CN101781623B - 应用真菌诱导白木香树产生沉香的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用真菌诱导白木香树产生沉香的技术方法，所用的2株真菌为镰孢属(Fusarium sp.)真菌A-11和头孢霉属(Cephalosporium sp.)真菌A-17，内容包括真菌的培养方法和真菌的接种方法。应用该项技术，可以诱导白木香树的树干分泌产生与沉香化学成分相似的黄褐色物质。该项技术工艺简便，生产成本低，周期短，充分地利用和保护了白木香树资源，便于推广应用。

Description

应用真菌诱导白木香树产生沉香的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种利用真菌诱导白木香树产生沉香的方法。

背景技术

沉香(Agarwood)为瑞香科(Thymelaeceae)沉香属(Aquilaria)植物白木香[Aquilariasinensis(Lour.)Gilg.]含树脂的木材，称为国产沉香、土沉香、沉水香。从16世纪沉香已作为中药开始使用，其味辛、苦，性微温，具行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，用治胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症。白木香含树脂的木材为国产中药沉香的正品来源，也是我国生产中药沉香的唯一植物资源，其功用与进口沉香[同属植物沉香(Aquilariaagallocha Roxb.)]的含树脂的木材相同。中药沉香乃是中国、日本、印度以及其他东南亚国家的传统名贵药材和名贵的天然香料。

白木香又名土沉香、香材、牙香树、女儿香、栈香、青桂香、崖香和芫香，是一种热带亚热带常绿乔木，为我国特有的珍贵药用植物，主要分布在广东、海南、广西和福建等省，喜生于低海拔的山地、丘陵以及路边阳处疏林中。近年来，对沉香的需求量剧增，使得白木香野生资源的蕴藏量急剧下降，1987年被列为国家珍稀濒危三级保护植物，1999年又被国务院批准为国家二级重点保护野生植物。因此广辟生产途径，解决沉香资源贫乏问题变得十分迫切。

沉香是白木香在自然环境条件下，经机械损伤、真菌、昆虫等的作用下，长期分泌积累产生。目前，生产上多采用机械损伤，但存在产量低，品质差，而且生产周期长的缺陷。利用微生物来提高沉香产量，改善品质，缩短生产周期，是最有应用前景的途径之一。

发明内容

本发明的目的在于提供2株能够诱导白木香树产生沉香的真菌，这2株真菌都是从白木香树的茎部分离得到的，它们能诱导活体白木香树树干和离体白木香树树干分泌产生与沉香化学成分相似的黄褐色物质。

本发明的又一目的在于提供一种应用真菌诱导白木香树产生沉香的方法，该方法工艺简单，生产成本低廉，生产周期短，充分地利用和保护了白木香树资源，便于推广应用，解决沉香药用资源紧张的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术步骤是先培养真菌，再将真菌接种到白木香树的树干上。经过一段时间后，在接种部位的周围会产生与沉香化学成分相似的黄褐色物质，该物质燃烧时能产生沉香燃烧时特有的香气。本发明采用的2株真菌经鉴定分别为镰孢属真菌A-11(Fusarium sp.)，保藏编号CGMCC No.2596，和头孢霉属真菌A-17(Cephalosporium sp.)，保藏编号CGMCC No.2597。这2株真菌于2008年7月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所。菌株的保藏和存活证明见附件。

真菌A-11的培养特性为：在PDA培养基上菌落为粉红色，气生菌丝为绳索状，菌落背面为杏黄色，分泌橘红色物质，生长1周菌落直径为7.9cm；小型分生孢子单孢，椭圆形或长圆形，稍弯曲，5-12.5×3-6.5μm；大型分生孢子双胞，长圆形，稍弯曲，1.5-18.5×5-6.7μm。

真菌A-17的培养特性为：在PDA培养基上菌落为粉红色，分泌红色物质，表面絮状，有同心环，生长1周菌落直径为5.5cm；分生孢子梗简单，从菌丝直接长出，单生；分生孢子单孢，无色，卵圆形或长圆形，5-11.5×2.5-5μm，常聚生于分生孢子梗顶端的液滴内。

具体地说，本发明所述的技术步骤方法如下：

1.真菌的培养

将由白木香树茎部分离得到的保藏编号为CGMCC No.2596的真菌A-11和保藏编号为CGMCC No.2597的真菌A-17分别自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于PDA培养基的平皿中，恒温培养15-20天；或转接于PDA液体培养基或麦麸液体培养基中，恒温震荡培养5-15天，或转接于锯末麦麸固体培养基中，恒温培养20-50天；培养温度均为22-28℃。

将上述培养的菌种接种到含有锯末、树叶和麦麸的锯末复合固体培养基中进行培养，待菌丝长满培养基后直接使用。锯末复合固体培养基中锯末、树叶和麦麸的重量比为2∶1∶0.5。

2.真菌的接种

选取树龄5年以上的白木香树的树干或离体树干，通过钻孔的方式在树干形成直径0.5-3cm，深2-15cm的接种孔，或通过横向切割、或纵向切割、或从上向下斜向切割的方式，在树干形成长1-6cm，宽1-6cm，深1-6cm的接种槽。接种孔或接种槽的间隔是纵向间隔5-15cm，横向间隔3-10cm。在接种孔或接种槽中接入锯末复合固体培养基培养的菌种，接种后用聚丙烯薄膜包扎接种孔或接种槽。经过3-10个月后，在接种部位周围能产生与沉香化学成分相似的黄褐色物质。当观察到接种部位周围有黄褐色物质形成的时候，可以在黄褐色物质形成的区域中用上述方法重复接种真菌。

具体实施方式

实施例

PDA培养基平皿中培养的真菌A-11和A-17分别接种在锯末复合固体培养基上生长30天，备用。

选取树龄为5年的白木香树，用直径为1cm的钻头在树干上钻孔9个，孔深为4-6cm，各个孔洞间的间隔均为10cm，其中3个孔洞中接入2克灭菌后的锯末复合固体培养基作为对照，3个孔洞接入2克上述培养30天的真菌A-11，3个孔洞接入2克上述培养30天的真菌A-17，聚丙烯薄膜包扎接菌孔。

接种8个月后进行观察：对照的孔洞周围均无黄褐色物质分泌产生，接入真菌A-11的孔洞周围均有黄褐色物质分泌产生，平均树脂形成面积9.8cm²；接入真菌A-17的孔洞周围均有黄褐色物质分泌产生，平均树脂形成面积8.7cm²。从孔洞周围取下木料燃烧时，能产生独特的沉香香味。观察后在原接种部位再次分别接入真菌A11和A17。

比较例1

麦麸液体培养基培养的真菌A-11接种在锯末复合固体培养基上生长30天，备用。

选取树龄为8年的白木香树，在树干上采用以下4种方式形成接种孔或接菌槽：(1)钻孔，接种孔直径1cm，深6cm；(2)横向切割，形成长5cm，宽2cm，深3cm的凹槽；(3)纵向切割，形成长2cm，宽5cm，深3cm的凹槽；(4)从上向下斜向切割，形成长5cm，宽0.5cm，深3cm的凹槽；(5)穿透树干钻孔，孔直径1cm。每个接种孔或接种槽的间隔均为10cm。在方式(1)-(4)的接种孔或接种槽中接入3g上述培养30天的真菌A11，聚丙烯薄膜包扎接菌部位。方式(5)形成的穿孔中未接入真菌或灭菌后的锯末复合固体培养基，作为机械损伤处理的对照。以上每种方式重复3次。

6个月后进行观察：方式(5)的穿孔周围无黄褐色物质分泌产生；方式(1)-(4)的各接种部位周围均有黄褐色物质分泌产生，平均树脂形成面积见表1。从接种部位周围取下木料燃烧时，能产生独特的沉香香味。

表1不同方式接种真菌A-11的树脂形成面积

比较例2

锯末麦麸固体培养基培养的真菌A-11和真菌A-17分别在锯末复合固体培养基上生长30天，备用。

选取直径为15-40cm的白木香树木段，对木段进行灭活处理。用直径为1cm的钻头在木段上钻孔9个，孔深为4-6cm，各个孔洞间的间隔均为10cm。其中3个孔洞中接入灭菌后的锯末复合固体培养基作为对照，3个孔洞接入2g上述培养30天的真菌A-11，3个孔洞接入2g上述培养30天的真菌A-17，聚丙烯薄膜包扎接菌孔。另外，用直径为1cm的钻头在木段上穿孔3个，未接入真菌或灭菌后的锯末复合固体培养基，作为机械损伤处理的对照。

木段于24-26℃环境中放置8个月后进行观察，接入灭菌后的锯末复合固体培养基的孔洞和未接入真菌或灭菌后的锯末复合固体培养基的穿孔周围均无黄褐色物质分泌产生；接入真菌A-11和真菌A-17的孔洞周围均有黄褐色物质分泌产生。从孔洞周围取下木料燃烧时，能产生独特的沉香香味。

Claims (5)

1.一种应用真菌诱导白木香树产生沉香的方法，包括步骤：

(1)真菌的培养

将由白木香树分离得到的保藏编号为CGMCC No.2596的真菌A-11和保藏编号为CGMCCNo.2597的真菌A-17分别自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于PDA培养基的平皿中，恒温培养15-20天，或转接于PDA液体培养基或麦麸液体培养基中，恒温震荡培养5-15天，或转接于锯末麦麸固体培养基中，恒温培养20-50天；

将上述培养的菌种接种到锯末复合固体培养基中进行培养，待菌丝长满培养基后直接使用；锯末复合固体培养基含有锯末、树叶和麦麸，它们的重量比为2∶1∶0.5；

(2)真菌的培养特性

保藏编号为CGMCC No.2596的菌株A-11为镰孢属(Fusarium sp.)真菌，在PDA培养基上菌落为粉红色，气生菌丝为绳索状，菌落背面为杏黄色，分泌橘红色物质，生长1周菌落直径为7.9cm；小型分生孢子单孢，椭圆形或长圆形，稍弯曲，5-12.5×3-6.5μm；大型分生孢子双胞，长圆形，稍弯曲，1.5-18.5×5-6.7μm；

保藏编号为CGMCC No.2597的菌株A-17为头孢霉属(Cephalosporium sp.)真菌，在PDA培养基上菌落为粉红色，分泌红色物质，表面絮状，有同心环，生长1周菌落直径为5.5cm；分生孢子梗简单，从菌丝直接长出，单生；分生孢子单孢，无色，卵圆形或长圆形，5-11.5×2.5-5μm，常聚生于分生孢子梗顶端的液滴内；

(3)真菌的接种

接种真菌的方法为：选取树龄5年以上的白木香树树干，通过钻孔或挖槽的方式在树干形成接种孔或接种槽；在接种孔或接种槽中接入锯末复合固体培养基培养的菌种；接种后用聚丙烯薄膜包扎接种孔或接种槽；

用上述方法在白木香树的树干上接种真菌一次，或在第一次接种真菌后，在接种孔或接种槽的周围形成沉香样黄褐色物质的初期或中期，在原接种部位或在黄褐色物质形成区域中，用上述方法重复接种真菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用于钻孔或挖槽，接种真菌A-11和A-17的白木香树树干为树龄5年以上的活体白木香树干或树龄5年以上的离体白木香树干。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过钻孔的方式在树干形成直径0.5-3cm，深2-15cm的接种孔；或通过挖槽的方式在树干形成长1-6cm，宽1-6cm，深1-6cm的接种槽。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在树干挖接种槽的方式包括横向切割形成凹槽，纵向切割形成凹槽，或从上向下斜向形成凹槽。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：白木香树树干上接种孔或接种槽的间隔是纵向间隔5-15cm，横向间隔3-10cm。