CN102851228B - 一种食甲醇芽孢杆菌及其烟用酸枣仁浸膏的制备方法和应用 - Google Patents
一种食甲醇芽孢杆菌及其烟用酸枣仁浸膏的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，保藏编号CCTCC NO：M 2012004。本发明提供利用微生物食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用酸枣仁浸膏以及烟用酸枣仁浸膏在烟草中的应用。本发明酸枣仁经微生物菌株发酵能生产天然香料-烟用酸枣仁浸膏，方法工艺简单，原料来源广泛，生产过程环保无害，有工业化使用前景；所得天然香料浸膏能直接用于卷烟的加香，具有烟气协调、增加奶油甜香、花香、柔和舒适、改善吸味的优点，能与其它烟用香精香料混合调配使用。
Description
技术领域
本发明涉及烟用香料技术领域，具体是指一种食甲醇芽孢杆菌及其烟用酸枣仁浸膏的制备方法和应用。
背景技术
在烟草制品中，烟草的香气和吸味至关重要，添加香料是卷烟工艺中的关键环节，也是完善产品风格和提高卷烟香气质量的有效手段。烟用香料有化学合成香料和天然香料之分。近年来，天然植物香料，因其具有中国特色，天然无害，原料易得等原因，成分研发重点和热点。将微生物发酵工程应用于香精香料的生物合成中，以中草药植物为原料，利用微生物可以生产各种天然香料，是一种很好的获取天然香料的解决途径。
酸枣仁（Spina Date Seed），别名枣仁、山枣，鼠李科植物酸枣的成熟种子。始载于《神农本草经》，列为上品，养肝，宁心，安神，敛汗。酸枣仁含生物碱、三萜类、黄酮类、17种氨基酸等，又含阿魏酸，维生素C及植物甾醇，环磷酸腺苷等。但是酸枣仁提取物用于卷烟，则会产生刺激性大、杂气多的重大缺陷，难以调配烟用。
微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以酸枣仁为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。
目前化学合成烟用浸膏提取步骤复杂，环境污染严重，烟用浸膏的香气味道单一且香气强度尚显不足。酸枣仁发酵物浸膏进行烟用还未见公开报道。
发明内容
针对目前化学合成烟用浸膏提取步骤复杂，环境污染严重，烟用浸膏的香气味道单一且香气强度尚显不足的缺陷，本发明提供了一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2012004，其生物学特征是：是革兰氏阳性菌，能在10%NaCl中生长，有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶活性，能产酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸盐、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸组氨酸、柠檬酸盐为碳源的培养基上生长，其16S rRNA序列与Bacillusmethylotrophicus的16S rRNA序列比对相似性达到100%。
本发明提供一种利用食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC NO：M 2012004生物转化烟用酸枣仁浸膏的制备方法，包括以下步骤：
1）将酸枣仁和水按质量比1∶20~40回流提取1~3小时后过滤，将滤液灭菌；
2）斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25~35℃、pH5~10条件下，静置培养24~72小时后置于冰箱中；
3）制备种子培养液：用上述步骤2）中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25~35℃，转速100~150rpm条件下振荡培养12~36h，连续转接1~4次后制得种子培养液；
4）发酵：将种子培养液按体积比5~20%接种到上述步骤1）中的酸枣仁滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为20~40%，在pH4~10，温度25~40℃，转速100~200rpm，不避光条件下发酵7~14天；
5）将步骤4）中所得的发酵液和95%乙醇按体积比1∶3~4，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.20~1.36的烟用酸枣仁浸膏。
优先地，所述斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。
优先地，所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
本发明提供了一种所得烟用酸枣仁浸膏的应用，其特征在于：所述烟用酸枣仁浸膏加入卷烟中，用于协调烟气、增加奶油甜香、花香、使烟气柔和舒适、改善吸味，加入卷烟中烟用酸枣仁浸膏的质量比为0.01~0.05%。
采用GC/MS对利用食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC NO：M 2012004生物转化酸枣仁发酵型烟用浸膏与未利用食甲醇芽孢杆菌经历相同发酵步骤的酸枣仁提取液相同条件下浓缩制成的浸膏（以下简称为酸枣仁提取物浸膏）进行挥发性致香成分进行对比。
（1）同时蒸馏萃取
将5g酸枣仁发酵型烟用浸膏装入圆底烧瓶中，加入400mL水，用电热套加热至沸腾，另一侧的圆底烧瓶中加入200mL的二氯甲烷，60℃水浴沸腾，待中间分液管处液面出现分层后计时萃取2h。萃取结束后，向二氯甲烷萃取液中加入无水硫酸钠，过夜，过滤并浓缩至1mL，浓缩液用于进行GC/MS分析。酸枣仁提取物浸膏同样进行同时蒸馏萃取，其萃取浓缩液用于进行GC/MS分析。
（2）GC/MS分析：HP-5MS(50m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样温度：250℃；分流比20:1；载气：He，1mL/min；升温程序：从50℃（1min）以5℃/min升到250℃（5min）；传输线温度：250℃；离子源：EI源；电子能量：70eV；扫描范围：50~550amu；使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。
（3）挥发性成分对比分析
通过GC/MS对本发明的烟用酸枣仁浸膏进行香气成分分析，从表1中可以看出，一共鉴定出48种香气物质，其中酮类9种，酯类10种，还有烷烃、醛类、醇类、吡嗪、烯类、对乙烯基愈创木酚、柏木脑、芹子烯、脂肪酸和不饱和脂肪酸等29种香气物质。对比酸枣仁提取物浸膏，烟用酸枣仁浸膏的香气物质变化很大，新增加了有35种，消失了4种。新增加的香气物质包括最高含量的3-羟基-2-丁酮，具有令人愉快的奶油香，其相对百分含量有20.317%，为烟用酸枣仁浸膏的特征香气；己醛，具有强烈青香、水果香气、木香、蔬菜香气；2-甲基戊酸甲酯，具有甜的青香和果香，有浆果、菠萝蜜、苹果、香蕉、甜瓜、热带水果香气；苯乙醛，具有浓郁的玉簪花香气；四甲基吡嗪，稀释至20mg/kg时呈牛奶巧克力香气；2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪，具有坚果香、热带果香；对乙烯基愈创木酚，呈强烈香辛料、丁香和发酵似香气，有炒花生气息；柏木脑，具温和淡弱甜的木香气；棕榈酸乙酯，呈微弱蜡香、果爵和奶油香气；吡嗪类、亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸、油酸乙酯等可改善和提高烟香。所有这些香气糅合在一起赋予烟气协调、奶油甜香、花香、柔和舒适、改善吸味。
微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以酸枣仁为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吲哚类和吡嗪类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。
表1.烟用酸枣仁浸膏与对照-酸枣仁提取物浸膏的挥发性香气成分对比
备注：丙酸苯乙酯为内标，根据其在对照-酸枣仁提取物浸膏与烟用酸枣仁浸膏香气成分中相对百分含量比值为6.771∶3.844=1.761∶1，来比较两者香气物质相对百分含量的变化。
本发明的优点是：
1、本发明以酸枣仁为唯一碳源、氮源、以及底物，含生物碱、三萜类、黄酮类、17种氨基酸等，含阿魏酸，维生素C及植物甾醇，环磷酸腺苷等，比单一碳源更容易让微生物酶体系利用来发酵产香，来源广泛易得，具有天然环保无害优点。
2、采用食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC NO：M 2012004来发酵生产协调烟气、增加奶油甜香、花香、使烟气柔和舒适、改善吸味的烟用酸枣仁浸膏，能与其它烟用香精香料混合调配使用。
3、本发明方法工艺过程简单，原料来源广泛，有工业化使用前景。
具体实施方式
下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明利用微生物食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC NO：M 2012004生物转化烟用酸枣仁浸膏的制备方法如下：
1）将酸枣仁与水按质量比1∶20回流提取3小时后过滤，将滤液在115℃高温灭菌25分钟；
2）斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25℃、pH 10条件下，静置培养24h后置于冰箱中；
斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
3）制备种子培养液：用上述步骤2）中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25℃，转速150rpm条件下振荡培养12h，连续转接4次后制得种子培养液；
种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
4）发酵：将种子培养液按体积比5%接种到上述步骤1）中的灭菌的滤液，接种后的滤液的装罐量为40%，在pH 4，温度40℃，转速100rpm，不避光条件下发酵14天；
5）将步骤4）中所得的发酵液和95%乙醇按体积比1∶4，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.20的烟用酸枣仁浸膏。
实施例2
本发明本发明利用微生物食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicusVJ4-1CCTCC NO：M 2012004生物转化烟用酸枣仁浸膏的制备方法如下：
1）将酸枣仁与水按质量比1:30回流提取2小时后过滤，将滤液在115℃高温灭菌25分钟；
2）斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在30℃、pH 7条件下，静置培养36h后置于冰箱中；
斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
3）制备种子培养液：用上述步骤2）中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在30℃，转速120rpm条件下振荡培养24h，连续转接3次后制得种子培养液；
所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
4）发酵：将种子培养液按体积比10%接种到上述步骤1）中的灭菌的滤液，接种后的滤液的装罐量为30%，在pH 8，温度30℃，转速150rpm，不避光条件下发酵10天；
5）将步骤4）中所得的发酵液和95%乙醇按体积比1∶3，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.36的烟用酸枣仁浸膏。
实施例3
本发明利用微生物食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC NO：M 2012004生物转化烟用酸枣仁浸膏的制备方法如下：
1）将酸枣仁与水按质量比1:40回流提取1小时后过滤，将滤液在115℃高温灭菌25分钟；
2）斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在35℃、pH 5条件下，静置培养72h后置于冰箱中；
斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
3）制备种子培养液：用上述步骤2）中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在35℃，转速100rpm条件下振荡培养36h，连续转接2次后制得种子培养液；
所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L
4）发酵：将种子培养液按体积比20%接种到上述步骤1）中的灭菌的滤液，接种后的滤液的装罐量为40%，在pH10，温度25℃，转速200rpm，不避光条件下发酵7天；
5）将步骤4）中所得的发酵液和95%乙醇按体积比1∶3，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.30的烟用酸枣仁浸膏。
实施例4
发明人将上述烟用酸枣仁浸膏按烟丝量0.5%、0.1%、0.05%的比例、酸枣仁提取物浸膏按烟丝量比例0.01%，分别添加到烟丝中进行评吸，评吸按照国标GB 5606.4-1996进行。评吸结果如下表2所示。经专家评吸小组反复评吸，认为：本烟用酸枣仁浸膏，具有协调烟气、增加奶油甜香、花香、柔和舒适、改善吸味的优点，能与其它烟用香精香料混合调配使用，改善了酸枣仁提取物浸膏添加到卷烟中，杂气多、刺激性大的缺点。
表2.烟用酸枣仁浸膏在卷烟加料中的应用
Claims (4)
1.一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用酸枣仁浸膏的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将酸枣仁和水按质量比1∶20～40回流提取1～3小时后过滤，将滤液灭菌；
2）斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25～35℃、pH5～10条件下，静置培养24～72小时后，其中，所述食甲醇芽孢杆菌已于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2012004；
3）制备种子培养液：用上述步骤2）中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25～35℃，转速100～150rpm条件下振荡培养12～36h，连续转接1～4次后制得种子培养液；
4）发酵：将种子培养液按体积比5～20%接种到上述步骤1）中的酸枣仁滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为20～40%，在pH4～10，温度25～40℃，转速100～200rpm，不避光条件下发酵7～14天；
5）将步骤4）中所得的发酵液和95%乙醇按体积比1∶3～4，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.20～1.36的烟用酸枣仁浸膏。
2.根据权利要求1所述的一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用酸枣仁浸膏的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。
3.根据权利要求1所述的一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用酸枣仁浸膏的制备方法，其特征在于，所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
4.一种根据权利要求1所得烟用酸枣仁浸膏的应用，其特征在于：所述烟用酸枣仁浸膏加入卷烟中，用于协调烟气、增加奶油甜香、花香、使烟气柔和舒适、改善吸味，加入卷烟中烟用酸枣仁浸膏的质量比为0.01～0.05%。
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