KR100480981B1 - 느타리 버섯 균사체 배양물로부터 육고기향의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 느타리버섯 균사체의 액체 배양에 의해 천연 육고기향 성분을 생산하는 방법에 관한 것으로, 시스테인(cysteine)과 리보오스(ribose)를 포함하는 액체 배지에 느타리버섯(Pleuotus ostreatus) 균사체를 접종하여 배양하고, 상기 배양액을 가열하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 육고기향의 생산 방법에 의하면, 느타리버섯을 이용하여 천연의 우수한 향을 지닌 육고기향을 제조할 수 있으며, 천연 육고기향을 대량 생산할 수 있는 산업화 공정개발이 가능하도록 기반을 제공하는데 활용할 수 있다.

Description

느타리 버섯 균사체 배양물로부터 육고기향의 생산 방법{METHOD OF PRODUCING MEAT FLAVOR FROM CULTURES OF PLEUOTUS OSTREATUS MYCELIA}

본 발명은 느타리버섯 균사체의 액체 배양에 의해 천연 육고기향 성분을 생산하는 방법에 관한 것이다.

생물산업은 생물공학기술의 응용분야가 매우 다양할 뿐 아니라 분야간 기술 융합이 가능하기 때문에, 인류의 복지 및 환경에 대한 관심과 수요가 증대되면서 그 범위가 의약, 환경, 화학, 식품, 에너지, 농업, 해양 등으로 확대되고 있다. 이에 따라, 1981 년 이전에는 생명공학 참여 기업이 4 개 이하였지만 1982 년 이래 지속적으로 그 수가 증가하고 있으며, 정부에서도 정책적으로 생물산업을 육성하고 있다.

버섯은 영양기관인 균사체와 번식기관인 포자를 지닌 자실체로 되어 있는데, 균사체는 고등식물의 뿌리, 줄기 및 잎에 해당되며, 자실체는 꽃에 해당된다(Park, H. M., Shin, H. D., Oh, D. C., Yun, K. S., 및 Lee, C. K. Fundamentals of the Fungi. The World Science. Seuol. Korea., 2000). 버섯의 자실체 기간은 짧고 1 년중 대부분은 솜털 모양의 가는 실 같은 균사체가 부식토 또는 고목과 같은 유기물 속에서 생육한다. 자실체에서 형성된 포자가 발아하여 1 차 균사로 되고, 화합성인 균사가 서로 세포질 융합이 이루어져 2 차 균사로 된다. 2 차 균사가 충분한 영양분을 섭취하여 만연되면 적당한 환경 하에서 균사가 조직화되고 3차 균사를 형성하여 자실체를 발생하게 된다(Sung, J. M., Yu, Y. B., 및 Cha, D. L. Mushroom Science. Kyohak. Seuol. Korea, 1998).

버섯은 탄수화물(Hong, J. S., 및 Kim, T. Y. Composition of organic sugar and sugar alcohol in Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes and Agaricus bisporus. Kor. J. Food Sci. Tech. 20:459-462, 1988; Hwang, S. H., Kim, J. I., 및 Sung, C. J. Analysis of dietary fiber content of some vegetables, mushrooms, fruits and seaweeds. J. Kor. Soc. Food Nutr. 29:89-96, 1996), 단백질(Hong, J. S., Kim, Y. H., Lee, K. R., Kim, M. K., Cho,J.S., Park, K. H., Choi, Y. H., 및 Lee, J. B. Composition of organic acid and fatty acid in Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes and Agaricus bisporus. Kor. J. Food Sci. Tech. 20: 100-105, 1989) 지질(Kwon, Y. J., 및 Uhm, T. B. A study on the lipid components in oyster mushroom (Pleurotus florida). J. Kor. Soc. Food Nutr. 13: 175-180, 1984), 무기질 및 비타민(Bano, Z., 및 Rajarathnam,S. Pleurotus mushroom. Part Ⅲ. Chemical composition, nutritional value, postharvest physiology, preservation, and role as human food. CRC Reviews in Food Sci. Nutri. 27:87-158, 1988) 등의 영양소를 골고루 함유하고 있을 뿐만 아니라 독특한 맛과 향기(Jung, S. T., 및 Hong, J. S. Volatile components of oyster mushroom (Pleurotus sp.) cultivated in korea. Kor. J. Mycol. 19:299-305, 1991)를 지니고 있으며, 저칼로리식품 및 무공해식품으로도 진가가 인정되는 건강 식품이다. 특히 버섯의 항암작용, 생체기능 조절 및 뇌졸중, 심장병 등 성인병에 대한 예방과 개선 효과가 보고됨(Jung, I. C., Park, S., Park, K. S., 및 Ha, C. H. Antioxidative effect of fruit body and mycelia extracts of Pleurotus ostreatus. Kor. J. Food Sci. Tech. 28: 464-469, 1996; Kim, G. J., Kim, H. S., 및 Chung, S. Y. Effects of varied mushroom on lipid compositions in dietary hypercholestrolemic rats. J. Kor. Soc. Food Nutr. 21: 131-135, 1992)에 따라 버섯에 대한 관심은 더욱 높아지고 있다.

버섯의 향기 성분에 관해서도 많은 연구가 있었는데, 표고버섯(Lentinus edodes)의 향기 성분으로는 수확시기에 따라 약간의 차이는 있지만 가장 많은 성분으로 1-옥텐-3-올이 51∼52 %를 차지하고 그 다음으로는 n-헥산알(2.6 %), cis-2-옥텐올(2.3 %) 등이 있는 것으로 알려져 있다(Flores J. Medierranean vs northera european meat products. Processing technologies and main differences. Food Chem. 59: 505-510, 1997). 또한, 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus)의 중요 향기 성분은 3-옥타논, 3-옥테논, 1-옥텐-3-올, 벤즈알데히드, 1-옥테논, 2-옥텐-1-올 등으로 보고되어 있으며(Picardi, S. M., 및 Issenberg, P. Investigation of some volatile constituents of mushroom (Agaricus bisporus); Change which occur during heating. J. Agric. Food Chem. 21: 959-962, 1973), 이외에도 아가리쿠스 속의 향기 성분에 관해서는 많은 연구가 이루어졌다(Cronin, D. A., 및 Ward, M. K. The characterization of some mushroom volatile. J. Sci. Fd. Agric. 22: 447-480, 1971; Mega, J. A. Mushroom flavor. J. Agric. Food Chem. 29: 1-4, 1981; Tressl, R., Bahri, D., 및 Engel, K. H. Formation of eight-carbon components in mushroom (Agaricus bisporus). J. Agric. Food Chem. 30: 89-93, 1982; Chen, C. C., 및 Wu, C. M. Volatile components of mushroom (Agaricus subrufecens). J. Food Sci. 49: 1208-1210, 1984).

한편, 느타리버섯(Pleuotus ostreatus)은 미루나무 등과 같은 연한 재질의 활엽수 고사목 및 자른 그루터기에 자생하는 식용버섯으로 맛과 향기가 좋고 영양가가 높으며 항암 작용, 혈압강하 작용이 있는 약효성분들을 함유하고 있어, 전세계적으로 생산과 소비가 증가하고 있는 건강식품이다. 이러한 느타리버섯은 생물 분류학상 균류계의 균계 담자균문 단실담자균아강 주름버섯목 송이과에 속하는데 (Ahn, J. S., 및 Lee, K. H. Studies on the volatile aroma components of edible mushroom (Pleurotus ostreatus) of Korea. J. Kor. Soc. Food Nutr. 15: 258-262, 1986; Mottram, D. S. Flavour formation in meat and meat products:a review. Food Chem. 62: 415-424, 1998), 형태는 우산형으로 갓의 표면은 짙은 회색이고 대는 흰색이다. 그러나 최근에 육성한 원형느타리, 여름느타리, 사철느타리 등은 대부분 갓의 중앙부분이 오목하게 들어간 깔때기 모양이 주류를 이루고 있다(Hong, J. S. Studies on the physio-chemical properties and the cultivation of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus). J. Kor. Agric. Chem. Soc. 21: 150-184, 1978).

느타리버섯이 식품재료로서 높이 선호되고 있는 것은 특유의 풍미와 조직감 때문이라 할 수 있다. 느타리버섯의 풍미에 중요한 영향을 미치는 휘발성 향기 성분으로는 3-옥탄올, 3-옥타논, 1-옥텐-3-올, 이소부틸알콜, 이소아밀알콜이 전체의 89 % 이상을 차지한다는 것이 알려져 있다(Sensory and chemistry analysis of cooked porcine meat patties in relation to warmed-over flavour and pre-slaughter stress. Meat Sci. 59: 229-249, 2001). 그러나, 느타리버섯 균사체를 액체 배양한 배양액의 향기 성분에 관한 연구는 알려져 있지 않다.

한편, 육고기향(meat flavor)을 생성하는 화합물을 살펴보면, 대부분이 쇠고기를 가열하였을 때 생성되는 화합물들로, 대표적인 것은 푸란(furans)류에서 3-머캡토-2-메틸-4,5-디하이드로푸란, 4-머캡토-2-메틸푸란이 있으며, 티오펜 (thiophenes)류에서 3-머캡토-2-메틸티오펜, 3-머캡토-2-메틸-2,3-디하이드로티오펜, 3-머캡토-2-메틸-4,5-디하이드로티오펜, 4-머캡토-2-메틸-4,5-디하이드로티오펜이 있다. 이밖에도 티아졸(thiazols), 피라진(pyrazines), 옥사졸(oxazoles), 그리고 또 다른 헤테로사이클릭 황화합물 등이 있다(Ko, S. N., Yoon, S. H., Yoon, S. K., 및 Kim, W. J. Development of meat-like flavor by maillard reaction of model system with amino acids sugars. Kor. J. Food. Tech. 29: 827-838, 1997; Farmer, L. J., Ronald, L. S., 및 Patterson. Compounds contributing to meat flavour. Chem., 40: 201-205, 1991; Hackerman, R. H. Studies on chitin 1. Enzyme degradation of chitin and chitin esters. J. Biol. Sci. 7: 168-170, 1954; Hong, J. S., Lee, J. Y., Kim, H. K., Kim, M. K., Jung, G. T., 및 Lee, K. R. Studies on the volatile aroma components of Pleurotus ostreatus. Kor. J. Mycol. 14; 31-36, 1986).

본 발명의 목적은 식용으로 널리 재배되고 있는 버섯을 이용하여 천연 육고기향을 생산하고자 하는 것으로, 버섯 균사체의 액체 배양법을 이용하여 육고기향을 생성하기 위한 배지 조성과 배양 조건을 확립하여, 최적 배양 조건에서 느타리버섯 균사체를 액체 배양하여 육고기향 성분을 생산하는 방법을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 육고기향의 생산 방법은,

시스테인(cysteine)과 리보오스(ribose)를 포함하는 액체 배지에 느타리버섯 (Pleuotus ostreatus) 균사체를 접종하여 배양하고, 상기 배양액을 가열하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기에서, 액체 배지는 대두박 10 %(w/v), 황백당 2.7 %(w/v), KH₂PO₄ 0.5 %(w/v) 및 MgSO₄·7H₂O 0.5 %(w/v)를 증류수에 녹여서 멸균한 것이 바람직하고, 시스테인과 리보오스는 배지에 각각 1 %와 2 %의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.

또한, 느타리버섯 균사체의 배양은 액체 배지의 pH를 5.5로 하고 25 ℃에서 120 rpm의 진탕 속도로 7 일 동안 배양하는 것이 바람직하고, 배양액은 121 ℃에서 15 분간 가열하는 것이 바람직하다.

이와 같이, 시스테인과 리보오스를 포함하는 액체 배지에 느타리버섯 균사체를 접종하여 배양하는 것에 의해 육고기향의 전구물질인 2-푸란카복스알데히드 및 푸르푸릴알콜을 생산하게 되고, 이어서 배양액의 가열에 의해 육고기향 성분인 2-포르밀-5-메틸티오펜과 디메틸포르밀-티오펜이 생산된다.

본 발명에서는, 식용버섯으로 맛과 향기가 좋고 영양가가 높으며 항암 작용, 혈압강하 작용이 있는 약효성분들을 함유하고 있는 것으로 유용한 느타리버섯의 균사체 배양을 통해 천연 육고기향 성분을 생산하기 위하여 배양 조건과 배지 조성을 특정하였다.

즉, 대두박, 황백당, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O를 포함하는 기본 배지에 시스테인과 리보오스를 첨가하고, 여기에 느타리버섯 균사체를 접종하여 최적 조건에서 배양하는 과정을 통해, 육고기향의 향기 성분의 전구물질로 생각되는 2-푸란카복스알데히드와 푸르푸릴알콜을 생산할 수 있었다. 이어서, 이 배양액을 가열하였을 때 쇠고기의 가열에서 생성되는 티오펜 화합물로서 육고기향의 생성에 중요한 역할을 하는 향기 성분인 2-포르밀-5-메틸티오펜과 디메틸포르밀-티오펜이 생성된 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명에 따른 육고기향(meat flavor; 이하 MF로 약칭)의 생산 방법을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

본 실시예에 사용되는 원료 버섯으로서 느타리버섯(Pleuotus ostreatus; 이하 PO로 약칭), 신령버섯(Agaricus blazai; 이하 AZ으로 약칭), 표고버섯(Lentinus edodes; 이하 LE로 약칭) 등의 균주는 (주)HK 바이오텍(Chinju, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 대두박은 태평양(Seoul, Korea), 황백당은 제일제당(Seoul, Korea), KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O 및 Na ₂SO₄는 신요사(Shinyo, Osaka, Japan)에서 구입하였다. 실험에 사용한 아미노산으로 시스테인(Cys), 글루타민(Gln), 메티오닌(Met)과 당으로서 프럭토오스(Fru), 갈락토오스(Gal), 글루코오스(Glu), 말토오스(Mal), 리보오스(Rib), 슈크로오스(Suc), 자일로오스(Xyl)는 시그마사(Sigm, St. Louis. MO, U.S.A)에서 구입하였고, 아세트산 등의 유기산은 알드리치사(Aldrich, Milwarfe. WI, U.S.A)에서 구입하였다. 디에틸에테르, 에탄올, 헥산은 제이. 티. 베이커사(J. T. Baker, Phillipsurg. NJ, U.S.A)에서 HPLC 등급을 구입하였고, 그 외 사용된 시약은 시약등급 이상이었다.

실시예 1: 버섯 균사체의 액체 배양

버섯 균사체의 배양에 사용되는 기본 배지는 대두박 10 %(w/v), 황백당 2.7 %(w/v), KH₂PO₄ 0.5 %(w/v), MgSO₄·7H₂O 0.5 %(w/v)를 증류수에 녹여서 멸균한 다음 사용하였다.

배양 조건은 PO, AZ, LE를 기본 배지에 접종(버섯 액체 균사체, 25 ㎖)하고 온도 20, 25 및 30 ℃, pH 4.5, 5.5, 6.5 및 7.5, 진탕 속도 60, 120 및 220 rpm으로 하여, 배양 기간 3, 7 및 10 일 동안 각각 배양하였다. 버섯 균사체 배양 전·후 배지의 pH를 측정하였다. 버섯 균사체 배양액 100 ㎖ 중의 버섯 액체 균사체를 여과지(Whatman No. 2)에서 진공 여과하고 80 ℃에서 5 시간 건조하여 무게를 측정하였다.

① 다음 표 1은 배양 온도에 따른 버섯 균사체의 건조중량을 나타낸 것으로, 기본 배지에서 진탕속도 120 rpm으로 7 일간 배양한 결과이다.

온도(℃)	균사체 건조중량(g/100 ㎖)
	PO	AZ	LE
20	5.67±0.2	5.50±1.0	4.08±0.5
25	6.08±0.1	5.78±1.5	4.58±0.4
30	5.68±0.3	5.20±0.2	4.25±0.2

위 표에서 보면 각 균사체의 건조중량은 PO가 5.67∼6.08 g/100 ㎖, AZ가 5.20∼5.78 g/100 ㎖, LE가 4.08∼4.58 g/100 ㎖로서, 25 ℃에서 모든 버섯 균사체들이 최대로 생장하는 것을 알 수 있다.

② 다음 표 2는 배양 pH에 따른 버섯 균사체의 건조중량을 나타낸 것으로, 기본 배지에서 25 ℃, 진탕속도 120 rpm으로 7 일간 배양한 결과이다.

pH	균사체 건조중량(g/100 ㎖)
	PO	AZ	LE
4.5	4.75±0.5	5.08±0.1	3.94±0.1
5.5	6.28±0.4	6.54±0.5	4.58±0.5
6.5	6.07±0.2	6.12±0.5	4.04±0.2
7.5	5.04±0.5	5.15±0.3	3.05±0.3

위 표에서 보면 각 균사체의 건조중량은 PO가 4.75∼6.28 g/100 ㎖, AZ가 5.08∼6.54 g/100 ㎖, LE가 3.05∼4.58 g/100 ㎖로서, 배지의 pH가 5.5일 때 버섯 균사체가 가장 활발하게 성장하는 것을 확인하였다.

③ 다음 표 3은 진탕속도에 따른 버섯 균사체의 건조중량을 나타낸 것으로, pH가 5.5로 조절된 기본 배지에서 25 ℃로 7 일간 배양한 결과이다.

진탕속도(rpm)	균사체 건조중량(g/100 ㎖)
	PO	AZ	LE
60	4.05±0.1`	4.80±0.2	4.15±0.1
120	6.58±0.2	5.87±0.3	4.98±0.5
220	1.05±0.2	1.20±0.1	1.32±0.5

위 표에서 보면 각 균사체의 건조중량은 PO가 1.05∼6.58 g/100 ㎖, AZ가 1.20∼5.87 g/100 ㎖, LE가 1.32∼4.98 g/100 ㎖로서, 진탕속도 120 rpm에서 버섯 균사체의 성장이 가장 활발한 것을 알 수 있다. 진탕속도가 60 rpm 및 220 rpm일 때는 120 rpm에 비해 균사 생장 정도가 저조하였으며, 특히 220 rpm에서는 120 rpm에 비하여 균사생장이 약 70∼80 %정도 저하되었다. 이러한 결과로 볼 때, 진탕속도 120 rpm 이하에서는 흔들림(공기와의 접촉)이 적어 균사의 펠렛이 생장하는데 적합하지 못하고, 120 rpm 이상에서는 심한 흔들림으로 인하여 균사가 자극을 받아 균사생장이 저해되는 것으로 생각되어, 최적 진탕속도를 120 rpm으로 하였다.

④ 다음 표 4는 배양기간에 따른 버섯 균사체의 건조중량을 나타낸 것으로, pH가 5.5로 조절된 기본 배지에서 25 ℃, 120 rpm으로 배양한 결과이다.

배양기간(일)	균사체 건조중량(g/100 ㎖)
	PO	AZ	LE
3	4.12±0.1	4.13±0.1	3.10±0.2
7	6.85±0.1	6.87±0.1	4.58±0.4
10	12.21±0.1	13.05±0.1	10.52±0.2

위 표에서 보면 각 균사체의 건조중량은 PO가 4.12∼12.21 g/100 ㎖, AZ가 4.13∼13.05 g/100 ㎖, LE가 3.10∼10.52 g/100 ㎖로서, 배양 기간이 3 일인 경우에는 균사체의 생장이 저조하였고, 10 일인 경우에는 MF를 얻을 수 없을 정도로 균사체가 과잉 생장하였다. 따라서 MF를 최대로 생산할 수 있는 최적 배양 기간은 7일로 결정하였다.

한편, 도 1은 각 버섯 균사체의 배양 기간 동안 배양액의 pH 변화를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보면 배양 기간에 따른 배양액의 pH 변화는 크지 않음을 알 수 있다.

실시예 2: 육고기향(meat flavour; MF) 생성 배지

MF 생성에 적합한 배지 조성을 조사하기 위해 기본 배지(250 ㎖)에 ① 아미노산(Cys, Gln, Met) 1 %(w/v) 첨가, ② 당(Fru, Gal, Rib, Xyl) 2 %(w/v) 첨가, 및 ③ 아미노산 1 %(w/v)와 당 2 %(w/v)를 혼합 첨가한 배지를 준비하였다.

각 처리구를 살균하여 PO, AZ 및 LE 버섯 액체 균사체(25 ㎖)를 접종한 다음, 위 실시예 1의 방법에 따라 25 ℃, 120 rpm으로 7 일 동안 배양하고, 배양액을 가열하여 관능검사하였다. 각 향의 특징과 강도를 +(약), +++(중), +++++(강)로 표시하였다.

① 먼저 아미노산(Cys, Gln, Met)을 기본 배지에 첨가하여 PO를 배양한 결과를 보면, Cys을 첨가한 배양액에서는 유황의 자극성 있는 냄새, Gln을 첨가한 배양액에서는 달콤한 향이 났고, Met을 첨가한 배양액은 무향이었다. AZ를 배양한 결과를 보면, Cys을 첨가한 배양액에서는 유황의 자극성 있는 냄새, Gln과 Met을 첨가한 배양액에서는 곰팡이 냄새가 났다. LE를 배양한 결과, Cys을 첨가한 배양액에서는 유황의 자극성 있는 냄새, Gln을 첨가한 배양액에서는 곰팡이 냄새가 났고, Met을 첨가한 배양액은 무향이었다. 이와 같은 결과를 다음 표 5에 나타낸다.

버섯종류	첨가아미노산	냄새 특성
		고기향	달콤함	흙냄새	곰팡내	유황자극성	탄설탕냄새
PO	대조군CysGlnMet		+++ +++	+	+	+++++
AZ	대조군CysGlnMet				+++ ++++++	+++++
LE	대조군CysGlnMet		+	+++ ++	++++	+++++

위 표의 결과로 볼 때, 기본 배지에 아미노산을 첨가하여 버섯 균사체를 배양한 경우는 아미노산을 첨가하지 않은 대조구와 거의 차이가 없었으며, 따라서 MF를 생성하는데 있어 아미노산의 단독 첨가는 크게 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.

또한, 여러 가지 아미노산을 첨가한 기본 배지에서 버섯 균사체가 생육하는 동안의 pH 변화를 관찰한 결과를 다음 표 6에 나타낸다.

아미노산 또는당 처리		PO		AZ		LE
		배양전 pH	배양후 pH	배양전 pH	배양후 pH	배양전 pH	배양후 pH
아미노산	CysGlnMet	5.525.565.57	5.506.335.62	5.515.585.54	5.545.845.52	5.525.565.55	5.325.675.27
당	FruGalRibXyl	5.685.545.545.22	5.955.975.725.81	5.625.565.545.28	5.685.545.655.68	5.585.525.565.34	5.545.525.455.25

위 표에서 보듯이, 아미노산을 기본 배지에 첨가하였을 경우 pH는 기본 배지에 비해 큰 변화는 없었으나, 버섯 균사체를 배양한 후가 배양 전보다 pH가 0.1∼0.3 이상 높아졌으며, 특히 Gln이 첨가된 배양액은 pH가 6 이상으로 높아졌다.

② 다음에, 당(Fru, Gal, Rib, Xyl)을 기본 배지(250 ㎖)에 2 %(w/v)의 농도로 첨가하여 PO, AZ, LE를 각각 배양(25 ℃, 120 rpm, 7 일)한 후, 배양액을 가열하여 관능검사한 결과를 보면, PO의 경우 모든 당에서 달콤한 향이 났다. AZ를 배양한 경우에는 Fru와 Xyl를 첨가한 배양액에서는 곰팡이 냄새가 났고, Gal를 첨가한 배양액에서는 흙 냄새가 났고, Rib를 첨가한 배양액에서는 달콤한 향이 났다. 또한, LE를 배양한 경우 Fru을 첨가한 배양액에서는 달콤한 향, Gal를 첨가한 배양액에서는 곰팡이 냄새가 났고, Rib, Xyl를 첨가한 배양액은 무향이었다. 이와 같은 결과를 다음 표 7에 나타낸다.

버섯종류	당	냄새 특성
		고기향	달콤함	흙냄새	곰팡내	유황자극성	탄설탕냄새
PO	대조군FruGalRibXyl		+++++++++++++++		++ +
AZ	대조군FruGalRibXyl		+++	++++++	+++++++++++
LE	대조군FruGalRibXyl		++++ ++	+++ +	++++ +

위 표에서 보듯이, 기본 배지에 당을 첨가하여 버섯 균사체를 배양한 경우는 당을 첨가하지 않은 대조구와 거의 차이가 없었으며, 따라서 MF를 생성하는데 있어 당의 단독 첨가는 크게 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.

또한, 여러 가지 당을 첨가한 기본 배지에서 버섯 균사체가 생육하는 동안의 pH 변화를 관찰한 결과를 나타낸 표 6에서 보면, 버섯 균사체 배양 전·후 pH에는 큰 변화가 없었으나, 버섯 균사체를 배양한 후가 배양 전보다 pH가 0.1∼0.2 정도 높아졌으며, 특히 PO를 배양한 배지는 다른 균사체가 배양된 배지보다 pH가 0.5 이상 높아진 것을 볼 수 있다.

③ 아미노산(Cys, Gln, Met) 1 %와 당(Fru, Gal, Rib, Xyl) 2 %를 기본 배지 (250 ㎖)에 첨가하여 PO를 배양(25 ℃, 120 rpm, 7 일)한 배양액을 가열하여 관능검사한 결과를 보면, Cys과 Fru, Gal, Xyl를 첨가한 배양액에서는 유황의 자극성 냄새가 났고, Cys과 Rib를 첨가한 배양액에서는 강한 고기향이 났으며, Gln과 Fru, Gal, Xyl를 첨가한 배양액은 무향이었다. Gln과 Rib를 첨가한 배양액에서는 달콤한 향이 났고, Met와 Fru, Gal를 첨가한 배양액에서는 곰팡이 냄새, Met과 Rib를 첨가한 배양액에서는 달콤한 향, Met과 Xyl를 첨가한 배양액에서는 흙 냄새가 났다. 이러한 결과를 다음 표 8에 나타내었다.

아미노산	당	냄새 특성
		고기향	달콤함	흙냄새	곰팡내	유황자극성	탄설탕냄새
Cys	FruGalRibXyl	+++++	++		++ +	++++++ +++
Gln	FruGalRibXyl		++++++		++++		+
Met	FruGalRibXyl		+++	+++	++++++		+

이상의 결과로 볼 때, Cys과 Rib를 첨가한 기본 배지에 PO를 배양할 경우 강한 MF가 생성됨을 알 수 있다.

한편, 여러 가지 아미노산과 당을 혼합 첨가한 기본 배지에서 버섯 균사체가 생육하는 동안의 pH 변화를 관찰한 결과를 다음 표 9에 나타낸다. 여기에서 보면, pH는 배양 전·후 큰 변화는 없었으나, Gln이 첨가된 배양액에서 0.3∼0.5 정도 높아졌다.

아미노산	당	PO		AZ		LE
		배양전 pH	배양후 pH	배양전 pH	배양후 pH	배양전 pH	배양후 pH
Cys	FruGalRibXyl	5.605.535.555.37	5.735.745.615.66	5.575.545.535.40	5.655.525.465.59	5.555.525.435.43	5.435.425.295.29
Gln	FruGalRibXyl	5.625.555.555.39	6.146.156.036.07	5.65.555.565.43	5.485.415.465.48	5.575.545.505.45	5.615.65.565.46
Met	FruGalRibXyl	5.635.565.565.40	5.705.585.675.63	5.585.555.545.41	5.605.535.595.60	5.575.545.565.45	5.535.405.495.39

다음에, 아미노산(Cys, Gln, Met) 1 %와 당(Fru, Gal, Rib, Xyl) 2 %를 기본 배지(250 ㎖)에 첨가하여 AZ를 배양(25 ℃, 120 rpm, 7 일)한 배양액을 가열하여 관능검사한 결과를 보면, Cys과 Fru, Gal, Xyl를 첨가한 배양액에서는 유황의 자극성 냄새가 났고, Cys과 Rib를 첨가한 배양액은 무향이었다. Gln과 Fru를 첨가한 배양액에서는 흙냄새, Gln과 Gal를 첨가한 배양액에서는 곰팡이 냄새가 났고, Gln과 Rib, Xyl를 첨가한 배양액에서는 달콤한 향이 났다. Met과 Fru, Rib, Xyl를 첨가한 배양액에서는 곰팡이 냄새가 강하게 났고, Met과 Gal를 첨가한 배양액은 무향이었다. 이러한 결과를 다음 표 10에 나타내었다.

아미노산	당	냄새 특성
		고기향	달콤함	흙냄새	곰팡내	유황자극성	탄설탕냄새
Cys	FruGalRibXyl		++		++	++++++ +++	+
Gln	FruGalRibXyl		++++++	+++++	+++++++		+
Met	FruGalRibXyl		+	++++	++++++++++

이상의 결과로 볼 때, 아미노산과 당을 첨가한 기본 배지에 AZ를 배양한 배양액은 향의 특성에 있어서 대조구와 거의 차이가 없었다. 따라서, AZ은 MF를 생성하기에 적합하지 않은 품종으로 판단되었다.

한편, 위 표 9에서 보듯이, pH는 배양 전·후 큰 변화가 없었다.

다음에, 아미노산(Cys, Gln, Met) 1 %와 당(Fru, Gal, Rib, Xyl) 2 %를 기본 배지(250 ㎖)에 첨가하여 LE를 배양(25 ℃, 120 rpm, 7 일)한 배양액을 가열하여 관능검사한 결과를 보면, Cys과 Fru, Gal, Xyl를 첨가한 배양액에서는 유황의 자극성 냄새가 났고, Cys과 Rib를 첨가한 배양액은 무향이었다. Gln과 Rib, Xyl를 첨가한 배양액에서는 달콤한 향이 났고, Gln과 Fru를 첨가한 배양액은 무향이었으며, Gln과 Gal를 첨가한 배양액에서는 곰팡이 냄새가 났다. Met과 Rib, Xyl를 첨가한 배양액에서는 흙 냄새가 났고, Met과 Fru를 첨가한 배양액에서는 곰팡이 냄새가 났으며, Met과 Gal를 첨가한 배양액은 무향이었다. 이러한 결과를 다음 표 11에 나타낸다.

아미노산	당	냄새 특성
		고기향	달콤함	흙냄새	곰팡내	유황자극성	탄설탕냄새
Cys	FruGalRibXyl				+	++++++ +++
Gln	FruGalRibXyl		++++++	+	+++
Met	FruGalRibXyl		+	++++++	++++ +		+

이상의 결과로 볼 때, 아미노산과 당을 첨가한 기본 배지에 LE를 배양한 배양액은 향의 특성에 있어서 대조구와 거의 차이가 없었다. 따라서, LE 역시 MF를 생성하기에 적합하지 않은 품종으로 판단되었다.

한편, 위 표 9에서 보듯이, pH는 배양 전·후 큰 변화가 없었다.

실시예 3: 육고기향(MF) 생성 배양 조건

위 실험의 결과로부터 Cys과 Rib를 첨가한 기본 배지에 PO를 배양할 경우 강한 MF가 생성됨을 알 수 있었다. 이에 따라, PO 배양에 있어서 배지에 Cys과 Rib를 첨가하는 것이 MF 생성에 영향을 미치는 효과를 연구하기 위해, ① 기본 배지, ② Cys 1 %와 Rib 2 %가 첨가된 기본 배지, 및 ③ 기본 배지에 PO를 배양, ④ Cys 1 %와 Rib 2 %가 첨가된 기본 배지에 PO를 배양, 그리고 ⑤ 기본 배지에 PO를 배양하고 난 후 Cys 1 %와 Rib 2 %를 첨가하는 실험을 실시하였다.

각 처리구의 배양은 위 실시예 1에서와 같은 방법으로 배양하였다. 배양액을 여과지(Whatman No. 2)로 진공 여과하여 가열하지 않은 것과 가열한 것을 관능검사하고, 가열 처리된 배양액을 에테르로 추출하여 GC-MS로 분석하였다.

① 관능검사

제조된 향의 특성을 알기 위해 미리 훈련된 7∼10 명의 패널리스트가 향의 특징을 관능검사하였다.

먼저, 기본 배지를 가열한 액으로부터는 달콤한 향이 약하게 감지되었고, 기본 배지에 PO를 배양한 배양액으로부터는 흙 냄새가 났지만, 배양액을 가열하였더니 달콤한 향으로 변하였다. Cys과 Rib를 첨가한 기본 배지를 가열 또는 가열하지 않은 액으로부터는 유황의 자극적인 특징을 가진 향이 감지되었다. Cys과 Rib를 첨가한 기본 배지에 PO를 배양하여 배양액을 관능검사한 결과, 유황의 자극성 특징을 가진 향이 감지되는데, 배양액을 가열하였더니 강한 MF가 생성되었다. 기본 배지에 PO를 배양한 배양액에 Cys과 Rib를 첨가하여 가열한 액으로부터는 유황의 자극적인 특징을 가진 향이 감지되었다. 이상의 결과를 다음 표 12에 나타낸다.

처리		냄새 특성
		고기향	달콤함	흙냄새	곰팡내	유황자극성	탄설탕냄새
가열	기본 배지(1) Cys+Rib(2) PO(3) Cys+Rib+PO(4) PO+Cys+Rib(5)	+++++	+ +++			+++ ++++	+ ++
가열안함	기본 배지 Cys+Rib PO PO+Cys+Rib		++	+++	+	+++++ +++

(1) 증류수에 대두박, 황백당, KH₂PO₄ 및 MgSO₄·7H₂O를 포함한 멸균 배지.

(2) Cys(1 %)와 Rib(2 %)가 첨가된 기본 배지.

(3) 기본 배지에 PO를 배양.

(4) Cys(1 %)와 Rib(2 %)가 첨가된 기본 배지에 PO를 배양.

(5) 기본 배지에 PO를 배양하고 난 후 Cys(1 %)와 Rib(2 %)를 첨가.

이상의 결과로 볼 때, Cys과 Rib가 첨가된 기본 배지에 PO를 배양한 다음, 배양액을 가열하면 MF가 생성된다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 MF 생성을 위해서는 PO, Cys, Rib, 가열의 네 가지 조건이 필수임을 알 수 있다.

② 휘발성 향기 성분

휘발성 향기 성분을 분석하기 위해 다음과 같은 전처리를 행하였다: 시료 50 ㎖(전체 용량의 20 %)를 에테르 20 ㎖로 2 분간 추출하여 실온에서 5 분간 방치한 다음, 에테르층과 물층이 분리되면 물층을 제거하고 에테르층에 Na₂SO₄를 일정량 첨가하여 탈수시켰다. 에테르층에 추출된 향기 성분을 N₂ 가스 하에서 농축 튜브에 농축하고 GC를 이용하여 다음 표 13의 조건에서 분석하였다. GC-MS는 GC와 동일한 조건으로 분석하였으며 운반 가스는 헬륨(2 ㎖/분)을 사용하였고, 이온화전압은 70 eV, 이온원 온도는 250 ℃였다. GC-MS에 의해 분석된 향기 화합물은 WILEG D6 & NIST의 데이터베이스를 이용하여 동정하였다.

항목	휴렛패커드 5890 조건
오븐 온도	50∼200 ℃ (4 ℃/분)
초기 온도	50 ℃
최종 온도	200 ℃
주입기 온도	260 ℃
검출기 온도	260 ℃
컬럼	캐필러리 컬럼 (Supelcowax-10: 60 m×0.32 ㎜, i.d)
검출기	FID
운반 가스	N2 (유속: 2 ㎖/분)

도 2는 기본 배지로부터 분리된 휘발성 향기 성분의 GC 크로마토그램으로, 피크 1은 1-테트라데센, 2는 2-푸란카복스알데히드, 3은 푸르푸릴알콜, 그리고 4는 3-(1-에톡시에톡시)-부탄올을 나타낸다.

도 3은 Cys(1 %)과 Rib(2 %)를 포함하는 기본 배지로부터 분리된 휘발성 향기 성분의 GC 크로마토그램으로, 피크 1은 1-테트라데센, 2는 2-푸란-카복스알데히드, 3은 푸르푸릴알콜, 4는 3-(1-에톡시에톡시)-부탄올, 5는 1,2-벤즈이소티아졸-3-(2H), 6은 티오노[2,3,C]피리딘, 7은 1H-4-메틸-2,3,4,5-테트라-하이드로벤즈[c] 아제핀-1-온을 나타낸다.

도 4는 기본 배지에 PO를 배양한 배양액으로부터 분리된 휘발성 향기 성분의 GC 크로마토그램으로, 피크 1은 1-테트라데센, 2는 2-푸란카복스알데히드, 3은 푸르푸릴알콜, 4는 1-[13C]-페닐아세트아미드, 5는 2,6-디(t-부틸)-4-하이드록시-4-메틸-2,5-사이클로헥사디엔-1-온을 나타낸다.

도 5는 Cys(1 %)과 Rib(2 %)를 첨가한 기본 배지에 PO를 배양한 배양액으로부터 분리된 휘발성 향기 성분의 GC 크로마토그램으로, 피크 1은 1-테트라데센, 2는 2-푸란카복스알데히드, 3은 푸르푸릴알콜, 4는 2-포르밀-5-메틸티오펜, 5는 3-(1-에톡시에톡시)-부탄올, 6은 디메틸포르밀티오펜, 7은 1,2-벤즈이소티아졸-3-(2H), 8은 2,6-디(t-부틸)-4-하이드록시-4-메틸-2,5-사이클로헥사디엔-1-온, 9는 티오노[2,3,C]피리딘, 10은 포름아닐리드, 11은 1H-4-메틸-2,3,4,5-테트라하이드로벤즈[c]아제핀을 나타낸다.

도 6은 기본 배지에 PO를 배양한 다음 Cys(1 %)과 Rib(1 %)를 첨가하여 가열한 배양액으로부터 분리된 휘발성 향기 성분의 GC 크로마토그램으로, 피크 1은 1-테트라데센, 2는 2-푸란카복스알데히드, 3은 푸르푸릴알콜, 4는 1-[13C]-페닐아세트아미드, 5는 디메틸포르밀티오펜, 6은 1,2-벤즈이소티아졸-3-(2H), 7은 2,6-디(t-부틸)-4-하이드록시-4-메틸-2,5-사이클로헥사디엔-1-온, 8은 티오노 [2,3,C]피리딘, 9는 1H-4-메틸-2,3,4,5-테트라하이드로벤즈[c]아제핀을 나타낸다.

이상의 결과로부터, 1-테트라데센과 2-푸란카복스알데히드는 모든 시료에서 생성되었고 특히 Cys과 Rib를 첨가한 시료에 높은 농도로 존재하였다. 푸르푸릴알콜은 Rib를 첨가한 기본 배지에 PO를 배양하였을 때 많이 생성되었다. Cys과 Rib를 첨가한 기본 배지에 PO를 배양하면 2-포르밀-5-메틸티오펜, 디메틸포르밀티오펜이 생성되었는데, 이들은 쇠고기를 가열할 때 생성되는 티오펜류의 화합물로 MF 생성에 매우 중요한 역할을 하는 향기 성분으로 생각된다. 다음 표 14는 GC-MS에 의하여 확인된 여러 배지의 휘발성 향기 성분을 나타낸 것이다.

RRT	화합물	처리
		(1)	(2)	(3)	(4)	(5)
0.7270.756I.S.1.1831.1931.2431.2981.3811.417 1.5011.5181.592	1-테트라데센 2-푸란카복스알데히드 푸르푸릴알콜 2-포르밀-5-메틸티오펜 3-(1-에톡시에톡시)-부탄올 1-[13C]-페닐아세트아미드 디메틸포르밀티오펜 1,2-벤즈이소티아졸-3(2H)-온 2,6-디(t-부틸)-하이드록시-4-메틸-2,5-사이클로헥사디엔-1-온 티오노[2,3,C]피리딘 포름아닐리드 1H-4-메틸-2,3,4,5-테트라하이드로벤즈[c]아제피노-1-온	0.1870.126trNDtrNDNDNDND NDNDND	1.1821.988trND0.191NDND0.6830.214 0.628ND0.473	0.1350.0830.076NDND1.075NDND4.886 NDNDND	2.7197.27812.8020.1750.2150.0890.2178.0260.484 0.7100.5300.790	0.7160.8050.042NDND1.040tr0.3863.089 0.139ND0.196

위 표 14에서 (1)∼(5)는 표 12에서 설명한 처리 방식과 동일하다. 또한, 각 수치들은 GC 크로마토그램 상에 나타난 에테르 추출물중 전체 휘발성 물질의 면적 (%)를 의미한다. I.S.는 RRT의 계산을 위한 내부표준물질(internal standard)로, 모든 샘플에 존재하는 푸르푸릴알콜이고, tr은 미량(trace), ND는 검출되지 않은 것(not detected)을 의미한다.

이들 화합물의 MS 스펙트럼은 도 7 및 8에서 보는 바와 같이 데이터베이스의 MS 스펙트럼과 거의 동일하였다. 도 7은 2-포르밀-5-메틸티오펜의 MS 스펙트럼이고, 도 8은 디메틸포르밀티오펜의 MS 스펙트럼이다.

③ 지방산

시료 50 g(전체 용량의 20 %)을 취하여 헥산:이소프로필알콜(3:2, v/v) 추출용매 50 ㎖와 내부표준액 1 ㎎을 넣고 2 분간 강하게 흔들어 추출한 후 원심 분리 (4,000 rpm, 10 분)하였다. 이 과정을 2 회 반복한 후, 헥산층을 물로 3 회 세척하고 Na₂SO₄로 수분을 제거한 다음 농축하여 유리지방산을 얻었다. 추출된 지방에 1 N-H₂SO₄/MeOH 3 ㎖을 넣고 메틸레이션(100 ℃, 5 분)하고 GC에 주입하여 분석하였다. 이때, 분석 조건은 다음 표 15와 같다.

항목	휴렛패커드 5890 조건
오븐 온도	160∼200 ℃ (2 ℃/분)
초기 온도	160 ℃
최종 온도	200 ℃
주입기 온도	260 ℃
검출기 온도	260 ℃
컬럼	캐필러리 컬럼 (Supelcowax-10: 60 m×0.32 ㎜, i.d)
검출기	FID
운반 가스	N2 (유속: 2 ㎖/분)

다음 표 16은 표 12에서와 동일한 시료의 지방산 조성을 나타낸 것이다. C13:0, C14:0, C15:0, C16:0, C18:0, C20:0, C20:1, C21:0는 모든 시료에 비슷한 ppm 농도로 함유되어 있다. C15:0는 기본 배지와 Cys과 Rib가 첨가된 기본 배지에 1.4 ppm 이상 함유되어 있었고, C16:1은 Cys과 Rib가 첨가된 액에서 2 ppm 이상 함유되어 있었다. 또한, C18:1은 기본 배지에 PO를 배양한 액에 4.61 ppm, 기본 배지에 Cys과 Rib가 첨가된 배지에는 2 ppm 이상 함유되어 있었다. γ-LN은 Cys과 Rib를 첨가한 기본 배지에 6.27 ppm, 기본 배지에 Cys과 Rib를 첨가하여 PO를 배양한 배양액에 4.02 ppm 함유되어 있었다.

지방산	유리지방산 함량(ppm)
	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)
C13:0C14:0C15:0C15:1C16:0C16:1C18:0C18:1γ-LNC20:0C20:1C21:0	0.080.111.400.080.170.960.310.651.890.180.060.24	0.090.081.470.070.112.120.661.986.270.540.060.24	0.070.260.110.010.151.470.564.610.520.430.270.29	0.050.180.040.070.092.180.762.774.020.390.030.24	0.070.310.090.110.191.880.652.261.960.160.140.29

위 표 16에서 (1)∼(5)는 표 12에서 설명한 처리 방식과 동일하다. 유리지방산 함량(ppm)은 샘플 면적/내부표준면적×샘플 중량(50 g)×10⁶으로, 내부표준물질은 헵타데카노산(1 ㎎)이다.

④ 유리당

시료 10 g을 25 ㎖의 메스플라스크에 취하여 99.5 % EtOH 5 ㎖과 80 % EtOH 5 ㎖를 가해서 혼합한 후 20 ℃의 항온 상태에서 80 % EtOH로 보정하였다. 보정액 3 ㎖을 셉팩(Sep pak C₁₈)으로 1 차 필터링하여 색소와 고분자물질을 제거하고 멤브레인 필터(0.2 ㎛)로 2 차 필터링한 후 HPLC에 주입하여 다음 표 17의 조건으로 분석하였다. 표준 물질로는 아라비노오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 글루코오스, 락토오스, 말토오스, 만노오스, 리보오스, 슈크로오스, 자일로오스를 혼합한 후 사용하였다.

항목	시마주LC-10A 조건
컬럼	Supelcogel Ca(7.8 ㎜ I.D×300 ㎜)
컬럼 온도	80 ℃
이동상	탈이온수
검출기	RID-10A
유속	0.5 ㎖/분

다음 표 18은 표 12에서와 동일한 시료의 유리당 조성을 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, Fru는 기본 배지에 9.73 ppm, PO 배양액에 2.09 ppm, Cys과 Rib가 첨가된 시료에 20 ppm이상 함유되어 있었다. Gal와 Mal는 모든 시료에 비슷한 ppm농도로 함유되어 있었으며, Glu는 기본 배지에 10.31 ppm, PO 배양액에 0.94 ppm, Cys과 Rib가 첨가된 시료에 24 ppm이상 함유되어 있었다. Rib는 리보오스가 첨가된 시료에서만 10 ppm 이상 함유되어 있었고, Suc는 기본 배지와 PO 배양액에서 100 ppm, Cys과 Rib가 첨가된 시료에 30 ppm 이상 함유되어 있었다.

유리당	유리당 함량(ppm)
	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)
FruGalGluMalRibSuc	9.730.7410.310.91ND108.13	32.951.5933.790.1910.6538.58	2.090.800.941.11ND112.76	29.541.2030.322.1410.2338.42	23.681.0824.161.1610.2151.99

위 표 18에서 (1)∼(5)는 표 12에서 설명한 처리 방식과 동일하다. 유리당 함량(ppm)은 (샘플 면적×표준품 100 ppm)/표준면적이다. 또한, ND는 검출 안된 것(not detected)을 의미한다.

⑤ 유기산

시료 5 g을 증류수로 5 배 희석하여 셉팩(Sep pak C₁₈)으로 1차 필터링하여 색소와 고분자물질을 제거하고 멤브레인 필터(0.2 ㎛)로 2 차 필터링한 후 HPLC에 주입하여 다음 표 19의 조건으로 분석하였다. 표준물질로는 아세트산, 아디프산, 아스코르브산, 벤조산, 부티르산, 시트르산, 포름산, 푸마르산, 이소부티르산, 이소시트르산, 락트산, 말레산, 말산, 말론산, 옥살산, 프로피온산, 피로글루탐산, 숙신산을 혼합한 후 사용하였다.

항목	시마주LC-10A 조건
컬럼	Supelcogel C-610H(7.8 ㎜ I.D×300 ㎜) (Hydrogen-form resin)
컬럼 온도	30 ℃
이동상	0.1 % 인산
검출기	SPD-10A, 210 ㎚
유속	0.5 ㎖/분
주입량	20 ㎕

다음 표 20은 표 12에서와 동일한 시료의 유기산 조성을 나타낸 것이다. 여기에서 보면, 아스코르브산은 기본 배지에 1.92 ppm, PO 배양액에 2.69 ppm 함유되어 있고, 벤조산, 시트르산, 이소부티르산, 락트산, 말레산, 말산은 모든 시료에 함유되어 있었다. 포름산은 Cys과 Rib가 첨가된 기본 배지에 PO를 배양한 배양액에 27.13 ppm, PO를 배양한 후 배양액에 Cys과 Rib를 첨가하여 가열한 액에 19.89 ppm 함유되어 있었다. 푸마르산은 기본 배지에 0.41 ppm, Cys과 Rib가 첨가된 기본 배지에 0.65 ppm 함유되어 있고, 말론산은 기본 배지와 PO 배양액을 제외한 시료에 9 ppm 이상 함유되어 있었다. 옥살산은 Cys과 Rib가 첨가된 기본 배지에 PO를 배양한 배양액을 제외한 모든 시료에 함유되어 있었는데, 특히 PO를 배양한 배양액에 Cys과 Rib를 첨가한 시료에서 38.68 ppm으로 높은 농도로 함유되어 있었다.

유기산	유기산 함량(ppm)
	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)
아스코르브산벤조산시트르산포름산푸마르산이소부티르산락트산말레산말산말론산옥살산	1.928.452.27ND0.412.446.340.0912.40ND3.80	ND6.255.10NDND0.2138.130.65173.749.029.22	2.6910.542.58ND0.652.042.810.7942.59ND19.80	ND11.264.2727.13ND0.6882.550.66291.3813.90ND	ND6.897.6519.89ND2.5435.282.16251.2313.4438.68

위 표 18에서 (1)∼(5)는 표 12에서 설명한 처리 방식과 동일하다. 유기산 함량(ppm)은 (샘플 면적×표준품 100 ppm)/표준 면적이다. 또한, ND는 검출 안된 것(not detected)을 의미한다.

⑥ 유리 아미노산

시료의 단백질을 제거하기 위해 원뿔형 원심분리관에 설포살리실산 50 ㎎을 넣고 4 ℃로 냉각하였다(1 시간). 이렇게 준비된 튜브에 시료 1 ㎖을 첨가한 후 4 ℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 4 ℃에서 상등액이 완전히 맑게 변할 때까지 침전물을 원심분리(14,000 rpm, 15 분)하였다. 상등액 일정량을 취해서 0.3 M 수산화리튬을 이용하여 pH를 2.2로 맞추었다. 이때 첨가하는 0.3 M 수산화리튬의 양은 시료 20 ㎕에 대하여 10∼20 ㎕ 정도가 적당하였다. 또한 pH의 측정시 시료의 양이 너무 작아 pH 미터나 pH 검사지를 이용할 수 없어, 시료 20 ㎕에 대하여 0.3 M 수산화리튬을 15 ㎕ 정도 첨가하여 적당한 pH로 맞추었다. pH가 보정된 시료를 0.2 ㎛ 멤브레인 필터링하여 아미노산 분석기에서 다음 표 21의 조건으로 분석하였다.

항목	Hisashia Hirano 조건
컬럼	Ultrapac 11 양이온 교환 수지(6 ㎜×200 ㎜)
완충액 속도	45 ㎖/시간
닌히드린 속도	35 ㎖/시간
컬럼 온도	50∼80 ℃
완충액 단계	4 단계
반응조 온도	130 ℃
완충액 pH 범위	3.2∼10.0
주입량	40 ㎕

다음 표 22는 표 12에서와 동일한 시료의 유리아미노산 조성을 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 포스포세린, 하이드록시프롤린, 트레오닌, 세린, 아스파라긴, 글리신, 알라닌, 시트룰린, 발린, 메티오닌, 이소류신, 류신, 타이로신, 페닐알라닌, δ-아미노부티르산, 오르니틴, 리진, 아르기닌은 모든 시료에 함유되어 있었다. 글루탐산은 기본 배지에 2.1 ㎍/g과 PO 배양액에 1.5 ㎍/g이 함유되어 있고, 시스틴은 Cys이 첨가된 시료에 45.5 ㎍/g, 54.7 ㎍/g 및 41.0 ㎍/g의 양으로 함유되어 있었다.

아미노산	아미노산 함량(㎍/g)
	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)
포스포세린하이드록시프롤린트레오닌세린아스파라긴글루탐산글리신알라닌시트룰린발린시스틴메티오닌이소류신류신타이로신페닐알라닌δ-아미노이소부티르산오르니틴리진아르기닌	4.47.20.51.82.42.10.41.31.91.0ND1.20.33.75.02.53.52.52.63.1	15.392.71.02.111.5ND0.61.71.21.645.52.21.54.85.13.60.90.53.34.6	4.83.60.90.53.31.54.40.62.02.8ND1.53.05.82.21.54.85.12.82.9	14.855.72.53.83.4ND1.54.40.62.054.72.52.88.86.24.21.20.94.55.3	15.56.12.01.73.8ND0.91.7ND2.541.00.63.22.05.33.42.30.81.51.7

위 표 22에서 (1)∼(5)는 표 12에서 설명한 처리 방식과 동일하다. 아미노산 함량(㎍/g)은 면적×10×M.W.×희석배수/1,000,000이다. 또한, ND는 검출 안된 것(not detected)을 의미한다.

이상 실시예의 시험 결과에 따라, 버섯 균사체의 최적 배양 조건과 PO의 액체 배양으로부터 생성된 MF의 특성은 다음과 같다:

① 느타리버섯, 신령버섯, 표고버섯 균사체의 액체 배양 조건을 조사한 결과, 세 품종 모두 pH 5.5인 기본 배지에 버섯 액체 균사체를 접종하여 25 ℃, 120 rpm, 7 일 배양하는 것이 최적 조건으로 밝혀졌다.

② 이와 같은 최적 배양 조건에서 배지 조성을 달리하여 MF 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 기본 배지에 Cys(1 %)와 Rib(2 %)를 첨가하여 느타리버섯을 배양한 배양액을 121 ℃에서 15 분간 가열한 경우, 액상으로부터 특이하면서도 강하고, 천연 MF와 매우 유사한 MF가 생성되었다.

③ MF가 생성된 시료를 에테르로 추출하여 GC-MS로 분석·동정한 결과, 쇠고기를 가열할 때 생성되는 티오펜 화합물로서 MF 생성에 중요한 역할을 하는 향기 성분인 2-포르밀-5-메틸티오펜과 디메틸포르밀-티오펜이 생성되었음을 확인하였다.

④ 기본 배지에 Cys과 Rib를 첨가하여 PO를 배양한 배지에는 다른 배양체에는 없거나 소량으로 발견되는 2-푸란카복스알데히드와 푸르푸릴알콜의 함량이 현저히 높은 것으로 나타났는데, 이들 화합물이 2-포르밀-5-메틸티오펜과 디메틸포르밀티오펜의 주요 전구물질로 추정된다.

본 발명에 따르면, 느타리버섯을 이용하여 천연의 우수한 향을 지닌 육고기향을 제조할 수 있으며, 천연 육고기향을 대량 생산할 수 있는 산업화 공정개발이 가능하도록 기반을 제공하는데 활용할 수 있다.

도 1은 각 버섯 균사체의 배양 기간 동안 배양액의 pH 변화를 나타낸 그래프,

도 2는 기본 배지로부터 분리된 휘발성 향기 성분의 GC 크로마토그램,

도 3은 Cys(1 %)와 Rib(2 %)를 포함하는 기본 배지로부터 분리된 휘발성 향기 성분의 GC 크로마토그램,

도 4는 기본 배지에 PO를 배양한 배양액으로부터 분리된 휘발성 향기 성분의 GC 크로마토그램,

도 5는 Cys(1 %)과 Rib(2 %)를 첨가한 기본 배지에 PO를 배양한 배양액으로부터 분리된 휘발성 향기 성분의 GC 크로마토그램,

도 6은 기본 배지에 PO를 배양한 다음 Cys(1 %)과 Rib(1 %)를 첨가하여 가열한 배양액으로부터 분리된 휘발성 향기 성분의 GC 크로마토그램,

도 7은 2-포르밀-5-메틸티오펜의 MS 스펙트럼,

도 8은 디메틸포르밀티오펜의 MS 스펙트럼.

Claims (7)

1. 시스테인(cysteine)과 리보오스(ribose)를 포함하는 액체 배지에 느타리버섯 (Pleuotus ostreatus) 균사체를 접종하여 배양하여 육고기향의 전구물질인 2-푸란카복스알데히드 및 푸르푸릴알콜을 생산하고, 상기 육고기향의 전구물질이 생산된 배양액을 가열하여 육고기향 성분인 2-포르밀-5-메틸티오펜과 디메틸포르밀-티오펜을 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 육고기향의 생산 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 액체 배지는 대두박 10 %(w/v), 황백당 2.7 %(w/v), KH₂PO₄ 0.5 %(w/v) 및 MgSO₄·7H₂O 0.5 %(w/v)를 증류수에 녹여서 멸균한 것임을 특징으로 하는 육고기향의 생산 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 시스테인과 리보오스는 배지에 각각 1 %와 2 %의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 육고기향의 생산 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 느타리버섯 균사체의 배양은 액체 배지의 pH를 5.5로 하고 25 ℃에서 120 rpm의 진탕 속도로 7 일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 육고기향의 생산 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 배양액은 121 ℃에서 15 분간 가열하는 것을 특징으로 하는 육고기향의 생산 방법.
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