CN110250211B - 一种诱导土沉香结香的生物物理方法及其应用 - Google Patents

一种诱导土沉香结香的生物物理方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导土沉香结香的生物物理方法及其应用。本发明公开的方法包括菌种准备、凹槽制备、菌种接种三个步骤。本发明利用烙伤创面与真菌诱导的结合，促进了菌丝的活化、提高了感染率、缩短了结香诱导时间。本发明的诱导结香的方法成本低、易操作、实用性强，适用于广大沉香树种植户开展人工结香，产出的沉香拟自然结香，不含化学污染物，接近天然沉香品质，其沉香醇浸出物含量符合国家药典标准。

Description

一种诱导土沉香结香的生物物理方法及其应用
技术领域
本发明属于生物农业技术领域，具体涉及一种诱导土沉香结香的生物物理方法及其应用。
背景技术
土沉香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)，别名白木香，为瑞香科(Thymelaceaceae)沉香属(Aquilaria spp.)常绿乔木，天然分布于海南、广东、广西、福建、台湾等省区。土沉香为国家二级重点保护植物。沉香是沉香属植物受到刺激或损伤时产生的次生代谢物，是传统的名贵药材。中医认为沉香性微温，味辛、苦，具有降气、调中、暖肾、止痛、肌松之功效。现代研究认为，沉香具有降压、镇静、镇痛、抗心律失常和抑制中枢系统兴奋等作用。沉香亦是名贵的天然香料，富含的挥发油成分使其香气浓郁。
20世纪70年代以来，由于沉香的经济价值高、市场需求量巨大，大量掠夺式砍伐采香使土沉香野生资源遭到严重破坏。天然沉香产量逐年锐减，货源紧缺，导致其价格不断上升。土沉香天然结香往往需要经历漫长的外部随机干扰过程、产量低，况且还不一定结香。为提高沉香产量、满足市场需求，人工促进结香成为必然。目前，人工诱导结香技术主要有物理方法，如“砍伤法”、“钻孔法”、“火烧孔”和“开香门”等，生物方法，如“接菌法”，以及化学方法，如“化学试剂滴注法”等，但这些单一方法的结香周期普遍较长、沉香得率较低、质量参差不齐。目前，尚缺乏物理方法与生物方法有机结合，提高结香得率和质量的有效方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种诱导土沉香结香的生物物理方法。
本发明的另一目的在于提供上述诱导土沉香结香的生物物理方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种诱导土沉香结香的生物物理方法，包含如下步骤：
(1)菌种准备：取土沉香真菌培养，生成菌丝待用；
(2)凹槽制备：在土沉香树干不同部位凿取数个凹槽，用烧红的铁块烙伤各个凹槽的槽面；
(3)菌种接种：待烙伤的槽面温度降至常温时，将土沉香真菌塞满烙伤后的凹槽，对槽口进行密封处理，目的是为了保湿。
步骤(1)中所述的土沉香真菌优选为龙眼焦腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)D2-2、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)P13-1和黑绿木霉菌(Trichoderma atroviride)马3-4中的至少一种。
步骤(1)中所述的菌种准备的具体操作为：取土沉香真菌接种在固体培养基或液体培养基中培养，获得菌丝。
所述的固体培养基优选为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。
在所述的固体培养基中的培养温度优选为25～30℃；更优选为28℃。
在所述的固体培养基中的培养时间优选为3～10天；更优选为4～5天。
所述的液体培养基优选为马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。
在所述的液体培养基中的培养条件优选为于100～200rpm的转速进行振荡培养；更优选于120rpm的转速进行振荡培养。
在所述的液体培养基中的培养温度优选为25～30℃；更优选为28℃。
在所述的液体培养基中的培养时间优选为7～14天。
步骤(2)中所述的凹槽制备的具体操作为：
A、在土沉香树干距地面30～50cm处，绕树干横向、等间距凿取凹槽4～5个，然后沿树干纵向向上每隔25～35cm做同样处理；
B、将烧红的铁块插入凹槽内并保持30s～60s，重复多次至凹槽烙伤、变黑为止。
步骤A中所述的等间距的长度优选为3～5cm。
步骤A中所述的做同样处理的次数优选为6～8次。
步骤(2)中所述的凹槽制备的时机优选为5～10月份中的晴天；更优选为7～9月份中的晴天。
步骤(2)中所述的土沉香优选为树龄≥8年生、胸径≥10cm的土沉香；更优选为树龄8～10年生、胸径10～13cm的土沉香。
步骤(2)中所述的凹槽优选长度2.5～3cm、宽度2～2.5cm、深度2～3cm的凹槽。
步骤(3)中所述的菌种接种的具体操作为：待烙伤的槽面温度降至常温时，将固体培养基培养的土沉香真菌菌丝连同培养基质；或将液体培养基培养收集的菌丝；或将固体培养菌种的菌丝连同培养基质与液体培养菌种的菌丝混合；塞满凹槽。
所述的土沉香真菌菌丝优选为龙眼焦腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)D2-2菌丝、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)P13-1菌丝和黑绿木霉菌(Trichoderma atroviride)马3-4菌丝中的至少一种；更优选为两种或三种的混合；具体为龙眼焦腐病菌D2-2和腐皮镰孢菌P13-1按体积比1～2：1～2配比混合，或是龙眼焦腐病菌D2-2、腐皮镰孢菌P13-1和黑绿木霉菌马3-4按体积比1～2：1～2：1～2配比混合；更具体为龙眼焦腐病菌D2-2和腐皮镰孢菌P13-1按体积比1：1配比混合，或是龙眼焦腐病菌D2-2、腐皮镰孢菌P13-1和黑绿木霉菌马3-4按体积比2：2：1配比混合。
步骤(3)中所述的常温为20～30℃；优选为25～28℃。
步骤(3)中所述的密封处理优选为采用薄膜带缠封凹槽。
所述的薄膜带的宽度优选为3～5cm。
所述的薄膜袋优选为聚丙烯薄膜带或嫁接薄膜带；更优选为嫁接用薄膜带。
步骤(3)中所述的密封处理的时长，1～4月优选20～30天，5～9月优选14～21天，10～12月优选30～45天。
所述的诱导土沉香结香的生物物理方法还包括：步骤(4)：割取凹槽周围形成的黑色或棕褐色油脂状的木质部，经晒干即为沉香。
步骤(4)中所述的割取时间优选为诱导6～10个月时；更优选为诱导10个月时。
所述的诱导土沉香结香的生物物理方法还包括：步骤(5)：对通过上述方法得到的沉香，测定其醇溶性浸出物、倍半萜及色酮类含量。
沉香油中醇溶性浸出物含量的检测采用热溶法测定。参照《中国药典》(2010版第一部)方法，采用热溶法测定。具体方法如下：样品置于40℃恒温鼓风干燥箱中，48h后取出粉碎，精确称取粉末2g，置于100mL的锥形瓶中，加入乙醇50mL，加塞，称重后静置1h。锥形瓶连接回流冷凝管后，加热至沸腾，并保持微沸1h。待冷却后，取下锥形瓶，加塞后称重，计算减失重量，加入与减失重量等量的乙醇，摇匀。取1/2滤液，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸去乙醇，于105℃干燥2h后置于干燥器，待冷却后迅速取出称重。此干燥品重量即为每克样品中的乙醇浸出物的含量。
沉香油中倍半萜与色酮类含量的检测，具体方法为：将上述乙醇提取的沉香油进行GC-MS分析。采用气质联用仪(美国，安捷伦7890B-5977A)。GS-MS条件：色谱柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；起始温度70℃，保持1min，后以8℃/min的升速至250℃，并保持10min；进样口温度250℃；进样量0.5μL(不分流)；色谱-质谱接口温度280℃；离子源温度230℃；电离方式EI；电子能量70e V；载气He(99.999％)；载气流速1.0mL/min；质量扫描范围35～350AMU；溶剂延迟4min。通过HPMSD化学工作站，采用峰面积归一化法计算各化学成分含量，通过NIST和Willy标准质谱库，经人工谱图解析和计算机检索。
所述的诱导土沉香结香的生物物理方法在土沉香结香中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1)烙伤凹槽内5面与菌剂接触，无论是纵向、横向，还是深度方向上，感染面和结香面均增大；
2)利用烙伤创面与真菌的结合，促进了菌丝的活化、提高了感染率、缩短了结香诱导时间；
3)所选菌株为从已结香土沉香树中分离、纯化培育的菌株，具有繁殖周期短、侵染效果明显特点；
4)本发明成本低、易操作、实用性强，适用于广大沉香树种植户开展人工结香；
5)本发明生产出的沉香拟自然结香，不含化学污染物，接近天然沉香品质，其沉香醇浸出物含量符合国家药典标准。
附图说明
图1是本发明实施例1凹槽制备效果拍照图。
图2是本发明实施例1凹槽密封处理效果拍照图。
图3是本发明实施例1诱导处理1个月时结香效果拍照图。
图4是本发明实施例1诱导处理6个月时结香效果拍照图。
图5是本发明实施例2诱导处理10个月时结香效果拍照图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本发明中所用到的龙眼焦腐病菌D2-2、腐皮镰孢菌P13-1和黑绿木霉菌马3-4已在文献“宋晓琛等.无机盐、激素与真菌联合诱导土沉香抗逆能力的研究，《植物研究》，2019，Vol.39(4)：505-513”中公开。
1、土沉香的制备
(1)将龙眼焦腐病菌D2-2和腐皮镰孢菌P13-1分别接种于PDA固体培养基中，于28℃培养4～5天。
(2)选择7月份的晴天，选取8年生、胸径10.2cm的土沉香树，在距地面30cm、树干同一高度、横向间隔距3cm，用凿子凿出4个长2.5cm，宽2.5cm，深2cm的凹槽，然后沿树干纵向每隔30cm做同样操作，共凿出24个凹槽。将完全烧红的铁块插入凹槽内、停留30s，重复3～4次，完全烙伤土沉香木质部、至黑色，凹槽的制备效果如图1所示。待凹槽降至常温后，将PDA固体培养基分别培养的龙眼焦腐病菌D2-2和腐皮镰孢菌P13-1菌丝连同基质(菌丝长满在基质中)，按1:1体积比混匀后、塞满凹槽，用宽5cm的聚丙烯薄膜带缠封保湿，密封处理的效果如图2所示。15天后揭除薄膜带。
2、对比方法
对比方法一：凹槽烙伤，未放菌种及保湿。
对比方法二：凹槽未烙伤，填加菌种及保湿，菌种的比例和保湿方法同上。
对比方法三：凹槽未烙伤、未放菌种、不保湿。
对比方法四：凹槽烙伤，添加菌种龙眼焦腐病菌和腐皮镰孢菌，体积比为3:1，保湿方法同上。
其中，诱导处理1个月时结香效果如图3所示，诱导处理6个月时结香效果如图4所示。处理6个月时，割取凹槽周围形成的黑色或棕褐色油脂状的木质部。
3、试验检测
对上述三种方法制备的沉香，测定其醇溶性浸出物、倍半萜及色酮类含量，见表1。
表1沉香质量检测
醇溶性浸出物含量％ 倍半萜含量％ 色酮类含量％
本发明方法 6.26 21.01 31.47
对比方法一 2.81 8.37 0
对比方法二 3.21 10.50 0
对比方法三 2.03 0 0
对比方法四 4.77 3.39 0
实施例2
1、土沉香的制备
(1)将龙眼焦腐病菌D2-2和腐皮镰孢菌P13-1分别接种于PDA固体培养基中，于28℃培养4～5天。
(2)选择8月份的晴天，选取10年生、胸径12.7cm的土沉香树。在距地面50cm、树干同一高度、横向间隔距5.0cm，用凿子凿出5个长3.0cm，宽2.5cm，深3.0cm，然后沿树干纵向每隔30cm做同样操作，共凿出30个凹槽。将完全烧红的铁块插入凹槽内、停留40s，重复4～5次，完全烙伤土沉香木质部、至黑色。待凹槽降至常温后，将PDA固体培养基培养的龙眼焦腐病菌D2-2和腐皮镰孢菌P13-1菌丝连同基质(菌丝长满在基质中)，按1:1体积比混匀后塞满凹槽，用宽3cm的嫁接薄膜带缠封、保湿，14天后揭除薄膜带。
2、对比方法
对比方法一：凹槽烙伤，未放菌种及保湿。
对比方法二：凹槽未烙伤，填加菌种及保湿，菌种的比例和保湿方法同上。
对比方法三：凹槽未烙伤、未放菌种、不保湿。
对比方法四：凹槽烙伤，添加菌种龙眼焦腐病菌和腐皮镰孢菌，体积比为3:1，保湿方法同上。
诱导处理10个月时的结香效果如图5所示，处理10个月后割取凹槽周围形成的黑色或棕褐色油脂状的木质部，即沉香。
3、试验检测
对上述三种方法得到的沉香，测定其醇溶性浸出物、倍半萜及色酮类含量，见表2。
表2沉香质量检测
醇溶性浸出物含量％ 倍半萜含量％ 色酮类含量％
本发明方法 14.80 26.82 37.53
对比方法一 3.27 9.39 0
对比方法二 5.88 10.64 0
对比方法三 2.93 0.29 0
对比方法四 7.32 4.35 3.18
实施例3
1、土沉香的制备
(1)将龙眼焦腐病菌D2-2和腐皮镰孢菌P13-1分别接种于PDA固体培养基中，于28℃培养4～5天。将黑绿木霉菌马3-4接种于PDB液体培养基，于28℃、120rpm的转速培养7天。
(2)选择9月份的晴天，选取10年生、胸径11.1cm的土沉香树。在距离地面50cm，同一高度处、用凿子凿取凹槽等间隔距4.5cm的5个长2.5cm，宽2.0cm，深2.5cm的凹槽，然后沿树干径向每隔30cm做同样操作，共凿出30个凹槽。将完全烧红的铁块插入凹槽内40s，重复3～4次，完全烙伤土沉香木质部至黑色。待凹槽降至常温后，将PDA固体培养基培养的龙眼焦腐病菌D2-2和腐皮镰孢菌P13-1菌丝连同基质(菌丝长满在基质中)以及液体培养基培养7天后、过滤收集的黑绿木霉马3-4菌菌丝，按2:2:1体积比混匀、塞满凹槽，用宽3cm的嫁接薄膜带缠封、保湿，20天后揭除薄膜带。
2、对比方法
对比方法一：凹槽烙伤，未放菌种及保湿。
对比方法二：凹槽未烙伤，填加菌种及保湿，菌种的比例和保湿方法同上。
对比方法三：凹槽未烙伤、未放菌种、不保湿。
对比方法四：凹槽烙伤，添加菌种龙眼焦腐菌、腐皮镰孢菌和黑绿木霉，体积比为1:1:2，保湿方法同上。
处理10个月后，割取凹槽周围形成的黑色或棕褐色油脂状的木质部，即沉香。
3、试验检测
对上述三种方法得到的沉香，测定其醇溶性浸出物、倍半萜及色酮类含量，见表3。
表3沉香质量检测
醇溶性浸出物含量％ 倍半萜含量％ 色酮类含量％
本发明方法 10.24 21.56 4.40
对比方法一 3.06 8.97 0
对比方法二 4.95 9.03 0
对比方法三 2.93 0.29 0
对比方法四 6.70 7.01 0
表1～3中的数据显示，本发明不仅提高了土沉香木质部醇溶性浸出物和倍半萜含量，而且也大大提高了色酮类物质的含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种诱导土沉香结香的生物物理方法，其特征在于：包含如下步骤：
（1）菌种准备：取土沉香真菌培养，生成菌丝待用；
（2）凹槽制备：在土沉香树干距地面30～50cm处，绕树干横向、等间距凿取凹槽4～5个，然后沿树干纵向向上每隔25～35cm做同样处理；将烧红的铁块插入凹槽内并保持30s～60s，重复至凹槽烙伤、变黑为止；
（3）菌种接种：待烙伤的槽面温度降至常温时，将土沉香真菌塞满烙伤后的凹槽，对槽口进行密封处理；
（4）割取凹槽周围形成的黑色或棕褐色油脂状的木质部，经晒干即为沉香；
所述的土沉香真菌菌丝为龙眼焦腐病菌D2-2和腐皮镰孢菌P13-1按体积比1：1配比混合，或是龙眼焦腐病菌D2-2、腐皮镰孢菌P13-1和黑绿木霉菌马3-4按体积比2：2：1配比混合。
2.根据权利要求1所述的诱导土沉香结香的生物物理方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的菌种接种的具体操作为：待烙伤的槽面温度降至常温时，将固体培养基培养的土沉香真菌菌丝连同培养基质；或将液体培养基培养收集的菌丝；或将固体培养菌种的菌丝连同培养基质与液体培养菌种的菌丝混合，塞满凹槽。
3.根据权利要求1所述的诱导土沉香结香的生物物理方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的菌种准备的具体操作为：取土沉香真菌接种在固体培养基或液体培养基中培养，获得菌丝。
4.根据权利要求1所述的诱导土沉香结香的生物物理方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的等间距的长度为3～5cm；
步骤（2）中所述的做同样处理的次数为6～8次；
步骤（2）中所述的凹槽制备的时机为5～10月份中的晴天；
步骤（2）中所述的土沉香为树龄≥8年生、胸径≥10cm的土沉香；
步骤（2）中所述的凹槽长度2.5～3cm、宽度2～2.5cm、深度2～3cm。
5.根据权利要求1所述的诱导土沉香结香的生物物理方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的常温为20～30℃；
步骤（3）中所述的密封处理为采用薄膜带缠封凹槽；
步骤（3）中所述的密封处理的时长，1～4月为20～30天，5～9月为14～21天，10～12月为30～45天。
6.根据权利要求1所述的诱导土沉香结香的生物物理方法，其特征在于：所述的割取时间为诱导6～10个月时。
7.权利要求1～6任一项所述的诱导土沉香结香的生物物理方法在土沉香结香中的应用。
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