管、玻璃罐头瓶或塑料袋等器皿静置培养，培养容器装量50-80％。培养基灭菌后接入液体培养的DES种子菌种，接种量为培养容器装量的2-10％。DSE真菌固体培养的培养条件为：22-26℃暗培养，待菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时取出备用。

2.雪莲苗的培养

与内生真菌共生培养的雪莲苗可以是雪莲无菌实生苗和无菌丛生苗：

(1)雪莲无菌实生苗的培养：雪莲种子经表面消毒处理后，接种于1/2MS固体培养基中，光照培养，待种子萌发形成苗。

(2)雪莲无菌丛生苗的培养：雪莲胚芽经过诱导胚芽形成丛生芽、诱导丛生芽形成丛生苗、诱导丛生苗生根等步骤的处理，培育成苗。各步骤所用的培养基分别为：

①用于诱导胚芽形成丛生芽的培养基是以MS培养基为基本培养基，附加6-苄基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，其加入量为每升(L)培养基加入6-BA 1.0-3.0mg，NAA 0.02-0.1mg；

②用于诱导丛生芽形成丛生苗的培养基是以MS培养基为基本培养基，附加6-BA和NAA，其加入量为每升(L)培养基加入6-BA 0.08-2.0mg，NAA 0.1-0.3mg；

③用于诱导丛生苗生根的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，附加NAA，其加入量为每升(L)培养基加入NAA 0.1-0.3mg。

雪莲无菌实生苗和丛生苗培养中用到的MS或1/2MS基本培养基中要添加蔗糖、肌醇和琼脂，其加入量为每升(L)培养基加入蔗糖15-35g·L^-1、肌醇50-150mg、琼脂6-15g。培养基pH 5.0-6.5。用试管或玻璃瓶等器皿培养，培养容器装量10-50％。苗的培养条件为15-26℃光照培养15-45天，光照强度1500-5000Lux，光照时间8-12小时/天。

3.雪莲苗与内生真菌的共生培养

雪莲与内生真菌共生培养的培养基质中含有土壤、富含纤维素的天然添加物和营养液，其中土壤可以为腐殖质土，或蛭石，或腐殖质土和蛭石以5∶1-5的比例混合的混合土壤；富含纤维素的天然添加物可以是山毛榉科Fagaceae植物栎树或其他杂木树的自然落叶，用时粉碎并浸湿，碎树叶直径0.5-2cm，其加入量为培养基质中土壤重量的2-20％；营养液可以是MS液体培养基，或0.5-3.5％的蔗糖溶液，或水，其添加比例按重量计是土壤∶营养液＝0.8-1.3∶2.5-4。

当在玻璃容器中进行雪莲苗和真菌的共生培养时，先在玻璃容器的底部放置一层湿的碎树叶，再在树叶上铺放土壤，然后加入营养液，灭菌后使用。当在栽培地、或育苗床、或炼苗地进行雪莲苗和真菌的共生培养时，先在栽培地、或育苗床、或炼苗地的基部铺放一层湿的碎树叶，再在树叶上铺放土壤，然后加入营养液。在栽培地、或育苗床、或炼苗地使用的土壤，可以直接使用，或提前堆积并盖塑料布发酵1-2个月，使其熟化杀菌后使用。

雪莲苗和真菌共生培养时，上述2种内生真菌DSE-1和DSE-2可以任选一种单独使用，也可以共同使用。雪莲苗可以单株或2-5株苗为一丛进行栽培。先将液体培养或固体培养的DSE真菌接种在共生培养基质的树叶层，接种量为每株苗或每丛苗下接种固体培养的DSE真菌0.2-1.5g，或经过匀浆的液体培养的DSE真菌0.2-1.5ml，再将雪莲苗按株行距2-15cm×2-15cm植入共生培养基质中，使苗的根能接触到DSE真菌，用土壤把苗的根埋好。

雪莲苗与DSE真菌的共生培养可以在栽培地，或育苗床，或炼苗地，或培养室中的玻璃器皿中进行，培养温度昼/夜为15-25℃/5-18℃，光照周期8-15小时/天，光照强度为2000-10000Lux。可以在栽培地应用DSE真菌直接在共生培养基质上进行雪莲的栽培，也可以将雪莲苗与真菌移入共生培养基质中共生培养30-50天后，将雪莲苗连根取出进行移栽。

具体实施方式

实施例一：

1.DSE-1真菌(Mycocentrospora sp.)的培养

将DSE-1真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于PDA平皿中，25℃恒温培养15天，用φ5mm的打孔器在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，以小碎块接入液体培养基中进行培养。

DSE-1液体培养的培养基组成为：葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.1％，天然物为麦麸4％(煮汁)，以上组分均按重量百分含量计算。培养基pH 5.6，500mL三角瓶装培养基250mL，121℃灭菌30分钟，接入上述DSE-1(Mycocentrospora sp.)菌片。培养条件为摇床振荡转速120转/分钟，23℃暗培养23天后，用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。

2.水母雪莲(Saussurea meduasa Maxim)无菌实生苗的培养

水母雪莲种子用70％酒精消毒50秒，0.1％升汞消毒7分钟，无菌水漂洗3次，接种于1/2MS固体培养基中进行光照培养。

每升(L)1/2MS固体培养基中要添加蔗糖25g，肌醇100mg，琼脂8g。培养基pH 5.6。100mL玻璃三角瓶装量40mL，121℃灭菌20分钟，接入上述经表面消毒后的雪莲种子。培养条件：22-24℃光照培养，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。经过1周左右的培养，水母雪莲种子萌发，幼苗根单一，无分支。经过2周左右的培养，幼苗具3-5片叶，根长3厘米左右，即可用于共生培养。

3.水母雪莲无菌实生苗与DSE-1真菌的共生培养

水母雪莲无菌实生苗与DSE-1真菌共生的培养基质组成为：腐殖质土、湿的碎栎树叶和MS营养液，三者加入量之间的比例按重量计为腐殖质土∶湿的碎栎树叶∶MS营养液＝10∶1∶25。培养容器为玻璃三角瓶。培养基的制备方法为：在三角瓶的底部平铺一层湿的，直径0.2-1cm的碎树叶，树叶层上铺放腐殖质土，然后加入MS培养液。培养基经121℃灭菌45分钟。

水母雪莲实生苗以单株植入培养，每瓶植入3株苗，苗间距2-3cm，成等腰三角形分布。首先将上述液体培养的DSE-1真菌接种在共生培养基质的树叶层，每株苗接入0.4mL，再接种水母雪莲实生苗，注意使水母雪莲苗的根与DSE-1真菌接触，用腐殖质土把水母雪莲苗的根埋好。

在培养室中进行水母雪莲无菌实生苗与DSE-1真菌的共生培养。培养温度：昼/夜＝25℃/18℃，光照周期12小时/天，光照强度为3000Lux。共生培养45天后，连根取出雪莲苗，洗净培养基质，移栽。

实施例二：

1.DSE-2真菌(Leptodontidium sp.)的培养

将DSE-2真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于PDA平皿中，25℃恒温培养20天，用φ5mm的打孔器在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，以小碎块接入液体培养基中进行培养。

DSE-2真菌液体培养的培养基组成为：葡萄糖3％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.25％，天然物为麦麸2％(煮汁)，以上组分均按重量百分含量计算。培养基pH 5.8，500mL三角瓶装培养基200mL，121℃灭菌30分钟，接入上述DSE-2(Leptodontidium sp.)菌片。培养条件为摇床振荡转速100转/分钟，25℃暗培养15天，为DSE-2真菌(Leptodontidium sp.)的种子菌种。

将液体培养的DSE-2真菌(Leptodontidium sp.)的种子菌种接入固体培养基中进行培养。DSE-2真菌固体培养的培养基组成为：豆饼粉1.5％，阔叶树锯末25％，甘油3％，玉米浆0.5％，以上组分均按重量百分比计算。培养基pH 5.3。培养基装在玻璃罐头瓶中，培养容器装量60-70％，121℃灭菌60分钟，接入上述液体培养的DES-2种子菌种，接种量为培养容器装量的5-8％。培养条件为：25-26℃静置暗培养。待DSE-2真菌的菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时取出备用。

2.新疆雪莲(S.involucraata Kar.et Kit.)无菌丛生苗的培养

无菌培养的新疆雪莲种子产生的胚芽，依次经过诱导胚芽形成丛生芽、诱导丛生芽形成丛生苗、诱导丛生苗生根等步骤的处理，培育成苗。

诱导胚芽形成丛生芽的培养基是以MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖20g，肌醇100mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.5mg，萘乙酸(NAA)0.05mg，琼脂7g。培养基pH 5.6。100mL玻璃三角瓶装量30mL，121℃灭菌20分钟，接入无菌培养的雪莲胚芽。培养条件：24℃光照培养40天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。

诱导丛生芽形成丛生苗的培养基是以MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖30g，肌醇120mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，琼脂7.5g。培养基pH 5.8。100mL玻璃三角瓶装量25mL，121℃灭菌20分钟，接入雪莲丛生芽。培养条件：25℃光照培养30天，光照强度3000Lux，光照时间12小时/天。

诱导丛生苗生根的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖25g，肌醇80mg，萘乙酸(NAA)0.25mg，琼脂7g。培养基pH 5.7。100mL玻璃三角瓶装量25mL，121℃灭菌20分钟，接入雪莲丛生苗。23℃光照培养15天，光照强度2000Lux，光照时间9小时/天。

3.新疆雪莲无菌丛生苗与DSE-2真菌的共生培养

新疆雪莲无菌丛生苗与DSE-2真菌共生的培养基质组成为：腐殖质土和蛭石以5∶3的比例混合的混合土壤、湿的碎栎树叶和水，三者加入量之间的比例按重量计为混合土壤∶湿的碎栎树叶∶MS营养液＝10∶1.5∶20。培养基的制备方法为：在育苗床的基部平铺一层湿的，直径0.2-1cm的碎树叶，树叶层上铺放腐殖质土和蛭石的混合土壤，然后浇水。

新疆雪莲丛生苗以3株为一丛进行栽培，苗的株行距为10cm×10cm。首先将上述固体培养的DSE-2真菌接种在共生培养基质的树叶层，接种量为每丛苗接入1.5g，再接种新疆雪莲丛生苗，注意使新疆雪莲苗的根与DSE-2真菌接触，用混合土壤把新疆雪莲苗的根埋好。

在大棚内的育苗床上进行新疆雪莲无菌丛生苗和DSE-2真菌的共生培养。培养温度：昼/夜＝18-22℃/10-14℃，光照周期9-10小时/天，光照强度为5000-8000Lux。共生培养40天后，连根取出雪莲苗移栽到大田。

比较例：

1.DSE真菌对雪莲苗生长的影响

将DSE-1真菌(Mycocentrospora sp.)和DSE-2真菌(Leptodontidium sp.)分别用液体培养基摇床振荡暗培养18天，制成种子菌种。DSE-1和DSE-2种子菌种分别接入固体培养基中，静置暗培养。待两种DSE真菌的菌丝长满培养基时取出备用。

新疆雪莲(S.involucraata Kar.et Kir.)胚芽经过诱导培养30天形成丛生芽，丛生芽经过诱导培养30天形成丛生苗，丛生苗经过诱导培养20天生根，培育成苗。

在共生培养基质上，用新疆雪莲丛生苗分别与固体培养的DSE-1真菌和DSE-2真菌进行共生培养，考察两种DSE真菌和对新疆雪莲苗生长的影响，以没有接入DSE真菌的新疆雪莲丛生苗的生长情况为对照。共生培养在三角瓶中进行，培养基质为蛭石、湿的碎栎树叶和水。

新疆雪莲丛生苗以3株为一丛接入培养基质中，每瓶接入3丛，苗丛间距2-3cm，在三角瓶中成等腰三角形分布。先将上述固体培养的两种DSE真菌分别接种在共生培养基质的树叶层，接种量为每丛苗接入1g左右，再接入新疆雪莲丛生苗，使苗的根部与DSE真菌接触，用蛭石把新疆雪莲苗的根埋好。在培养室中进行新疆雪莲无菌丛生苗与DSE真菌的共生培养。培养温度：昼/夜＝24℃/20℃，光照周期10小时/天，光照强度为3000Lux。将新疆雪莲丛生苗直接接入培养基质中，按以上条件进行光照培养，作为对照。

培养50天后，将共生培养和对照的新疆雪莲苗连根取出，洗净培养基质，测量并记录新疆雪莲苗地上部分高度和根的数目。将新疆雪莲苗于55℃干燥后称量苗的干重。统计分析结果表明，与对照相比，新疆雪莲苗与DSE-1真菌共生培养后，地上部分高度增加了85.5％，根的数目增加了337.5％，苗干重增加了63.0％；新疆雪莲苗与DSE-2真菌共生培养后，地上部分高度增加了22.8％，苗干重增加了31.3％。在显微镜下观察与DSE-1真菌共生培养的新疆雪莲苗根部切片，观察结果发现：DSE-1真菌定殖于根外层衰老的表皮细胞，很少侵染内层表皮细胞，绝对不侵染皮层细胞。在表皮细胞内，有时真菌的菌丝紧密包裹成厚壁的圆形细胞，形成类似于微菌核的结构。

2.DSE-1真菌(Mycocentrospora sp.)对新疆雪莲苗中黄酮类成分的影响

将DSE-1真菌用液体培养基摇床振荡暗培养22天，用匀浆机打碎培养产物备用。

新疆雪莲胚芽经过诱导培养30天形成丛生芽，丛生芽经过诱导培养30天形成丛生苗，丛生苗经过诱导培养20天生根，培育成苗。

在共生培养基质上，用新疆雪莲丛生苗与固体培养的DSE-1真菌进行共生培养，考察DSE-1真菌对新疆雪莲苗中黄酮类化合物含量的影响，以没有接入DSE-1真菌的新疆雪莲丛生苗的黄酮类化合物含量为对照。共生培养在三角瓶中进行，培养基质为腐殖质土、湿的碎栎树叶和水。

新疆雪莲丛生苗以3株为一丛接入培养基质中，每瓶接入3丛，苗丛间距2-3cm，在三角瓶中成等腰三角形分布。先将上述固体培养的DSE-1真菌接种在共生培养基质的树叶层，接种量为每丛苗接入1g左右，再接入新疆雪莲丛生苗，使苗的根部与DSE-1真菌接触，用腐殖质土把新疆雪莲苗的根埋好。在培养室中进行新疆雪莲无菌丛生苗与DSE-1真菌的共生培养。培养温度：昼/夜＝24℃/20℃，光照周期10小时/天，光照强度为3000Lux。将新疆雪莲丛生苗直接接入培养基质中，按以上条件进行光照培养，作为对照。

培养40天后，将共生培养和对照的新疆雪莲苗连根取出，洗净培养基质，于55℃干燥。以芦丁为标准品，测定新疆雪莲苗中总黄酮的含量。测定结果表明，与对照相比，新疆雪莲苗与DSE-1真菌共生培养后，苗中总黄酮的含量增加了1.6倍。

从以上比较例可以看出，DSE真菌有促进雪莲苗增高和增重作用，并对雪莲苗根的发育和形态建成有促进作用，DSE真菌还有提高雪莲苗中的活性成分：黄酮类化合物含量的作用。显微镜下观察到的，在根的表皮细胞中DSE-1真菌形成类似微菌核的结构，是DSE真菌定居在植物中形成的特征性结构，表明DSE-1真菌与雪莲植株建立了良好的共生关系。真菌不仅可促进植物生长，还由于其可以产生抗生素类的物质，从而保护了宿主植物不受到致病菌的侵染。这为移栽到野外的雪莲植株的生长创造一个良好的微环境，提高了雪莲苗的抗病性。可见该项新技术，不仅可以大大缩短雪莲的生长周期，提高雪莲产量和质量，还对雪莲栽培中病害的生物防治有积极意义。

Claims (8)

1.一种利用内生真菌培养雪莲苗和栽培雪莲的方法，包括步骤：

(1)内生真菌的培养

将由新疆雪莲根中分离得到的保藏编号为CGMCC No.1516的内生真菌DSE-1和保藏编号为CGMCC No.1517的内生真菌DSE-2自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA培养基的平皿中，于22-28℃恒温培养15-20天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养；

由平皿固体菌种转接液体培养的DSE-1和DSE-2真菌可以直接使用，也可以作为种子菌种，种子菌种再进一步接入液体或固体培养基进行放大培养；

真菌液体培养的培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物，真菌用三角瓶或其他容器振荡培养，或发酵罐通气暗培养；

真菌固体培养的培养基含有豆饼粉、富含纤维素的天然添加物和经人工加工生产的营养物质，真菌用试管或玻璃罐头瓶或塑料袋静置暗培养；

(2)雪莲苗的培养

①雪莲无菌实生苗的培养

雪莲种子经表面消毒处理后，接种于1/2MS固体培养基中，用试管或玻璃瓶静置光照培养，待种子萌发形成苗；

②雪莲无菌丛生苗的培养

雪莲胚芽经过诱导胚芽形成丛生芽、诱导丛生芽形成丛生苗、诱导丛生苗生根的步骤的处理，用试管或玻璃瓶静置光照培养，培育成苗；

诱导胚芽形成丛生芽和诱导丛生芽形成丛生苗所用的培养基是以MS培养基为基本培养基，添加蔗糖、肌醇和琼脂，添加不同种类和浓度植物激素；

诱导丛生苗生根所用的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，添加蔗糖、肌醇和琼脂，添加了不同种类和浓度植物激素；

(3)雪莲苗与内生真菌的共生培养

雪莲与DSE真菌共生培养的培养基质含有土壤、富含纤维素的天然添加物和营养液，雪莲和DSE真菌在栽培地、育苗床或玻璃器皿中光照培养；

将雪莲苗与DSE真菌移入共生培养基质中共生培养一段时间，移栽；也可以在栽培地应用DSE真菌直接在共生培养基质上进行雪莲的栽培。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：DSE真菌液体培养的培养基中葡萄糖的加入量按重量计为1.5-4％；无机盐类成分是硫酸镁和磷酸盐，其中磷酸盐是磷酸二氢钾和磷酸氢二钾以任意比例混合的混合物，其加入量按重量计为硫酸镁0.1-0.3％，磷酸盐0.1-0.5％；天然添加物为麦麸，其加入量按重量计为1-5％，须加水煮后取汁使用；培养基pH 5.0-6.5；三角瓶或其他容器振荡培养，或发酵罐通气培养，培养容器装量30-60％；培养基灭菌后接入上述DES真菌，种子菌种接种量为培养容器装量的5-15％；液体培养的培养条件为：振荡转速90-130转/分钟，22-26℃暗培养15-25天；培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：DSE真菌固体培养的培养基中豆饼粉的加入量按重量计为0.5-2％；富含纤维素的天然添加物为阔叶树锯末，小麦秸，玉米秸，玉米芯，或以上四种天然添加物以任意比例混合的混合物，其加入量按重量计均为20-25％；经人工加工生产的营养物质为甘油和玉米浆，其加入量按重量计为甘油1-7％，玉米浆0.2-1％；培养基pH 5.0-6.5；试管或玻璃罐头瓶或塑料袋静置培养，培养容器装量50-80％；培养基灭菌后接入液体培养的DES种子菌种，接种量为培养容器装量的2-10％；固体培养的培养条件为：22-26℃暗培养，待菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时取出备用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：雪莲无菌实生苗和丛生苗的培养中，所用的每升MS基本培养基或每升1/2MS基本培养基中，均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、琼脂6-15g；培养基pH 5.0-6.5；用试管或玻璃瓶培养，培养容器装量10-50％；苗的培养条件为15-26℃光照培养15-45天，光照强度1500-5000Lux，光照时间8-12小时/天；

雪莲无菌丛生苗的培养中，

(1)诱导胚芽形成丛生芽的培养基中添加的植物激素为6-苄基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，其加入量为每升培养基加入6-BA 1.0-3.0mg，NAA 0.02-0.1mg；

(2)诱导丛生芽形成丛生苗的培养基中添加的植物激素为6-BA和NAA，其加入量为每升培养基加入6-BA 0.08-2.0mg，NAA 0.1-0.3mg；

(3)诱导丛生苗生根的培养基中添加的植物激素为NAA，其加入量为每升培养基加入NAA0.1-0.3mg。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

(1)雪莲苗与DSE真菌共生培养的培养基质中土壤为腐殖质土，或蛭石，或腐殖质土和蛭石以5∶1-5的比例混合的混合土壤；富含纤维素的天然添加物是山毛榉科Fagaceae植物栎树或其他杂木树的自然落叶，用时粉碎并浸湿，碎树叶直径0.5-2cm，其加入量为培养基质中土壤重量的2-20％；营养液是MS液体培养基，或0.5-3.5％的蔗糖溶液，或水，营养液的添加比例按重量计可以是土壤∶营养液＝0.8-1.3∶2.5-4；

(2)雪莲苗与DSE真菌共生培养基质的制备方法为：先在玻璃容器的底部放置一层湿的碎树叶，再在树叶上铺放土壤，然后加入营养液，灭菌后使用；或先在栽培地、或育苗床、或炼苗地的基部铺放一层湿的碎树叶，再在树叶上铺放土壤，然后加入营养液；在栽培地、或育苗床、或炼苗地使用的土壤，可以直接使用，或提前堆积并盖塑料布发酵1-2个月，使其熟化杀菌后使用。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

(1)雪莲苗和真菌共生培养时，上述2种内生真菌DSE-1和DSE-2可以任选一种单独使用，也可以共同使用；

(2)雪莲苗与DSE真菌共生培养时，雪莲苗可以单株或2-5株苗为一丛进行栽培，先将上述液体培养或固体培养的DSE真菌接种在共生培养基质的树叶层，接种量为每株苗或每丛苗下接种固体培养的DSE真菌0.2-1.5g，或液体培养的DSE真菌0.2-1.5mL，再将雪莲苗按株行距2-15cm×2-15cm植入共生培养基质中，使苗的根与DSE真菌接触，用土壤把苗的根埋好；

(3)雪莲苗与DSE真菌的共生培养可以在栽培地，或育苗床，或炼苗地，或培养室中的玻璃器皿中进行，培养温度昼/夜为15-25℃/5-18℃，光照周期8-15小时/天，光照强度为2000-10000Lux。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：DSE真菌可以直接用于雪莲栽培地的种植，或将雪莲苗与DSE真菌共培养30-50天后再进行移栽，移栽时将雪莲苗连根取出即可；在共生培养过程中，可以根据需要补加或喷施营养液。

8.如权利要求1所述的方法也适用于雪莲的大面积栽培。