JP6829461B2

JP6829461B2 - 緑葉粉末及び組成物

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Publication number: JP6829461B2
Application number: JP2016252075A
Authority: JP
Inventors: 英樹田頭; 貴俊尾上; 高垣　欣也; 欣也高垣
Original assignee: Toyo Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Toyo Shinyaku Co Ltd
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2021-02-10
Anticipated expiration: 2036-12-26
Also published as: JP2018102202A

Description

本発明は、緑葉粉末及びそれを用いた組成物に関する。

従来、緑葉粉末を含む組成物は、青汁等の健康食品等として知られている。青汁等の原料としては、大麦、明日葉、ケール等の各種の植物が知られている（特許文献１）。

特開2004-298199号公報

健康食品等に用いる緑葉粉末については、需要者のニーズは近年多様化しており、更なる効果の向上を求める要求、特に健康や美容の観点における更なる効果の向上を求める要求がますます強くなっている。
しかしながら、従来の緑葉粉末やそれを含む組成物は、この要求に十分にこたえるものではなかった。

そこで、本発明者は、緑葉粉末及びそれを含む組成物について、健康や美容の観点から更なる作用強化が得られる構成について鋭意検討した。その結果、驚くべきことに、ケイ素含有量を一定以上含有する緑葉粉末及びそれを含む組成物は、筋芽細胞賦活効果、筋肉細胞分化促進効果、及び脂肪細胞分化抑制効果を奏し、筋肉組織の賦活及び増強、脂肪組織増加抑制並びにそれによる代謝促進や肥満の防止及び低減用途において有用でありうることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は上記の知見に基づくものであり、ケイ素含有量が質量基準で１，０００ｐｐｍ以上である経口用緑葉粉末を提供するものである。

また本発明は緑葉粉末を含有する青汁用の飲食用組成物であって、該粉末のケイ素含有量が質量基準で１，０００ｐｐｍ以上である青汁用の飲食用組成物を提供するものである。

また本発明は緑葉粉末を含有するダイエット用組成物であって、該粉末のケイ素含有量が質量基準で１，０００ｐｐｍ以上であるダイエット用組成物を提供するものである。

また本発明は緑葉粉末を含有する美容用組成物であって、該粉末のケイ素含有量が質量基準で１，０００ｐｐｍ以上である美容用組成物を提供するものである。

本発明によれば、筋芽細胞賦活効果、筋肉細胞分化促進効果及び脂肪細胞分化抑制効果を有し、筋肉増強や代謝促進、肥満の予防ないし低減等のダイエット効果に優れた緑葉粉末及びそれを用いた青汁用の飲食用組成物が提供される。また本発明によれば、筋芽細胞賦活効果、筋肉細胞分化促進効果及び脂肪細胞分化抑制効果に優れたダイエット用組成物を提供することができる。

図１は、実施例及び比較例の筋芽細胞賦活活性試験結果を示すグラフである。図２は、実施例及び比較例に係る、筋芽細胞におけるMyogenin遺伝子発現試験結果を示すグラフである。図３は、実施例及び比較例に係る、3T3-L1細胞の脂肪細胞分化誘導後におけるCol1A1遺伝子発現試験結果を示すグラフである。

以下、本発明の緑葉粉末及び組成物並びに該緑葉粉末の好適な製造方法について、その好ましい実施形態に基づいて説明する。本実施形態の緑葉粉末は、ケイ素含有量が質量基準で１，０００ｐｐｍ以上である経口用の緑葉粉末である。また本実施形態の組成物は、ケイ素含有量が質量基準で１，０００ｐｐｍ以上である緑葉粉末を含有するものである。以下、本実施形態の組成物という場合、青汁用の飲食用組成物、ダイエット用組成物及び美容用組成物のいずれにも当てはまる。

緑葉は、緑色植物の葉である。本実施形態の緑葉は、それ自体緑色をしているものである。緑色植物としては、飲食品用途に適するとともに、緑葉粉末に特定の高ケイ素含有量を与えうるものが選択される。この観点から、本実施形態において、緑色植物としては、麦類、イネ、あわ、笹、ひえ、きび、とうもろこし、ソルガム、さとうきびのようなイネ科植物が特に好ましく挙げられる。イネ科植物としては、特に筋肉細胞分化促進効果が高いことから、麦類が好ましい。麦類としては、大麦、小麦、えん麦、ライ麦、クマザサが好ましく挙げられ、ダイエット作用の点から大麦が最も好ましい。大麦としては、二条大麦、六条大麦、裸大麦などを特に制限なく用いることができる。

本実施形態において、緑葉とは、植物体の葉の部分だけではなく、葉とともに茎を含んでもよい。従って、緑葉粉末は、茎の粉末を含んでいてもよい。この場合、茎の粉末を含む緑葉粉末のケイ素含有量が質量基準で１，０００ｐｐｍ以上であることが示されれば、緑葉粉末のケイ素含有量が質量基準で１，０００ｐｐｍ以上であるとする。後述する好ましいケイ素含有量範囲についても同様である。なお、ここでいう茎は、脇芽を含んでいてもよい。

上述した通り、本実施形態における緑葉粉末は、質量基準で１，０００ｐｐｍ以上のケイ素を含有する。これにより、緑葉粉末は、筋芽細胞賦活効果、筋肉細胞分化促進効果及び脂肪細胞分化抑制効果が高いものである。また緑葉粉末のケイ素含有量は質量基準で１，０００，０００ｐｐｍ以下であることが、筋芽細胞賦活効果及び筋肉細胞分化促進効果、特に筋芽細胞賦活効果を高める点や、緑葉粉末の繊維量を低減して経口しやすいものとしやすい点から好ましい。これらの観点から、より好ましくは、緑葉粉末は質量基準で３，０００ｐｐｍ以上１００，０００ｐｐｍ以下のケイ素を含有し、更に好ましくは、質量基準で５，０００ｐｐｍ以上８０，０００ｐｐｍ以下のケイ素を含有し、とりわけ好ましくは、質量基準で７，０００ｐｐｍ以上５０，０００ｐｐｍ以下のケイ素を含有する。緑葉粉末のケイ素含有量は後述する実施例に記載の方法にて測定することができる。上記緑葉粉末のケイ素含有量を上記範囲とするためには、例えば、後述する好適な緑葉粉末の製造方法により緑葉粉末を製造すればよい。特に、その過程において、繊維を多く含む形態である粉砕末又は細片化物粉末を製造することで上記ケイ素含有量の緑葉粉末、特にケイ素を質量基準で７，０００ｐｐｍ以上含有する緑葉粉末を容易に得やすくなる。

本実施形態の緑葉粉末において、ケイ素は通常、二酸化ケイ素（シリカ）の形態で存在している。

緑葉粉末は水分量を２０質量％以下、特に１０質量％以下とすることが、安定性や品質劣化の防止等の観点から好ましい。水分量は例えば、１質量％以上であることが、緑葉粉末の製造容易性の点から好ましい。

緑葉粉末は、３０〜２５０メッシュの何れかのふるいを通過する粉末であることが、他の成分との混合のしやすさや経口しやすさ等の点で好ましい。同様の観点から、緑葉粉末は９０質量％以上が２００メッシュを通過することがより好ましい。

緑葉粉末としては、緑葉の各種の加工物を用いることができる。そのような加工物としては、例えば、緑葉に乾燥処理及び粉砕処理を施してなる乾燥粉砕末（単に「乾燥粉末」と呼ばれることもある）、緑葉に細片化処理を施してなる細片化物粉末、緑葉の搾汁を乾燥してなる搾汁粉末、緑葉のエキスを乾燥してなるエキス末等が挙げられるが、ケイ素含有量を上記の範囲としたものをより得やすくする点から、緑葉の乾燥粉砕末及び細片化物粉末が好ましく、製造の容易性や経口しやすさの点から緑葉の乾燥粉砕末が最も好ましい。緑葉粉末は粒状、顆粒状などを当然に含むものである。また、緑葉粉末は造粒物であってもよい。

上記の筋芽細胞賦活効果、筋肉細胞増殖促進効果及び脂肪細胞分化抑制効果を一層高める点から、本実施形態の組成物の固形分中、緑葉粉末の含有量は、乾燥質量で、５質量％以上が好ましく、１０質量％以上がより好ましく、１５質量％以上が更に好ましく、２０質量％以上が特に好ましい。また本実施形態の組成物は緑葉粉末のみからなるものであってもよいが、他成分との組み合わせで高機能化及び多機能化を図ることを可能する観点から、組成物中の緑葉粉末の上限値としては、９０質量％以下が好ましく、８５質量％以下がより好ましく、８０質量％以下が更に好ましい。

本実施形態の組成物は、特定のケイ素含有量を有する緑葉粉末以外に、その他の成分を含んでいてもよい。前記のその他の成分としては、例えば、ビタミン類、タンパク質、オリゴ糖、ミネラル類、乳製品、植物加工品、乳酸菌などの微生物、糖類、甘味料、クエン酸、酸味料、着色料、光沢剤のほか、タルク、セルロース、ステアリン酸カルシウム等の製造用剤等を配合することができる。その他の成分としては、これら以外にも、種々の賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤、増量剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などを挙げることができる。その他の成分の含有量は、組成物の形態等に応じて適宜選択することができる。本実施形態において、組成物に含まれる特定のケイ素含有量を有する緑葉粉末以外の成分は、固形分中、９０質量％以下であることが好ましく、８０質量％以下であることが特に好ましい。

本実施形態の組成物は、固体状、半固体状、流動体状等のいずれの形態であってもよい。例えば固体状としては、錠状、棒状、板状、ブロック状、固形状、丸状、飴状、タブレット状、グミ状、ウエハース状、ビスケット状、クッキー状、ケーキ状、チュアブル状、スティック状等が挙げられる。半固体状としては、ペースト状、ゼリー状、クリーム状、ゲル状等が挙げられる。流動体状としては、シロップ状、液状、クリーム状、ゲル状等が挙げられる。

本実施形態の青汁用の飲食用組成物について以下詳述する。青汁用の飲食用組成物とは、緑葉を各種加工物として含む飲料である。青汁用の飲食用組成物としては、この飲料、及びこの飲料を得るために液体に分散又は溶解させる固体が挙げられる。特に、組成物は、粉末状又は顆粒状であって、水と混合した混合物を経口摂取する形態であると、腐敗を防ぎ長期保存に適するとともに、この飲食用組成物が水と混合した時に色が鮮やかであることから好ましい。また組成物が固体状の形態である場合、上述したように、これを水と混合した液状体となし、該液状体を飲用する等経口摂取することができるが、摂取する者の好み等に応じて、固体のまま経口摂取してもよい。また水だけでなく、牛乳、豆乳、果汁飲料、乳清飲料、清涼飲料、ヨーグルト、ホットケーキミックス等に添加して使用してもよい。また、サプリメント、健康食品、栄養機能食品、機能性表示食品、特定保健用食品、及び医薬品として用いても良いことは言うまでもない。青汁用の飲食用組成物には、一般的に知られる青汁製品以外にスムージーなどが含まれる。

本実施形態のダイエット用組成物及び美容用組成物の形態は青汁用の飲食用組成物の例として挙げた飲料及びこの飲料を得るために液体に分散又は溶解させる固体の形態に限らず、任意の形態を採用できる。また本実施形態のダイエット用組成物及び美容用組成物についても、サプリメント、健康食品、栄養機能食品、機能性表示食品、特定保健用食品、及び医薬品として用いても良いことは言うまでもない。

以下、本実施形態の粉末の好適な製造方法について更に説明する。
本実施形態の製造方法は、火山灰土にてイネ科植物を栽培し、該イネ科植物の緑葉を粉末化するものである。
火山灰土は結晶質又は非晶質のケイ酸が多く含まれており植物へのケイ素供給力が高い。またイネ科植物はケイ素吸収性の高い植物である。このため、本実施形態の製造方法によれば、上記のケイ素含有量を含有する緑葉粉末を得やすいものとなる。火山灰土は一般に１０質量％以上、例えばＳｉＯ_２換算で２０〜５０質量％程度のケイ素を含有することが知られている。
火山灰土としては、黒ボク土、多湿黒ボク土、黒ボクグライ土が知られているが、黒ボク土がイネ科植物の生育の点から特に好ましい。黒ボク土は、母材である火山灰土と腐植で構成された黒色の土である。表層は腐植が多いため色は黒色又は黒褐色、下層は褐色となる。火山山麓の台地や平地でよく見られる。

黒ボク土は、通常知られている黒ボク土であれば特に限定されないが、例えば、主に火山灰土と腐葉土からなり、黒色に近い色をしており、ボクボクした感触（軽くてサラサラしている）の土であると知られている。また、黒ボク土は、赤土と比べると、有効態リン酸の含有量が小さく、Ｎ：Ｐ比が２〜５：１２〜１７程度である。したがって、イネ科植物を黒ボク土で栽培した場合、イネ科植物に対して過剰なリンの供給を回避できる。さらに、黒ボク土は、赤土より、陽イオン交換量が２倍程度多い。これにより、黒ボク土は、赤土と比較して、豊富な量の交換性石灰、交換性苦土及び交換性加里を含有する傾向にある。

本実施形態の製造方法は、火山灰土のみによりイネ科植物を栽培してもよいが、火山灰土以外の土、例えば、赤色土や黄色土等を一部含んでいてもよい。火山灰土と火山灰土以外の土との混合土により栽培する場合、火山灰土の割合は、使用する混合土の１００質量部に対して５０質量部以上であることが好ましく、７０質量部以上であることが好ましく、９０質量部以上であることがより好ましい。

栽培とは、当業界において通常知られる方法により大麦を種や苗などから葉や茎を収穫できる程度にまで生育させることであれば特に限定されず、使用する土以外の温度や湿度などの条件は当業者により適宜設定することができる。

採取するイネ科植物の緑葉は組成物の美観に影響することから、濃緑色であることが好ましい。具体的には、葉色スケールを用いた場合、１本のイネ科植物の葉の平均値が例えば４．０以上であり、好ましくは４．５以上である。

緑葉は、例えば麦類では、成熟期前、すなわち分けつ開始期から出穂開始前期に収穫されることが好ましい。緑葉は収穫後、直ちに処理されることが好ましい。処理までに時間を要する場合、緑葉の変質を防ぐために低温貯蔵などの当業者が通常用いる貯蔵手段により貯蔵される。

例えば、緑葉を乾燥粉末化するには従来公知の方法を用いることができる。そのような方法としては、緑葉に対して、乾燥処理及び粉砕処理を組み合わせた方法を用いることができる。乾燥処理及び粉砕処理はいずれを先に行ってもよいが、乾燥処理を先に行うことが好ましい。乾燥粉末化は、この方法に、更に必要に応じブランチング処理、殺菌処理などの処理から選ばれる１種又は２種以上の処理を組み合わせてもよい。また、粉砕処理を行う回数は１回でも、２回以上の処理を組合せてもよいが、粗粉砕処理を行った後に、より細かく粉砕する微粉砕処理を組合せることが好ましい。

ブランチング処理とは、緑葉の緑色を鮮やかに保つための処理であり、ブランチング処理の方法としては、熱水処理や蒸煮処理などが挙げられる。ブランチング処理は、８０〜１００℃、好ましくは９０〜１００℃の熱水または水蒸気中で、緑葉を６０〜１８０秒間、好ましくは９０〜１２０秒間処理することが好ましい。また、ブランチング処理として熱水処理を行う場合、熱水中に炭酸マグネシウムなどの炭酸塩や炭酸水素ナトリウムなどの炭酸水素塩を溶解させておくことで、緑葉の緑色をより鮮やかにすることができるため、好ましい。また、蒸煮処理としては、常圧または加圧下において、緑葉を水蒸気により蒸煮する処理と冷却する処理とを繰り返す間歇的蒸煮処理が好ましい。間歇的蒸煮処理において、水蒸気により蒸煮する処理は、好ましくは２０〜４０秒間、より好ましくは３０秒間行われる。蒸煮処理後の冷却処理は、直ちに行われることが好ましく、その方法は、特に制限しないが、冷水への浸漬、冷蔵、冷風による冷却、温風による気化冷却、温風と冷風を組み合わせた気化冷却などが用いられる。このうち温風と冷風を組み合わせた気化冷却が好ましい。このような冷却処理は、緑葉の品温が、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下、最も好ましくは４０℃以下となるように行われる。また、ビタミン、ミネラル、葉緑素などの栄養成分に富んだ緑葉の粉末を製造するためには、間歇的蒸煮処理を２〜５回繰り返すことが好ましい。

殺菌処理とは、通常、温度・圧力・電磁波・薬剤等を用いて物理的・化学的に微生物細胞を殺滅させる処理である。乾燥処理及び粉砕処理に追加してブランチング処理を行う場合、ブランチング処理は乾燥処理の前に行われることが好ましい。また乾燥処理及び粉砕処理に追加して殺菌処理を行う場合、殺菌処理は、乾燥処理の後か、粉砕処理の前又は後に行われることが好ましい。

乾燥処理としては、緑葉の水分含量が１０質量％以下、特に７質量％以下となるように乾燥する処理であることが好ましい。この乾燥処理は、例えば、熱風乾燥、高圧蒸気乾燥、電磁波乾燥、凍結乾燥などの当業者に公知の任意の方法により行われ得る。加熱による乾燥は、好ましくは４０℃〜１４０℃、より好ましくは８０〜１３０℃にて加温により緑葉が変色しない温度及び時間で行われうる。

粉砕処理としては、クラッシャー、ミル、ブレンダー、石臼などを用いて当業者が通常使用する任意の方法により粉砕する処理が挙げられる。粉砕された緑葉は必要に応じて篩にかけられる。

具体的な乾燥粉末化（粉砕末化）の方法としては、例えば、緑葉を切断した後、ブランチング処理を行い、次いで水分含量が１０質量％以下、好ましくは７質量％以下となるように乾燥し、その後粉砕する方法が挙げられる（特開２００４−０００２１０号公報を参照）。また例えば、緑葉を切断した後、ブランチング処理を行い、次いで揉捻し、その後、乾燥し、粉砕する方法（特開２００２−０６５２０４号公報、特許第３４２８９５６号公報を参照）も挙げられる。また例えば、緑葉を乾燥し、粗粉砕した後、１１０℃以上で加熱し、更に微粉砕する方法（特開２００３−０３３１５１号公報、特許第３２７７１８１号公報を参照）も挙げられる。

緑葉を細片化する方法としては、スライス、破砕、細断等、当業者が植物体を細片化する際に通常使用する方法を用いることができる。細片化の一例として、スラリー化してもよい。スラリー化は、大麦の緑葉をミキサー、ジューサー、ブレンダー、マスコロイダーなどにかけ、大麦の緑葉をどろどろした粥状（液体と固体の懸濁液）にすることにより行う。このようにスラリー化することにより、緑葉は、細片の８０質量％以上が好ましくは平均径１ｍｍ以下、より好ましくは０.５ｍｍ以下、一層好ましくは０.１ｍｍ以下、最も好ましくは０．０５ｍｍとなるように細片化され、流動性を有するようになる。

緑葉を搾汁する方法としては、緑葉又はその細片化物を圧搾するか、又は、大麦の緑葉の細片化物を遠心又はろ過する方法を挙げることができる。代表的な例としては、ミキサー、ジューサー等の機械的破砕手段によって搾汁し、必要に応じて、篩別、濾過等の手段によって粗固形分を除去することにより搾汁液を得る方法が挙げられる。具体的には、特開平０８−２４５４０８号公報、特開平０９−０４７２５２号公報、特開平５−７４７１号公報、特開平４−３４１１５３号公報などに記載の方法が挙げられ、これらの公知の方法を当業者が適宜選択して実施できる。

緑葉のエキスを得る方法としては、緑葉又はその細片化物に、エタノール、水、含水エタノールなどの当業者が通常用いる抽出溶媒を加え、必要に応じて攪拌や加温して抽出する方法を挙げることができる。抽出物は、必要に応じて濃縮してもよい。

本実施形態の緑葉粉末は後述する実施例に記載の通り、特定のケイ素含有量を有することにより、筋芽細胞賦活効果、筋芽細胞分化促進効果及び脂肪細胞分化抑制効果を奏する。具体的には、本実施形態の緑葉粉末及びそれを含む組成物を摂取することで、骨格筋等における筋芽細胞を活性化させ、且つ筋芽細胞の筋肉細胞への分化を促すことができ、また、繊維芽細胞等からの脂肪細胞の分化を抑制することができる。従って、本実施形態の組成物は、これを摂取することで筋肉増強促進や筋肉低減の防止を図り代謝を促進することができるため、脂肪組織低減促進や脂肪組織の増加防止を図ることができ、肥満の予防ないし低減を図ることができる。
従って、本実施形態の組成物は、筋芽細胞賦活用途、筋肉細胞増殖促進用途、脂肪細胞分化抑制用途、筋肉組織賦活用途、筋肉細胞増殖促進用途、筋肉量増加用途、脂肪組織低減用途、代謝促進用途、肥満の防止用途、肥満の予防用途、ダイエット用途、体脂肪低減用途等において、優れたものとなりうる。
また、本実施形態の組成物は、前記特定量以上のケイ素を含む緑葉粉末を含有することで、美容の向上にも有用であるものである。

以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
黒ボク土（推定でケイ素をＳｉＯ_２換算で３０質量％程度含有）の圃場に大麦の種を播種した。給水や雑草管理などの通常の植物栽培法により、大麦を栽培した。黒ボク土の土壌分析データの一例は表１のとおりである。
大麦から、出穂前における大麦の茎を含む緑葉を刈り取った。これを水洗いし、付着した泥などを除去し、５〜１０ｃｍ程度の大きさに切断する前処理を行った。前処理した緑葉を、９０〜１００℃の熱湯で９０秒間〜１２０秒間、１回のみブランチング処理し、その後、冷水で冷却した。続いて、得られた緑葉を、水分量が１０質量％以下となるまで、乾燥機中で、２０分間〜１８０分間、８０℃〜１３０℃の温風にて乾燥させた。乾燥した緑葉を約１ｍｍの大きさに粗粉砕処理した。得られた大麦の緑葉を、２００メッシュ区分を９０質量％以上が通過するように微粉砕処理し、大麦茎葉の乾燥粉末（粉砕末）試料を得た。緑葉の粉末試料は、２００メッシュを通過するものが９０質量％以上であり、水分量が１質量％以上７質量％以下であった。

［実施例２］
各種クマザサ粉砕末を、ケイ素含有量に基づいてスクリーニングを行い、ケイ素含有量が３４，９００ｐｐｍのものを用いた。

［実施例３］
各種大麦緑葉粉砕末を、ケイ素含有量に基づいてスクリーニングを行い、ケイ素含有量が５，６５０ｐｐｍのものを用いた。

［比較例１］
市販の明日葉の粉砕末を用いた。

［比較例２］
実施例１と同様にしてケールを栽培し、得られた茎を含む葉を実施例１と同様に処理することで、緑葉の乾燥粉末試料を得た。緑葉の粉末試料は、２００メッシュを通過するものが９０質量％以上であった。

＜ケイ素含有量の測定＞
得られた粉末のケイ素含有量はICP発光分析法（一般財団法人日本食品分析センターにて測定）を用いて測定を行った。結果を表２に示す。

実施例１〜３並びに比較例１の粉末を、下記（１）〜（７）の手順の筋細胞賦活試験に供した。
［筋細胞賦活試験］
（１）マウス骨格筋由来筋芽細胞（品名Ｃ２Ｃ１２、理化学研究所バイオリソースセンター製）を37℃、5 %CO₂インキュベーター内で、10vol％FBS-DMEM培地を入れた７５cm²フラスコを用いて、培養した。
（２）（１）の培養後、トリプシン処理により浮遊させた細胞を７５cm²フラスコから回収し、細胞数を計測した後、コラーゲンコートした96 well plateにおける各wellに、4000cells/wellの細胞密度にて培地ごと播種した後、３７℃、５％CO₂インキュベーター内で24時間前培養した。
（３）（１）及び（２）とは別に、実施例１〜３並びに比較例１の粉末をそれぞれ、１０容量％FBS-DMEM培地に500μg/ml濃度となるように分散又は溶解させた液を調製し、これを0.2μmフィルター(アドバンテック製)を用いてフィルター滅菌したものをサンプル液とした。コントロールとしては、10vol％FBS-DMEM培地そのものをサンプル液として用いた。
（４）各wellより培地を除去後、（３）で調製したサンプル液を各wellにそれぞれ200μＬずつ添加し、37℃、5%CO₂インキュベーター内で24時間培養した。
（５）（４）の培養後、培地を除去した後、各wellをＰＢＳ２００μＬ／wellで１回洗浄した。次いで、無血清ＤＭＥＭで３０倍に希釈したＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８溶液（同仁化学社）１５０μＬ／wellを添加した。
（６）（５）の溶液添加後のplateを３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内に静置して適度に発色させた後、各wellの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られたデータを元に、コントロールに対する細胞数の割合(% of control)を下記式に基づいて算出し、これを筋芽細胞賦活活性とした。
% of control=(Data sample - Data blank)/(Data control - Data blank)×100
Data sample:実施例１〜３並びに比較例１の吸光度
Data control:controlの吸光度
Data blank:細胞がないときのブランク

（７）評価
コントロールを１００％として、実施例１〜３並びに比較例１の細胞数の割合の算出結果をまとめたものを図１に示す。

図１に示すように、各実施例の粉末によれば、筋細胞の賦活効果が得られた。特に大麦緑葉粉末の筋細胞賦活効果は高かった。これに対し、各比較例では筋細胞の賦活効果が低いものであった。

次いで、実施例１〜３並びに比較例１及び２の粉末を、下記（a）〜（ｆ）の手順により、筋芽細胞の分化マーカーであるMyogenin遺伝子発現試験に供した。

［Myogenin遺伝子発現試験］
（a）マウス骨格筋由来筋芽細胞（品名Ｃ２Ｃ１２、理化学研究所バイオリソースセンター製）を37℃、5 %CO₂インキュベーター内で、10vol％FBS-DMEM培地を入れた７５cm²フラスコを用いて、培養した。
（b）（a）の培養後、トリプシン処理により浮遊させた細胞を７５cm²フラスコから回収し、細胞数を計測した後、コラーゲンコートした24well plateにおける各wellに、2×10⁴cells/wellの細胞密度にて培地ごと播種した後、37℃、5 %CO₂インキュベーター内で、96時間前培養した。
（c）（a）及び（b）とは別に、実施例１〜３並びに比較例１及び２の粉末をそれぞれ、10vol%FBS-DMEM培地に、1000μg/ml濃度となるように分散又は溶解させた液を調製し、これを0.2μmフィルター（アドバンテック）を用いてフィルター滅菌したものをサンプル液とした。コントロールとしては、10vol%FBS-DMEM培地そのものをサンプル液とした。
（ｄ）各wellより培地を除去後、（ｃ）で調製したサンプル液を各wellにそれぞれ500μＬ添加し、37℃、5%CO₂インキュベーター内で24時間培養した。
（e）（ｄ）の培養後、各wellをＰＢＳ５００μＬ／wellで２回洗浄した。次いでRNeasy Mini Kit 250（QIAGEN製）を用いてｍRNAを回収した。得られたｍRNAを鋳型とし、 ReverTra Ace（登録商標） qPCR RT Master Mixwith gDNA Remover（東洋紡製）を用いてｃDNAを合成した。
（ｆ）（e）で得られたｃDNAを鋳型として、下記のプライマー（QIAGEN製）を用いて、QuantiNova SYBR Green PCR Kit(QIAGEN製)により定量リアルタイムPCRを行い、Gapdh及びMyogeninのmRNA発現量を測定した。
Gapdh:Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay (QT01658692)
Myog:Mm_Myog_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00112378)

解析は相対定量により行い、GapdhのmRNA発現量を内在性コントロールとしてmRNA量を補正した。）各実施例及び各比較例の補正後のMyogenin遺伝子発現量について、補正後のコントロール（分化誘導をかけ、サンプルを加えていない群）の遺伝子発現量を1とした相対値を算出した。結果を図２に示す。

図２に示すように、各実施例の粉末により、筋芽細胞におけるMyogenin遺伝子発現向上効果が得られた。特に大麦緑葉粉末の発現向上効果は高かった。これに対し、各比較例では筋芽細胞のMyogenin遺伝子発現が低いものであった。

次いで、実施例１〜３並びに比較例１及び２の粉末を、下記（1）〜（11）の手順により脂肪細胞の分化抑制試験に供した。
［3T3-L1細胞における遺伝子発現による脂肪細胞の分化抑制試験］
（１）マウス繊維芽細胞3T3-L1（理化学研究所バイオリソースセンター）を10vol%FBS-DMEM培地を入れた７５cm²フラスコを用いて、所定の数になるまで、5%CO₂インキュベーター内で、37℃、湿潤条件で培養した。
（２）（１）のフラスコから培地を取り除き、DPBS（ナカライテスク社製）で3度洗浄した後、トリプシン処理により細胞を剥離した。
（３）新鮮な10vol%FBS-DMEM培地を加えてトリプシン反応を停止した後、細胞をチューブへ集め、遠心機で800rpm、3分遠心して細胞を沈殿させた。
（４）2×10⁵cells/mLになるように新鮮な10vol%FBS-DMEM培地に細胞を懸濁し、96 well plateに100μLずつ播種して、2日間、5%CO₂インキュベーター内で、37℃、湿潤条件で前培養した。
（５）（１）〜（４）とは別に、IBMX（和光純薬社製）を0.5M、Dexamethasone（和光純薬社製）を1mMになるようにDMSOに溶解した。10vol%FBS−DMEM培地に前記で調製した0.5M IBMX及び1mM Dexamethasone並びに10mg/mL インスリン溶液（Sigma Aldrich社製）をそれぞれ終濃度が0.5mM、1μM、10μg/mLになるように添加して試験培地を調製した。実施例１〜３並びに比較例１及び２の粉末をそれぞれ、該試験培地に、10mg/mlとなるように分散又は溶解させた液を調製し、これを0.2μmフィルター（アドバンテック）を用いてフィルター滅菌したものをサンプル液とした。コントロールとしては、試験培地そのものをサンプル液とした。
（６）（４）で前培養した3T3-L1細胞から培地を除き、（５）で調製したサンプル液を各wellにそれぞれ100μLずつ添加し、1日間、5%CO₂インキュベーター内で、37℃、湿潤条件で培養した。
（７）24時間後、各wellより培地を除き、細胞からRneasy mini（Qiagen社製）でRNAを精製した。
（８）精製したRNAより、ReverTra Ace（登録商標） qPCR RT Master Mix with gDNA Rem
over（東洋紡製）でcDNAを合成した。
（９）（８）で得られたｃDNAを鋳型として、内部標準としてRps28（Mm_Rps28_1_SG QuantiTect Primer Assay、Qiagen社製）のプライマー、測定遺伝子としてCol1A1（Mm_Col1a1_1_SG QuantiTect primer assay、Qiagen社製）のプライマー、QuantiNOVA SYBR GREEN（Qiagen社製）を用いて、Rotor-Gene Q（Qiagen社製）でPCRを行った。
（１０）PCRの結果は、Rotor Gene Q Pure Detection（Qiagen社製）を用い、Rps28及びCol1A1のmRNA発現量を解析した。解析は相対定量により行い、Rps28のmRNA発現量を内在性コントロールとしてmRNA量を補正した。
（１１）各実施例及び各比較例の補正後のCol1A1遺伝子発現量について、補正後のコントロール（分化誘導をかけ、サンプルを加えていない群）の遺伝子発現量を1とした相対値を算出した。結果を図３に示す。

図３に示すように、各実施例の緑葉粉末の存在下において、繊維芽細胞3T3-L1細胞を脂肪細胞へ分化誘導処理した場合、誘導処理後の繊維芽細胞3T3-L1においてCol1A1遺伝子発現向上効果が得られた。特に大麦緑葉粉末の発現向上効果は高かった。これに対し、各比較例では脂肪細胞の分化誘導後のCol1A1遺伝子発現が低いものであった。Col1A1遺伝子は繊維芽細胞マーカーであり、繊維芽細胞3T3-L1を脂肪細胞に分化誘導すると、ごく初期にCol1A1遺伝子の遺伝子発現量が激減してしまうことが知られている。従って、Col1A1遺伝子が大きいことは、脂肪細胞への分化が抑制されていることを示す。本試験により、本願発明の緑葉粉末により、繊維芽細胞からの脂肪細胞への分化が効果的に抑制されることが示された。

Claims

ケイ素含有量が質量基準で７，０００ｐｐｍ以上である、大麦の緑葉粉末。
ケイ素含有量が質量基準で７，０００ｐｐｍ以上である大麦の緑葉粉末を含有する、経口用組成物。
ケイ素含有量が質量基準で７，０００ｐｐｍ以上である大麦の緑葉粉末を含有する、青汁用の飲食用組成物。
ケイ素含有量が質量基準で７，０００ｐｐｍ以上である大麦の緑葉粉末を含有する、ダイエット用組成物。