CN104894168A - 一种鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法，其步骤包括：(1)先将鸡枞菌子实体接种得到鸡枞菌接种物，然后将鸡枞菌接种物进行深层发酵获得鸡枞菌发酵混合物；(2)将步骤(1)中的鸡枞菌发酵混合物进行水蒸气蒸馏得到挥发油；(3)将步骤(2)中的挥发油纯化后得到所述鸡枞菌发酵物烟用提取物。本发明将鸡枞菌的深层发酵物提取后用于卷烟的香精香料中，不仅天然无毒，产量稳定，可控性强，不受季节、气候、病害等因素的影响，而且生产周期短，成本低廉。同时，制备的烟用香精香料香味更加自然、持久，具有更好的协调性，可与其他烟用香精香料协调配合增香。本发明工艺简单，成本低，具有很强的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及烟用香精香料的制备领域，具体地说是一种鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法及其应用。
背景技术
鸡枞菌(Termitornyces albuminosus)又称伞把菇，属于担子菌纲，伞菌目，侧耳科，鸡枞菌属，是一种芳香怡人，营养丰富，具有一定保健功能的珍贵食用菌，主要分布于我国云南、四川、贵州、湖南、湖北以及中国台湾和香港等地。鸡枞菌含有丰富的皂苷、脑苷、纤维素酶、多糖、多酚等多种活性成分，具有醒脑、镇痛、抗病毒、抗炎、抗肿瘤以及抗氧化等生物活性。目前对于鸡枞菌的研究应用主要集中于食用和药用方面，对其发酵产物的提取应用还未做深入研究。
鸡枞菌等珍稀食药用菌含有一系列多样性极为丰富的香味化合物，有望成为天然烟用香料的新来源。野生鸡枞菌生长条件要求苛刻，生长发育与土白蚁的活动有密切关系。目前尚没有有关人工栽培技术在鸡枞菌培养上的突破性报道，随着鸡枞菌需求量的日益增加，野生鸡枞菌越发面临枯竭的危险。深层发酵(Submerged Fermentation,SmF)技术繁殖其发酵周期短，可操作性强，是一种快速获取食用菌 原料的生物技术，通过深层发酵获取鸡枞菌的发酵产物，更适合大规模工业生产和满足人们对鸡枞菌香料来源的供需要求。目前，尚未有有关将鸡枞菌深层发酵的发酵产物提取物用于烟用添加剂的报道。
发明内容
本发明的目的是根据现有技术提供一种鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法及其应用，将该烟用提取物用于卷烟中不仅香味自然持久，协调性好，而且该提取物产量稳定，可控性强。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法，其步骤包括：(1)先将鸡枞菌子实体接种得到鸡枞菌接种物，然后按鸡枞菌接种物与发酵培养基的体积比5-15％，将鸡枞菌接种物接种于发酵培养基，在温度20-30℃，通气量为0.8-1.2dm3/min，转速100-150r/min条件下，培养3-5天，进行深层发酵获得鸡枞菌发酵混合物；
(2)将步骤(1)中的鸡枞菌发酵混合物进行水蒸气蒸馏得到挥发油；
(3)将步骤(2)中的挥发油纯化后得到所述鸡枞菌发酵物烟用提取物。
优选的，所述步骤(3)中的纯化是将挥发油过滤分离得到滤液，将滤液浓缩后得到所述鸡枞菌发酵物烟用提取物A。
优选的，所述挥发油过滤分离后得到滤渣，加入滤渣重量4-6倍的质量浓度为90-95％的乙醇，浸泡3-6小时，然后过滤取滤液进行 浓缩，得到所述鸡枞菌发酵物烟用提取物B。
更优选的，所述鸡枞菌发酵物烟用提取物B的pH值为6.5-7.0。
优选的，所述步骤(1)中鸡枞菌子实体接种得到鸡枞菌接种物是指，将鸡枞菌子实体在无菌条件下从菌柄部位剪取组织片段，接种于分离琼脂平板，在温度28-30℃下静置培养5-7天至菌丝长满分离琼脂平板后，在无菌条件下挑取带有菌丝的琼脂5-15块，接种至种子培养基，在温度25-30℃，转速100-160r/min条件下，培养3-7天，得到所述鸡枞菌接种物。
优选的，所述分离琼脂平板的配方为：土豆：200-300g/L，琼脂：20-30g/L，葡萄糖：20-30g/L，酵母粉：2-3g/L，VB1：2-3mg/L，VB6：3-4mg/L，蚁巢浸出液：l60-180mL/L。
优选的，所述种子培养基的配方为：土豆：200-300g/L，葡萄糖：20-30g/L，酵母粉：2-3g/L，VB1：2-3mg/L，VB6：3-4mg/L，蚁巢浸出液：l60-180mL/L。
优选的，所述发酵培养基的配方为：土豆：200-300g/L，葡萄糖：20-30g/L，酵母粉：2-3g/L，VB1：2-3mg/L，VB6：4-6mg/L，蚁巢浸出液：l60-180mL/L。
本发明的另一个目的是提供上述鸡枞菌发酵物烟用提取物的应用，其特征在于：将鸡枞菌发酵物烟用提取物按照烟丝重量的0.001-0.01％的比例添加到烟丝中。
优选的，所述鸡枞菌发酵物烟用提取物为鸡枞菌发酵物烟用提取物A或鸡枞菌发酵物烟用提取物B或两者按照体积比1:1-3:1的混合 物。
本发明将鸡枞菌的深层发酵物提取后用于卷烟的香精香料中，不仅天然无毒，产量稳定，可控性强，不受季节、气候、病害等因素的影响，而且生产周期短，成本低廉。同时，制备的烟用香精香料香味更加自然、持久，具有更好的协调性，可与其他烟用香精香料协调配合增香。本发明工艺简单，成本低，具有很强的实用性。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明：
实施例1
(1)将鸡枞菌子实体在无菌条件下从菌柄部位剪取小块组织片段，接种于分离琼脂平板，在温度28℃静置培养7天，待菌丝长满平板后，在无菌条件下用接种钩挑取带有菌丝的琼脂5块，接种至种子培养基，在温度25℃，转速150r/min条件下，培养7天，获得鸡枞菌接种物。按体积比15％将鸡枞菌接种物接种于发酵培养基，在温度25℃，通气量为1.0dm3/min，转速100r/min条件下，培养4天，进行深层发酵获得鸡枞菌发酵混合物；
(2)将步骤(1)中鸡枞菌发酵混合物进行水蒸汽蒸馏提取挥发油至完全，得到浅红色透明挥发油。
(3)将步骤(2)中浅红色透明挥发油过滤，分离得到滤液，通过真空旋转蒸发浓缩，得到浅棕色透明鸡枞菌发酵物烟用提取物A。
(4)向步骤(3)中挥发油过滤后的滤渣中搅拌加入4倍量重量 95％的乙醇，静置6小时，过滤，得到浅棕色液体，通过真空旋转蒸发浓缩得到棕褐色鸡枞菌发酵物烟用提取物B，其pH值为7.0。
实施例2
(1)将鸡枞菌子实体在无菌条件下从菌柄部位剪取小块组织片段，接种于分离琼脂平板，在温度30℃静置培养5天，待菌丝长满平板后，在无菌条件下用接种钩挑取带有菌丝的琼脂10块，接种至种子培养基，在温度28℃，转速160r/min条件下，培养5天，获得鸡枞菌接种物。按体积比10％将鸡枞菌接种物接种于发酵培养基，在温度30℃，通气量为1.2dm3/min，转速150r/min条件下，培养5天，进行深层发酵获得鸡枞菌发酵混合物；
(2)将步骤(1)中鸡枞菌发酵混合物进行水蒸汽蒸馏提取挥发油至完全，得到浅红色透明挥发油。
(3)将步骤(2)中浅红色透明挥发油过滤，分离得到滤液，通过真空旋转蒸发浓缩，得到浅棕色透明鸡枞菌发酵物烟用提取物A。
(4)向步骤(3)中挥发油过滤后的滤渣中搅拌加入5倍量重量90％的乙醇，静置5小时，过滤，得到浅棕色液体，通过真空旋转蒸发浓缩得到棕褐色鸡枞菌发酵物烟用提取物B，其pH值为6.8。
实施例3
(1)将鸡枞菌子实体在无菌条件下从菌柄部位剪取小块组织片段，接种于分离琼脂平板，在温度29℃静置培养6天，待菌丝长满 平板后，在无菌条件下用接种钩挑取带有菌丝的琼脂15块，接种至种子培养基，在温度30℃，转速100r/min条件下，培养3天，获得鸡枞菌接种物。按体积比5％将鸡枞菌接种物接种于发酵培养基，在温度20℃，通气量为0.8dm3/min，转速120r/min条件下，培养3天，进行深层发酵获得鸡枞菌发酵混合物；
(2)将步骤(1)中鸡枞菌发酵混合物进行水蒸汽蒸馏提取挥发油至完全，得到浅红色透明挥发油。
(3)将步骤(2)中浅红色透明挥发油过滤，分离得到滤液，通过真空旋转蒸发浓缩，得到浅棕色透明鸡枞菌发酵物烟用提取物A。
(4)向步骤(3)中挥发油过滤后的滤渣中搅拌加入6倍量重量92％的乙醇，静置3小时，过滤，得到浅棕色液体，通过真空旋转蒸发浓缩得到棕褐色鸡枞菌发酵物烟用提取物B，其pH值为6.5。
上述实施例1-3中，所述分离琼脂平板配方为：土豆：200-300g/L，琼脂：20-30g/L，葡萄糖：20-30g/L，酵母粉：2-3g/L,VB1：2-3mg/L，VB6：3-4mg/L，蚁巢浸出液：l60-180mL/L，在无菌条件下倒入无菌平皿。
所述种子培养基配方为：土豆：200-300g/L，用八层纱布过滤土豆蒸煮液，葡萄糖：20-30g/L，酵母粉：2-3g/L,VB1：2-3mg/L，VB6：3-4mg/L，蚁巢浸出液：l60-180mL/L，在121℃高温高压灭菌15min。
所述发酵培养基的配方为：土豆200-300g/L，加入水1500ml，沸水蒸煮30分钟，用八层纱布过滤土豆蒸煮液，葡萄糖：20-30g/L， 酵母粉：2-3g/L,VB1：2-3mg/L，VB6：4-6mg/L，蚁巢浸出液l60-180mL/L，在121℃高温高压灭菌15min。
将实施例1中的鸡枞菌发酵物烟用提取物A用美国Agi lent公司产(6890N/5975C)气相质谱联用仪进行分析，分析条件如下，谱图如图1所示：
色谱柱：DB-WAX毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)；载气：He；流量：1.0mL/min；分流比：3∶1；进样量：1μL；升温程序：进样口温度250℃，起始温度40℃，停留1min，以10℃/min升至250℃，最后停留15min。EI电离能量：70eV；离子源温度：250℃；质谱接口温度：280℃；扫描质量范围：40-500m/z。
采用NIST11检索谱库法定性，峰面积归一化法定量。
图1为鸡枞菌发酵物烟用提取物A的GC-MS图，出峰保留时间及峰面积结果如表1所示。从中共鉴定出来40种挥发性化合物，其中醛酮类占2.877％，酯类47.841占％，酸类占10.636％，醇类占0.435，芳香族类占9.908，其他占2.503％，40种挥发性化合物的峰面积占总峰面积的74.2％。其中含量比较高的有：月桂酸乙酯(1.762％)、肉豆蔻酸乙酯(2.234％)、十五酸乙酯(5.145)、棕榈酸乙酯(9.418％)、棕榈油酸乙酯(7.585％)、油酸乙酯(7.601)、亚油酸乙酯(8.701)、9,12,15-三十八碳酸乙酯(2.802)、油酸(5.098)、9,12十八碳二烯酸(5.134)、吡啶(1.00％)。
鸡枞菌发酵物烟用提取物A通过GC-MS检测，酯类有13类，脂肪酸3种，烃类22种，醇类有6种类，醛类有2类，芳香族类有3 种，酚类有1种。
鸡枞菌发酵物烟用提取物A中含有丰富多样的酯类、醇类和烷烃类伴有果香风味，且通常随着链长的增长而呈现出更强的花香特征，是食用菌最重要的风味物，还可以改善香烟味；少量的醛酮类和芳香族类在食用菌风味中起着重要的酸碱调和作用，又因它们通常具有坚果、酚香、酒香的香味，从而使卷烟香味更加自然、浓郁多样。因此，鸡枞菌发酵提取物香味成分丰富多样，具有极好的香烟增香功效。
所述鸡枞菌发酵物烟用提取物为鸡枞菌发酵物烟用提取物A或鸡枞菌发酵物烟用提取物B或两者按照体积比1:1-3:1进行混合的混合物。由于提取物A为初始的发酵产物提取产物，其物质种类含量以及数据的可行性均好于提取物B，因此未对提取物B进行进一步分析，优选条件为单独添加鸡枞菌发酵物烟用提取物A。
表1鸡枞菌发酵物烟用提取物A的GC-MS检测结果。
Claims (10)
1.一种鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法，其步骤包括：(1)先将鸡枞菌子实体接种得到鸡枞菌接种物，然后按鸡枞菌接种物与发酵培养基的体积比5-15％，将鸡枞菌接种物接种于发酵培养基，在温度20-30℃，通气量为0.8-1.2dm3/min，转速100-150r/min条件下，培养3-5天，进行深层发酵获得鸡枞菌发酵混合物；
(2)将步骤(1)中的鸡枞菌发酵混合物进行水蒸气蒸馏得到挥发油；
(3)将步骤(2)中的挥发油纯化后得到所述鸡枞菌发酵物烟用提取物。
2.根据权利要求1所述鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中的纯化是将挥发油过滤分离得到滤液，将滤液浓缩后得到所述鸡枞菌发酵物烟用提取物A。
3.根据权利要求2所述鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法，其特征在于：所述挥发油过滤分离后得到滤渣，加入滤渣重量4-6倍的质量浓度为90-95％的乙醇，浸泡3-6小时，然后过滤取滤液进行浓缩，得到所述鸡枞菌发酵物烟用提取物B。
4.根据权利要求3所述鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法，其特征在于：所述鸡枞菌发酵物烟用提取物B的pH值为6.5-7.0。
5.根据权利要求1所述鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中鸡枞菌子实体接种得到鸡枞菌接种物是指，将鸡枞菌子实体在无菌条件下从菌柄部位剪取组织片段，接种于分离琼脂平板，在温度28-30℃下静置培养5-7天至菌丝长满分离琼脂平板后，在无菌条件下挑取带有菌丝的琼脂5-15块，接种至种子培养基，在温度25-30℃，转速100-160r/min条件下，培养3-7天，得到所述鸡枞菌接种物。
6.根据权利要求5所述鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法，其特征在于：所述分离琼脂平板的配方为：土豆：200-300g/L，琼脂：20-30g/L，葡萄糖：20-30g/L，酵母粉：2-3g/L，VB1：2-3mg/L，VB6：3-4mg/L，蚁巢浸出液：l60-180mL/L。
7.根据权利要求5所述鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法，其特征在于：所述种子培养基的配方为：土豆：200-300g/L，葡萄糖：20-30g/L，酵母粉：2-3g/L，VB1：2-3mg/L，VB6：3-4mg/L，蚁巢浸出液：l60-180mL/L。
8.根据权利要求1所述鸡枞菌发酵物烟用提取物的提取方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方为：土豆：200-300g/L，葡萄糖：20-30g/L，酵母粉：2-3g/L，VB1：2-3mg/L，VB6：4-6mg/L，蚁巢浸出液：l60-180mL/L。
9.一种权利要求1-8中任一项所述鸡枞菌发酵物烟用提取物的应用，其特征在于：将鸡枞菌发酵物烟用提取物按照烟丝重量的0.001-0.01％的比例添加到烟丝中。
10.根据权利要求9所述鸡枞菌发酵物烟用提取物的应用，其特征在于：所述鸡枞菌发酵物烟用提取物为鸡枞菌发酵物烟用提取物A或鸡枞菌发酵物烟用提取物B或两者按照体积比1:1-3:1进行混合的混合物。
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