JP6829461B2 - 緑葉粉末及び組成物 - Google Patents
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Description
しかしながら、従来の緑葉粉末やそれを含む組成物は、この要求に十分にこたえるものではなかった。
本実施形態の製造方法は、火山灰土にてイネ科植物を栽培し、該イネ科植物の緑葉を粉末化するものである。
火山灰土は結晶質又は非晶質のケイ酸が多く含まれており植物へのケイ素供給力が高い。またイネ科植物はケイ素吸収性の高い植物である。このため、本実施形態の製造方法によれば、上記のケイ素含有量を含有する緑葉粉末を得やすいものとなる。火山灰土は一般に10質量%以上、例えばSiO2換算で20〜50質量%程度のケイ素を含有することが知られている。
火山灰土としては、黒ボク土、多湿黒ボク土、黒ボクグライ土が知られているが、黒ボク土がイネ科植物の生育の点から特に好ましい。黒ボク土は、母材である火山灰土と腐植で構成された黒色の土である。表層は腐植が多いため色は黒色又は黒褐色、下層は褐色となる。火山山麓の台地や平地でよく見られる。
従って、本実施形態の組成物は、筋芽細胞賦活用途、筋肉細胞増殖促進用途、脂肪細胞分化抑制用途、筋肉組織賦活用途、筋肉細胞増殖促進用途、筋肉量増加用途、脂肪組織低減用途、代謝促進用途、肥満の防止用途、肥満の予防用途、ダイエット用途、体脂肪低減用途等において、優れたものとなりうる。
また、本実施形態の組成物は、前記特定量以上のケイ素を含む緑葉粉末を含有することで、美容の向上にも有用であるものである。
黒ボク土(推定でケイ素をSiO2換算で30質量%程度含有)の圃場に大麦の種を播種した。給水や雑草管理などの通常の植物栽培法により、大麦を栽培した。黒ボク土の土壌分析データの一例は表1のとおりである。
大麦から、出穂前における大麦の茎を含む緑葉を刈り取った。これを水洗いし、付着した泥などを除去し、5〜10cm程度の大きさに切断する前処理を行った。前処理した緑葉を、90〜100℃の熱湯で90秒間〜120秒間、1回のみブランチング処理し、その後、冷水で冷却した。続いて、得られた緑葉を、水分量が10質量%以下となるまで、乾燥機中で、20分間〜180分間、80℃〜130℃の温風にて乾燥させた。乾燥した緑葉を約1mmの大きさに粗粉砕処理した。得られた大麦の緑葉を、200メッシュ区分を90質量%以上が通過するように微粉砕処理し、大麦茎葉の乾燥粉末(粉砕末)試料を得た。緑葉の粉末試料は、200メッシュを通過するものが90質量%以上であり、水分量が1質量%以上7質量%以下であった。
各種クマザサ粉砕末を、ケイ素含有量に基づいてスクリーニングを行い、ケイ素含有量が34,900ppmのものを用いた。
各種大麦緑葉粉砕末を、ケイ素含有量に基づいてスクリーニングを行い、ケイ素含有量が5,650ppmのものを用いた。
市販の明日葉の粉砕末を用いた。
実施例1と同様にしてケールを栽培し、得られた茎を含む葉を実施例1と同様に処理することで、緑葉の乾燥粉末試料を得た。緑葉の粉末試料は、200メッシュを通過するものが90質量%以上であった。
得られた粉末のケイ素含有量はICP発光分析法(一般財団法人 日本食品分析センターにて測定)を用いて測定を行った。結果を表2に示す。
[筋細胞賦活試験]
(1)マウス骨格筋由来筋芽細胞(品名C2C12、理化学研究所バイオリソースセンター製)を37℃、5 %CO2インキュベーター内で、10vol%FBS-DMEM培地を入れた75cm2フラスコを用いて、培養した。
(2)(1)の培養後、トリプシン処理により浮遊させた細胞を75cm2フラスコから回収し、細胞数を計測した後、コラーゲンコートした96 well plateにおける各wellに、4000cells/wellの細胞密度にて培地ごと播種した後、37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間前培養した。
(3)(1)及び(2)とは別に、実施例1〜3並びに比較例1の粉末をそれぞれ、10容量%FBS-DMEM培地に500μg/ml濃度となるように分散又は溶解させた液を調製し、これを0.2μmフィルター(アドバンテック製)を用いてフィルター滅菌したものをサンプル液とした。コントロールとしては、10vol%FBS-DMEM培地そのものをサンプル液として用いた。
(4)各wellより培地を除去後、(3)で調製したサンプル液を各wellにそれぞれ200μLずつ添加し、37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間培養した。
(5)(4)の培養後、培地を除去した後、各wellをPBS 200μL/wellで1回洗浄した。次いで、無血清DMEMで30倍に希釈したCell Counting Kit−8溶液(同仁化学社) 150μL/wellを添加した。
(6)(5)の溶液添加後のplateを37℃、5%CO2インキュベーター内に静置して適度に発色させた後、各wellの450nmにおける吸光度を測定した。得られたデータを元に、コントロールに対する細胞数の割合(% of control)を下記式に基づいて算出し、これを筋芽細胞賦活活性とした。
% of control=(Data sample - Data blank)/(Data control - Data blank)×100
Data sample:実施例1〜3並びに比較例1の吸光度
Data control:controlの吸光度
Data blank:細胞がないときのブランク
コントロールを100%として、実施例1〜3並びに比較例1の細胞数の割合の算出結果をまとめたものを図1に示す。
(a)マウス骨格筋由来筋芽細胞(品名C2C12、理化学研究所バイオリソースセンター製)を37℃、5 %CO2インキュベーター内で、10vol%FBS-DMEM培地を入れた75cm2フラスコを用いて、培養した。
(b)(a)の培養後、トリプシン処理により浮遊させた細胞を75cm2フラスコから回収し、細胞数を計測した後、コラーゲンコートした24well plateにおける各wellに、2×104cells/wellの細胞密度にて培地ごと播種した後、37℃、5 %CO2インキュベーター内で、96時間前培養した。
(c)(a)及び(b)とは別に、実施例1〜3並びに比較例1及び2の粉末をそれぞれ、10vol%FBS-DMEM培地に、1000μg/ml濃度となるように分散又は溶解させた液を調製し、これを0.2μmフィルター(アドバンテック)を用いてフィルター滅菌したものをサンプル液とした。コントロールとしては、10vol%FBS-DMEM培地そのものをサンプル液とした。
(d)各wellより培地を除去後、(c)で調製したサンプル液を各wellにそれぞれ500μL添加し、37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間培養した。
(e)(d)の培養後、各wellをPBS 500μL/wellで2回洗浄した。次いでRNeasy Mini Kit 250(QIAGEN製)を用いてmRNAを回収した。得られたmRNAを鋳型とし、 ReverTra Ace(登録商標) qPCR RT Master Mixwith gDNA Remover(東洋紡製)を用いてcDNAを合成した。
(f)(e)で得られたcDNAを鋳型として、下記のプライマー(QIAGEN製)を用いて、QuantiNova SYBR Green PCR Kit(QIAGEN製)により定量リアルタイムPCRを行い、Gapdh及びMyogeninのmRNA発現量を測定した。
Gapdh:Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay (QT01658692)
Myog:Mm_Myog_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00112378)
[3T3-L1細胞における遺伝子発現による脂肪細胞の分化抑制試験]
(1)マウス繊維芽細胞3T3-L1(理化学研究所バイオリソースセンター)を10vol%FBS-DMEM培地を入れた75cm2フラスコを用いて、所定の数になるまで、5%CO2インキュベーター内で、37℃、湿潤条件で培養した。
(2)(1)のフラスコから培地を取り除き、DPBS(ナカライテスク社製)で3度洗浄した後、トリプシン処理により細胞を剥離した。
(3)新鮮な10vol%FBS-DMEM培地を加えてトリプシン反応を停止した後、細胞をチューブへ集め、遠心機で800rpm、3分遠心して細胞を沈殿させた。
(4)2×105 cells/mLになるように新鮮な10vol%FBS-DMEM培地に細胞を懸濁し、96 well plateに100μLずつ播種して、2日間、5%CO2インキュベーター内で、37℃、湿潤条件で前培養した。
(5)(1)〜(4)とは別に、IBMX(和光純薬社製)を0.5M、Dexamethasone(和光純薬社製)を1mMになるようにDMSOに溶解した。10vol%FBS−DMEM培地に前記で調製した0.5M IBMX及び1mM Dexamethasone並びに10mg/mL インスリン溶液(Sigma Aldrich社製)をそれぞれ終濃度が0.5mM、1μM、10μg/mLになるように添加して試験培地を調製した。実施例1〜3並びに比較例1及び2の粉末をそれぞれ、該試験培地に、10mg/mlとなるように分散又は溶解させた液を調製し、これを0.2μmフィルター(アドバンテック)を用いてフィルター滅菌したものをサンプル液とした。コントロールとしては、試験培地そのものをサンプル液とした。
(6)(4)で前培養した3T3-L1細胞から培地を除き、(5)で調製したサンプル液を各wellにそれぞれ100μLずつ添加し、1日間、5%CO2インキュベーター内で、37℃、湿潤条件で培養した。
(7)24時間後、各wellより培地を除き、細胞からRneasy mini(Qiagen社製)でRNAを精製した。
(8)精製したRNAより、ReverTra Ace(登録商標) qPCR RT Master Mix with gDNA Rem
over(東洋紡製)でcDNAを合成した。
(9)(8)で得られたcDNAを鋳型として、内部標準としてRps28(Mm_Rps28_1_SG QuantiTect Primer Assay、Qiagen社製)のプライマー、測定遺伝子としてCol1A1(Mm_Col1a1_1_SG QuantiTect primer assay、Qiagen社製)のプライマー、QuantiNOVA SYBR GREEN(Qiagen社製)を用いて、Rotor-Gene Q(Qiagen社製)でPCRを行った。
(10)PCRの結果は、Rotor Gene Q Pure Detection(Qiagen社製)を用い、Rps28及びCol1A1のmRNA発現量を解析した。解析は相対定量により行い、Rps28のmRNA発現量を内在性コントロールとしてmRNA量を補正した。
(11)各実施例及び各比較例の補正後のCol1A1遺伝子発現量について、補正後のコントロール(分化誘導をかけ、サンプルを加えていない群)の遺伝子発現量を1とした相対値を算出した。結果を図3に示す。
Claims (4)
- ケイ素含有量が質量基準で7,000ppm以上である、大麦の緑葉粉末。
- ケイ素含有量が質量基準で7,000ppm以上である大麦の緑葉粉末を含有する、経口用組成物。
- ケイ素含有量が質量基準で7,000ppm以上である大麦の緑葉粉末を含有する、青汁用の飲食用組成物。
- ケイ素含有量が質量基準で7,000ppm以上である大麦の緑葉粉末を含有する、ダイエット用組成物。
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